方法論記事

ヒトの血液脳脊髄液関門の脈絡叢上皮細胞ベースのモデルは、基底外側からの細菌感染症を研究するために、

DOI：

10.3791/54061

⸱

2016年5月6日

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1Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of NDU Life Sciences, Nippon Dental University

この記事について

サマリー

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脈絡叢の上皮細胞は、血液脳脊髄液関門(BCSFB)を形成します。BCSFBのin vitroモデルは、ヒト脈絡叢乳頭腫(HIBCPP)細胞を採用しています。本稿では、細胞培養フィルターインサートシステムを用いたHIBCPP細胞の培養および基底側感染について述べます。

要約

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脳の心室系に位置する脈絡叢(CP)の上皮細胞は、血液脳脊髄液関門(BCSFB)を形成します。BCSFBは、脳脊髄液(CSF)を血液から分離し、分子交換を最小限に制限する機能を持っています。BCSFBのin vitroモデルは、ヒト脈絡叢乳頭腫(HIBCPP)に由来する細胞に基づいています。HIBCPP細胞は、タイトジャンクション(TJ)の形成、経上皮電気抵抗(TEER)の発生、高分子のわずかな透過性など、典型的なバリア機能を示します。BCSFBを介して中枢神経系(CNS)に侵入し、その後髄膜炎などの重篤な疾患を引き起こす可能性のある病原体がいくつかあります。これらの病原体の1つは、ヒト特異的な細菌であるNeisseria meningitidis (N. meningitidis)です。HIBCPP細胞を倒立型細胞培養フィルターインサートシステムで使用することで、病原体とBCSFBの細胞との相互作用を基底外側細胞側から研究することができ、これはin vivoで関連性があります。本稿では、HIBCPP細胞を細胞培養インサート上に播種し、培養する様子について述べます。さらに、N. meningitidis による細胞への感染と、侵入および付着した細菌の二重免疫蛍光法による分析が実証されています。CPの細胞は、アルツハイマー病や多発性硬化症などの神経変性疾患や、腫瘍細胞の脳転移など、他の疾患にも関与しているため、このモデルシステムは他の研究分野にも応用できます。これは、分子メカニズムを解読し、新しい治療標的を特定する可能性を提供します。

概要

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血液脳脊髄液関門（BCSFB）は、血液と脳の1の間に3つのバリアサイトの一つです。その形態学的相関脈絡叢（CP）2,3、強く脳室に血管新生および配置されている内皮上皮回旋の上皮細胞です。 CPは、脳脊髄液（CSF）を生成するだけでなく、血液から後者を分離するのに役立ちます。バリア機能を実現するために、CP上皮細胞は、低飲作用活性を示す特定のトランスポーターを発現し、そして密に密着結合（のTJ）2,3の連続的なネットワークで接続されています。

日本人女性4の悪性脈絡叢乳頭腫由来のヒト脈絡叢乳頭腫（HIBCPP）細胞は、BCSFBのインビトロモデルで機能を構築するために使用しました。 HIBCPP細胞は、TJの形成などの機能BCSFBの特性のいくつかを示してストランド、経上皮電気抵抗（TEER）のように決定することができる高い経上皮膜電位の開発、および高分子のマイナー透過性。また、HIBCPP細胞は、イオン性微小環境を調節するために機能し、基底外側/アピカル極性5,6,7を示すことが特徴的なトランスポーターを発現します。

BCSFBは、中枢神経系（CNS）8への病原体（細菌、ウイルス、および真菌）のための侵入部位として機能することが示されています。 ....

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プロトコル

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1.倒立モデル系で播種HIBCPP細胞のための細胞培養フィルターインサートを準備します

  1. 前加温DMEM / F12（ハム）を5μg/ mlのインスリン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FCS）を補充しました。
  2. 逆さまに12ウェルプレート（ 図1E）に3ミクロンの細孔サイズで0.33 cm 2の成長領域の細胞培養フィルターインサートを配置するために滅菌ピンセットを使用してください。
  3. 細胞培養フィルターインサートの下の区画（約3ml）およびフィルターインサートの上に100μlのにメディアを埋めます。プレートだけでなく、媒体と​​下の区画をあふれさせます。フィルタインサートの下の区画が（ 図1E）満たされたままになるように、過剰な培地を吸引除去します。
    注：このステップのための血清学的ピペットを使用することをお勧めします。
  4. 蓋で12ウェルプレートをカバーし、インキュベーターに調製した細胞培養用フィルタインサートを転送する、37°C細胞を添加するまで5％CO 2。

2.栽培とHIBCPP細胞の継代

  1. 5μg/ mlの、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび10％FCSを補充したD....

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結果

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ここでは、反転し、細胞培養インサートシステムでHIBCPP細胞の培養および感染を説明します。このモデルは、私たちは（ 図1）を普及し、血流を介して上皮細胞に侵入する細菌の生理学的状況を再現、側底細胞側から侵入メカニズムとその下にある分子のシグナル伝達経路を研究することができます。

HIBCPP細胞は最低レベルに分子交換を制限することを可能に特定のバリア機能を、表示します。これは、接着結合（AJ）とタイトジャンクショ​​ン（TJ）タンパク質の発現によって達成されます。 TJ関連タンパク質オクルディン、クローディンおよびZO-1の免疫蛍光分析は、細胞がのTJの連続ストランド（ 図2A、B、C）によって相互接続されていることを実証し、細胞-細胞接触の部位に中断されないシグナルを明らかにしました。トンの詳細な印象彼TJの形態は、送信（ 図2D）によって得られ.......

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ディスカッション

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CPの上皮細胞は、血液2,3からCSFを分離BCSFBを形成します。我々は最近、BCSFBの機能性ヒトモデルとしてHIBCPP細胞株を確立しました。細胞は、高い膜電位の開発、巨大分子のための低透過性、ならびにのTJ 5の連続ストランドの存在を含むin vitroでの BCSFBの重要なバリア機能を表示します。 TJ蛋白質は、細胞の基底外側/頂端の極性に寄与する。極性は、表面受容体ならびに特定のトランスポータータンパク質の指向局在のため非常に重要です。私たちは、極性受容体ECADおよびMetの局在ならびにCNS 6,7内の高度に制御された微小環境を維持し、ATP結合カセット（ABC）トランスポーターファミリーのメンバーを示しています。

いくつかのBCSFBを克服することによって、CNSへのエントリーを獲得することができます微生物、最先端レベルがあります。髄膜炎8を含む重篤な疾患にグラム。 CP上皮細胞に侵入することが可能な病原体の一つは、ヒト特異的グラム陰性菌N

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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著者は、電子顕微鏡検査を行ったHartwig Wolburg教授に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% トリプシン-EDTAGibco25200-056
4´,6 ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)Life TechnologiesD1306
12-well platesStarlabCC7682-7512
24-well platesStarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPこの抗体は、H. Claus博士とU. Vogel博士(University of WüRzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (ニワトリ抗ウサギ)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (ニワトリ抗ウサギ)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
ウシ血清アルブミン (BSA)Calbiochem12659
チョコレート寒天プレートBiomerieux43109
サイトカラシン DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o フェノールGibco11039-047
ジメチルスルホキシSigma D2650
子牛胎児血清 (FCS)Life Technologies10270106
FITC-イヌリンシグマF3272
インスリンシグマ19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
ペニシリン/ストレプトマイシンMP バイオメディカル1670049
ポリビテックスBiomerieux55651
プロテオースペプトンBD211684
無血清培地Gibco10902-096
24 ウェルプレート用 Thincert 細胞培養インサート、細孔サイズ 3 & マイクロ;mGreiner662630
組織培養フラスコ 75 cm² 赤いキャップ 滅菌Greiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrodeMilliporeMERSSTX00
ド

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
  2. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
  3. Engelhardt, B., So....

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