ヒトの血液脳脊髄液関門の脈絡叢上皮細胞ベースのモデルは、基底外側からの細菌感染症を研究するために、

サマリー

脈絡叢の上皮細胞は、血液脳脊髄液関門(BCSFB)を形成します。BCSFBのin vitroモデルは、ヒト脈絡叢乳頭腫(HIBCPP)細胞を採用しています。本稿では、細胞培養フィルターインサートシステムを用いたHIBCPP細胞の培養および基底側感染について述べます。

要約

脳の心室系に位置する脈絡叢(CP)の上皮細胞は、血液脳脊髄液関門(BCSFB)を形成します。BCSFBは、脳脊髄液(CSF)を血液から分離し、分子交換を最小限に制限する機能を持っています。BCSFBのin vitroモデルは、ヒト脈絡叢乳頭腫(HIBCPP)に由来する細胞に基づいています。HIBCPP細胞は、タイトジャンクション(TJ)の形成、経上皮電気抵抗(TEER)の発生、高分子のわずかな透過性など、典型的なバリア機能を示します。BCSFBを介して中枢神経系(CNS)に侵入し、その後髄膜炎などの重篤な疾患を引き起こす可能性のある病原体がいくつかあります。これらの病原体の1つは、ヒト特異的な細菌であるNeisseria meningitidis (N. meningitidis)です。HIBCPP細胞を倒立型細胞培養フィルターインサートシステムで使用することで、病原体とBCSFBの細胞との相互作用を基底外側細胞側から研究することができ、これはin vivoで関連性があります。本稿では、HIBCPP細胞を細胞培養インサート上に播種し、培養する様子について述べます。さらに、N. meningitidis による細胞への感染と、侵入および付着した細菌の二重免疫蛍光法による分析が実証されています。CPの細胞は、アルツハイマー病や多発性硬化症などの神経変性疾患や、腫瘍細胞の脳転移など、他の疾患にも関与しているため、このモデルシステムは他の研究分野にも応用できます。これは、分子メカニズムを解読し、新しい治療標的を特定する可能性を提供します。

概要

血液脳脊髄液関門（BCSFB）は、血液と脳の¹の間に3つのバリアサイトの一つです。その形態学的相関脈絡叢^{（CP）2,3、}強く脳室に血管新生および配置されている内皮上皮回旋の上皮細胞です。 CPは、脳脊髄液（CSF）を生成するだけでなく、血液から後者を分離するのに役立ちます。バリア機能を実現するために、CP上皮細胞は、低飲作用活性を示す特定のトランスポーターを発現し、そして密に密着結合（の^TJ）2,3の連続的なネットワークで接続されています。

日本人女性⁴の悪性脈絡叢乳頭腫由来のヒト脈絡叢乳頭腫（HIBCPP）細胞は、BCSFBのインビトロモデルで機能を構築するために使用しました。 HIBCPP細胞は、TJの形成などの機能BCSFBの特性のいくつかを示してストランド、経上皮電気抵抗（TEER）のように決定することができる高い経上皮膜電位の開発、および高分子のマイナー透過性。また、HIBCPP細胞は、イオン性微小環境を調節するために機能し、基底外側/アピカル極性^5,6,7を示すことが特徴的なトランスポーターを発現します。

BCSFBは、中枢神経系^（CNS）8への病原体（細菌、ウイルス、および真菌）のための侵入部位として機能することが示されています。 髄膜炎菌 （ 髄膜炎菌 ）、グラム陰性菌、などの病原体の侵入は、髄膜炎などの重篤な病気を引き起こす可能性があります。 それはCPの保護上皮バリアを克服したという証拠は、血管およびCP上皮細胞^9,10で髄膜炎菌の増加量を示す髄膜炎菌性疾患を有する患者における組織病 ​​理学的観察によってサポートされています。宿主細胞のBAへの参入を得るために、cteriaは、多くの場合、宿主細胞上にある特定の表面受容体によって媒介またはトリガされるエンドサイトーシス機構を乗っ取ります。これらの受容体と病原体の相互作用は¹¹種特異的であることができるので、動物モデルにのみ制限された範囲に相談することができます。 HIBCPP細胞株は、浸潤プロセスならびにヒトモデル系において根底にある分子メカニズムを研究する機会を提供します。細胞培養インサートを採用するには、2つのセルの側面から宿主細胞と病原体の相互作用を分析することを可能にしています。 N.含む多くの細菌、 髄膜炎菌は 、感染アッセイ中の重力の影響を強く受けます。アッセイ中HIBCPP細胞と病原体の最適な相互作用のために、細菌は、最初に細胞培養フィルターインサートシステムの上部コンパートメントに追加されます。それぞれ、頂端または側底細胞側からの感染を有効にするには、in vitroの系の2つのバリエーションは、ESTAされていますblished：標準システムではHIBCPP細胞は微生物がCSF-側に位置し、細胞（ 図1A、C）の頂端側と接触するように取得されたときの状況を模倣し、フィルタインサートの上部コンパートメントに播種します。対照的に、反転細胞培養フィルターインサートシステムにおいてHIBCPP細胞を使用して細菌が血流に入っている状態を反映しています。微生物は、側底側からの血液との出会いCP上皮細胞（ 図1B、D）に広めます。注目すべきは、このモデル系では、細菌は、基底細胞の側^5,7から特に極性様式でHIBCPP細胞に侵入することが示されています。

続いてCPの感染、侵入する病原体パターン認識受容体（PRRは）への連結を介して自然免疫系によって認識され得ます。 PRRのよく説明メンバーは、Toll様受容体（TLR）ファミリーに属します。 TLRは缶ビン病原体関連分子パターン（PAMP）と呼ばれている感染性微生物の特徴構成に、D。受容体のライゲーションは、次にBCSFB ^13,14を横切って免疫細胞の遊出を促進するサイトカインおよびケモカイン¹²の発現を誘発する宿主細胞のシグナル伝達カスケードの活性化をもたらします。 HIBCPP細胞は、mRNAレベルでいくつかのTLRを発現することが示され、N.とその感染されています髄膜炎菌は CXCL1-3、IL6、IL8および^TNFα15,16を含むいくつかのサイトカインおよびケモカインの分泌をもたらします。

ここでは、BCSFBを模倣反転細胞培養インサートシステムで栽培し、ヒト細胞株HIBCPPの感染を記述しています。このモデルシステムは、生体内の関連する側底細胞側だけでなく、その後の細胞応答と病原体の相互作用を研究することができます。

プロトコル

1.倒立モデル系で播種HIBCPP細胞のための細胞培養フィルターインサートを準備します

1. 前加温DMEM / F12（ハム）を5μg/ mlのインスリン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FCS）を補充しました。
2. 逆さまに12ウェルプレート（ 図1E）に3ミクロンの細孔サイズで0.33 cm 2の成長領域の細胞培養フィルターインサートを配置するために滅菌ピンセットを使用してください。
3. 細胞培養フィルターインサートの下の区画（約3ml）およびフィルターインサートの上に100μlのにメディアを埋めます。プレートだけでなく、媒体と​​下の区画をあふれさせます。フィルタインサートの下の区画が（ 図1E）満たされたままになるように、過剰な培地を吸引除去します。
   注：このステップのための血清学的ピペットを使用することをお勧めします。
4. 蓋で12ウェルプレートをカバーし、インキュベーターに調製した細胞培養用フィルタインサートを転送する、37°C細胞を添加するまで5％CO _2。

2.栽培とHIBCPP細胞の継代

1. 5μg/ mlの、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび10％FCSを補充したDMEM / F12（ハム）を準備します。
2. 37℃の水槽で予備暖かい媒体とPBS。フラスコから培地を吸引。フラスコやスワールに10mlのPBSを追加します。一度、この手順を繰り返します。
3. フラスコやスワールに3ミリリットル0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 、インキュベーターに37℃、5％CO _2を配置_します 。
4. 約20分後、インキュベーターからフラスコを取り外します。細胞がフラスコの底から切り離されていることを確認し、顕微鏡で調査したときに円形が表示されます。
   注：細胞は、互いから完全に切り離しておらず、しばしば凝集体中に見出されます。通路38までのセルを使用することをお勧めします。
5. トリプシン処理を停止するには17ミリリットル培地を追加します。上下にピペッティングすることにより細胞を再懸濁し、懸濁液を移します50ミリリットルチューブに。室温で10分間、50×gで遠心分離します。
6. 媒体の適切な量で細胞を再懸濁し、血球計数器を使用して細胞を数えます。
   注：再懸濁HIBCPP細胞の濃度が1×10 ⁶細胞/ mlであるべきです。 HIBCPP細胞の維持のために、T75フラスコに10 mlの培地中に1-6×10 ⁶細胞の量を転送するために提案されています。一日おきに培地に変更します。

HIBCPP細胞と3シード反転細胞培養フィルターインサート

1. （フィルタの底部側すなわち ）それぞれの逆フィルタインサートの上に細胞懸濁液（ すなわち 8×10 ⁴細胞）（ 図1E）の80μlを添加します。
   注：細胞が均等に播種する前にチューブを反転させることによって懸濁液中に分散されていることを確認します。
2. インキュベーターに12ウェルプレート及び転写の蓋、37°C​​、5％Cを播種した細胞培養用フィルタインサートをカバーO _2。
3. 初日に、24ウェルプレートのウェルに1ミリリットル培地を埋めます。 12ウェルプレートのうち、鉗子を用いて、細胞培養フィルターインサートを持ち上げ、内側の媒体を破棄し、フィルターインサートをオンにして調製した24ウェルプレート（ 図1E）に標準的な向きに配置します。
4. 二日毎に新鮮な培地に細胞を配置します。新鮮な培地で24ウェルを準備し、それにフィルターインサートを移します。 0.5ミリリットルの新鮮な培地とインサートを記入してください。セクション4で説明したように、毎日TEERを確認してください。
5. HIBCPPのTEER値は、細胞培養インサート上で細胞を播種すると70Ωのx cm 2で（約4日播種後）を超え、その後、1％FCSおよび5μg/ mlのインスリンを含有する培地中で細胞培養を続けます。各ウェルのための培地1ミリリットルで24ウェルプレートを準備します。上部コンパートメントに準備したウェルと交換媒体にフィルターインサートを転送します。
   注：この血清除去を密集度は、の形成につながる後高い膜電位。
6. フィルタ区画から培地を吸引は、よく準備に転送し、500μlの培地で埋めます。一度、この手順を繰り返します。 、インキュベーターに一晩、37℃、5％CO _2をセルに入れてください。

経上皮電気抵抗の4測定（TEER）

1. 80％エタノール中で15分間、上皮組織voltohmmeterの電極チップを浸し。ボンネットの下voltohmmeterを移し、一瞬電極乾燥させます。平衡化するための別の15分間の細胞のために使用されるそれぞれの培養液中に電極を配置します。
2. それは毎回下部コンパートメントの底に接するように電極の長いアームを配置することによって測定を行う、フィルターインサート区画に短い腕を置きます。
   注： - ブランク値（Ω））×フィルタ培地中で細胞を含まない細胞培養フィルターインサートの抵抗値はブランク値（（実測値（Ω）として使用されるべきです表面（ すなわち 0.33 cm 2で））。
3. 15分間80％エタノールに電極背面場を測定した後。ドライチューブ内に保管してください。

傍細胞透過性の5決意

1. 5μg/ mlのインスリン、1％FCSを補充した200mLの培養培地中で1gのFITC-イヌリンを溶解します。細胞の感染前に、上部フィルタ室への溶液の50μg/ mlのを適用します。
2. 感染後多くのイヌリンは、細胞層を介してフィルタ区画から渡される方法を決定するために、下の井戸から培地サンプルを収集。
3. FITC-イヌリン標準液を調製し、1行う：2希釈、10倍（100％、50％、25％、12.5％、6.25％3.13％1.56％0.78％0.39％、0.2％及び0％）の。マイクロプレートリーダー内のすべてのサンプルを測定することにより蛍光を決定します。

細胞培養フィルターインサート上HIBCPP細胞の感染のための細菌の6.準備

1. 実験前にある日、こすりトン彼冷凍N.髄膜炎菌は Vitoxとチョコレート寒天上でグリセロールストックと連勝をオフ株。 5％CO ₂で、37℃で、インキュベーター中で一晩成長します。
2. 一晩培養物から20〜30コロニーを抽出し、0.042パーセントのNaHCO _3、0.01 MのMgCl ₂および1％Polyvitexを補っ8ミリリットルプロテオースペプトン培地を含むチューブに移します。
3. 220rpmで、37℃で1.25時間、細菌を振ります。室温で10分間2,684 gでの遠心分離によって細菌をペレット。上清を捨て、8ミリリットルの無血清培地で細菌ペレットを再懸濁します。でも、サスペンションを確保するための渦。
4. 培養密度を決定するために、600nmでの光学密度（OD）で1：10の希釈を測定します。 OD 0.1の₆₀₀に細菌懸濁液を調整します。
   注：この懸濁液を約含まれています。 1×10 ⁸ CFU / mlです。
5. 細菌細胞濃度を確認するAまで懸濁液を段階的（1:10）希釈しますチョコレート寒天プレート上に10 ^-5の希釈およびプレート。
   注：同様の連続希釈は、細菌増殖曲線を計算するために実行される必要があります。

二重免疫による細菌の侵入の細胞培養フィルターインサートと決意にHIBCPP細胞の7感染

1. 1％FCSおよび5μg/ mlのインスリンを含有する培地中で細胞培養を継続した後、上皮組織voltohmmeterを使用して毎日細胞を測定します。細胞は約500Ωのx cm 2でのTEERに達した場合は、感染を行います。
2. 指定された時間が経過し、5％CO ₂で、37℃で、10店の感染多重度で準備された細菌懸濁液（MOI）で細胞インキュベーターで感染細胞に感染します。
   注：MOIがコンフルエンス（1.21×10 ⁶細胞/ cm ^2）で考慮細胞培養フィルターインサートあたりの細胞数を取ることによって計算することができます。
3. 未感染を停止1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する500μlの無血清培地で3回洗浄することによってイオン（SFM）は、下部コンパートメントに、フィルタ室1 mlで適用しました。
4. 非特異的結合部位に対する抗体の付着を防止するために、1％BSAフィルタ室のバッファと、室温で20分間、下部コンパートメント1 mlを含む500μlのSFMでブロック。
5. 100μlの一次抗体抗Nでインキュベートフィルタコンパートメント内、室温で20分間、下の区画で500μlの：meningtidisα-OMP（200 1）。
   注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。
6. フィルタ区画から培地を吸引して細胞を洗浄し、1％BSAを含有する調製ウェル1 mLのSFMにフィルタインサートを転送し、1％BSAを含有する500μlのSFMで空にフィルタ室を満たします。二回、この手順を繰り返します。
7. フィルタのコンパに500μlの4％ホルムアルデヒドで細胞を固定してくださいrtment、室温で10分間、下部コンパートメント1 mlです。
8. フィルタ区画から培地を吸引して細胞を洗浄し、1mlのPBSでよく準備し、500μlのPBSで空にフィルタ室を埋めるために、フィルタインサートを移します。一度、この手順を繰り返します。
   注：サンプルを4℃でPBS中に一晩保存することができます。
9. 切断インサートの外細胞培養フィルターを固定し、250μlのPBS、1％BSAを含有する洗浄します。細胞外細菌を染色するために：標識された250μlの蛍光（励起波長594 nm）を二次抗体ニワトリ抗ウサギ（500 1）を用いて室温で15分間、細胞をインキュベートします。
   注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。
10. 250μlのPBSを室温で1時間、1％BSAおよび0.5％トリトンX-100を含有する細胞透過性。 250μlのPBS、1％BSAを含有する細胞を3回洗浄します。
11. 250μlの一次抗体抗Nでインキュベート髄膜炎菌 のα-OMP（1：200）、細胞外および細胞内細菌を染色する30分間。 250μlのPBS、1％BSAを含有する細胞を3回洗浄します。
12. （1：500）、蛍光標識した（励起波長660 nm）をファロイジン（1：250）および4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）（蛍光標識を250μl（励起波長488 nm）を二次抗体を適用します。 1：50,000）を室温で1時間細胞外および細胞内細菌、アクチン細胞骨格と核を染色しました。
    注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。
13. 250μlのPBS、1％BSAを含有する細胞を3回洗浄します。顕微鏡を介して、検査まで4℃でメディアや店舗を実装する際に細胞を埋め込みます。
14. 事前に定義されたフィールドごとに侵入した細菌の数を決定します。フィルター膜当たり20フィールドをカウントすることによってこれを行います。侵入した細菌の割合を計算します。
    注：エリアcoefficと20の顕微鏡視野の平均細菌数を掛けient。結果は、0.33 cm 2の細胞培養フィルターインサート中に存在する全細菌の量を表します。感染期間中に培地中で増殖させた細菌の量によって、この値を割ります。

結果

ここでは、反転し、細胞培養インサートシステムでHIBCPP細胞の培養および感染を説明します。このモデルは、私たちは（ 図1）を普及し、血流を介して上皮細胞に侵入する細菌の生理学的状況を再現、側底細胞側から侵入メカニズムとその下にある分子のシグナル伝達経路を研究することができます。

HIBCPP細胞は最低レベルに分子交換を制限することを可能に特定のバリア機能を、表示します。これは、接着結合（AJ）とタイトジャンクショ​​ン（TJ）タンパク質の発現によって達成されます。 TJ関連タンパク質オクルディン、クローディンおよびZO-1の免疫蛍光分析は、細胞がのTJの連続ストランド（ 図2A、B、C）によって相互接続されていることを実証し、細胞-細胞接触の部位に中断されないシグナルを明らかにしました。トンの詳細な印象彼TJの形態は、送信（ 図2D）によって得られ...

ディスカッション

CPの上皮細胞は、血液^2,3からCSFを分離BCSFBを形成します。我々は最近、BCSFBの機能性ヒトモデルとしてHIBCPP細胞株を確立しました。細胞は、高い膜電位の開発、巨大分子のための低透過性、ならびにのTJ ⁵の連続ストランドの存在を含むin vitroでの BCSFBの重要なバリア機能を表示します。 TJ蛋白質は、細胞の基底外側/頂端の極性に寄与する。極性は、表面受容体ならびに特定のトランスポータータンパク質の指向局在のため非常に重要です。私たちは、極性受容体ECADおよびMetの局在ならびにCNS ^6,7内の高度に制御された微小環境を維持し、ATP結合カセット（ABC）トランスポーターファミリーのメンバーを示しています。

いくつかのBCSFBを克服することによって、CNSへのエントリーを獲得することができます微生物、最先端レベルがあります。髄膜炎⁸を含む重篤な疾患にグラム。 CP上皮細胞に侵入することが可能な病原体の一つは、ヒト特異的グラム陰性菌N

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA	Gibco	25200-056
4´,6 ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)	Life Technologies	D1306
12-well plates	Starlab	CC7682-7512
24-well plates	Starlab	CC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMP			この抗体は、H. Claus博士とU. Vogel博士(University of WüRzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (ニワトリ抗ウサギ)	Invitrogen	A21441
Alexa Fluor 594 (ニワトリ抗ウサギ)	Invitrogen	A21442
Alexa Fluor 660 Phalloidin	Invitrogen	A22285
ウシ血清アルブミン (BSA)	Calbiochem	12659
チョコレート寒天プレート	Biomerieux	43109
サイトカラシン D	Sigma	C8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES	Gibco	31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o フェノール	Gibco	11039-047
ジメチルスルホキシ		Sigma D2650
子牛胎児血清 (FCS)	Life Technologies	10270106
FITC-イヌリン	シグマ	F3272
インスリン	シグマ	19278
MgCl2	Sigma	2393
NaHCO3	Sigma	55761
PBS + Mg + Ca	Gibco	14040-174
ペニシリン/ストレプトマイシン	MP バイオメディカル	1670049
ポリビテックス	Biomerieux	55651
プロテオースペプトン	BD	211684
無血清培地	Gibco	10902-096
24 ウェルプレート用 Thincert 細胞培養インサート、細孔サイズ 3 & マイクロ;m	Greiner	662630
組織培養フラスコ 75 cm² 赤いキャップ 滅菌	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma	T8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode	Millipore	MERSSTX00