方法論記事

PGR-ブループラスミドとゴールデンゲートアセンブリを使用してターミネータの迅速な検証

DOI：

10.3791/54064

⸱

2016年4月25日

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、ゴールデンゲートアセンブリとプラスミドpGR-blueを利用して、シリコで発見されたターミネーターの強度を迅速に定量化します。

要約

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このプロトコルの目標は、生体情報学的に同定されたターミネーターの迅速な検証を可能にすることです。さらに、プラスミド(pGR-Blue)は、このプロトコール専用に設計されており、ターミネーター効率の定量化が可能です。概念実証として、6つのターミネーターがマイコバクテリオファージBernal13でバイオインフォマティクス的に同定されました。同定されたら、ターミネーターを適切な粘着性末端を持つオリゴヌクレオチドとして作製し、一緒にアニールしました。その後、ゴールデンゲートアセンブリ(GGA)を使用して、ターミネーターをpGR-Blueにクローン化しました。可視光線下では、偽陽性のコロニーは青色に、陽性に形質転換されたコロニーは白色/黄色で表示されます。アラビノース誘導性プロモーター(pBad)をアラビノースで誘導した後、産生された緑色蛍光タンパク質(GFP)と産生された赤色蛍光タンパク質(RFP)の比率を測定することにより、コロニー強度を決定できます。pGR-Blueを使用すると、プロトコルはわずか3日で完了し、教育現場で理想的です。さらに、結果は、このプロトコルが転写の調節に関連するターミネーター効率のin silico予測を理解するための手段として有用であることを示しています。

概要

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大規模な合成生物学プロジェクトでは、遺伝子発現の調節を助けるために非常に効果的な転写ターミネーターの使用が必要です。新規ターミネーターの同定には、新規ゲノムのバイオインフォマティクス解析が必要です。しかし、バイオインフォマティクスソフトウェアが開発され、それぞれが予測に利用される独自のアルゴリズムを持つようになると、推定結果の間にはより多くの不一致が生じます。このプロセスはやや主観的であり、その場で行われるため、これらの予測には生物学的な確認が必要です。1 さらに、インシリコ分析によって同定された推定ターミネーターの量には、比較的短期間で完了できるクローニング戦略の使用が必要です。

PGR-Blueプラスミドは、PGRプラスミドの改良版であり、ゴールデンゲートアセンブリ(GGA)を使用してクローニング手順を簡素化し、すべての反応ステップを1つの微量遠心チューブで同時に実行できるようにしました。2,3 色選択をプラスミドに組み込んで、陽性コロニーの同定を容易にしました。ライゲーションを成功させるには、可視光線では白色/黄色で、アラビノースを含むプレート上で成長させると、青色(450 nm)または紫外線(UV)光の下で緑色に蛍光を発します。未カットのpGR-blueには青色の色素タンパク質(amilCP)が含まれているため、未修飾プラスミドを含むコロニーは可視光線下で青色になります。この簡素化と合理化....

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プロトコル

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1.適切な粘着末端を有するオリゴヌクレオチドを​​設計し、注文

  1. オンラインで自由に利用可能なプログラムを用いてゲノム解析を通じて潜在的なローに依存しないターミネータを識別します。7
  2. 二本鎖DNAを操作する場合は、テストされるターミネーターの方向を決定する。7 PGR-ブループラスミドは上部のみ（フォワード鎖）の5 'から3'方向に連結したターミネータを検証します。
    1. 底に変換し、無料のオンラインソフトウェア、 例えば 、APEを使用して、PGR-ブルーでテストするためのシーケンスを再配向するために、その逆相補体に鎖ターミネーター（リバース）。
  3. 向きが正しいと判断された後、上部の鎖の5 '末端に粘着末端「5'-CGAC-3 "'を追加します。下の鎖の5 '末端に粘着末端「5'-CCGC-3 "'を追加。8これが連結したインサートが適切に挿入されることを保証しますGGAを使用して向き。
  4. 配列が決定されると、商業的に一本鎖オリゴヌクレオチドとして注文します。

2.アニーリングオリゴヌクレオチドは、（凍結乾燥するDNAをのみ適用されます）

  1. 再懸濁、100μMの濃度にヌクレアーゼフリー水で個々のオリゴヌクレオチド。
  2. 1 M NaClおよび100....

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結果

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このプロトコルは、ゴールデンゲートアセンブリ（ 図2）を使用して、GFPとRFPの間に連結ターミネータでPGR-ブルーを含む細胞を生成します。ライゲーションされた挿入物を含む陽性コロニーの色に基づいて選択することができます。可視光では陽性コロニーは白/黄色になり、偽陽性は37°C（ 図3）でのインキュベーションの18から20時間後に青色のコロニーを生成します。

コロニーを選択した後、プレートリーダーは、ターミネーター強度を決定するために用いることができます。コンセプトの証明としては、6推定上のターミネータ（T1-6）は、バイオインフォマティクスマイコBernal13で同定されました。 図4の結果は、対照として、未切断/未修正のPGRを発現する細胞との相対的なターミネータの強さを示しています。予測ターミネータはPGR（〜0.0）と同様のGFP / RFP.......

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ディスカッション

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このプロトコルの中で最も重要なステップは、発注​​前に、適切なオリゴヌクレオチドの設計です。オリゴヌクレオチドは、適切な粘着末端は、GGAの取り込みが可能であることを保証するために、両方の上部と下部の鎖の5 '末端に付加されている必要があります。 GFPおよびRFP式が（トップ鎖に向かって右にあるのでさらに、右向きのものに左向きターミネーター（下の鎖上で転写を停止ターミネーター）の向きを切り替えることが重要である（上の鎖の転写を終結さ）ターミネータ）方向。

二つの別々のGGAプロトコルバッファミックスはPGRブルーで終端をテストするために使用することができます。標準的な経済ミックスを個別にした後、実験室8で混合材料の購入から構成されています。第二プロトコルは、市販の既製GGAマスターミックスを使用しています。両方がうまく機能している間。商業用マスターミックスは、より時間効率的であるが、標準的なミックスに比べて比較的高価です。教育の設定では、事前に標準GGAミックスを作成し、個々の学生の使用のためのアリコートを凍結することがより経済的です。

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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ゲノミクスと進化科学を推進するファージハンター（SEA-ファージ）プログラム - 著者は、Active教育のためのゲノムコンソーシアム（GCAT）とHHMI-科学教育連盟とマルコム・キャンベルとトッドEckdahlを承認したいと思います。

このプロジェクトは、研究資源のための国立センター（P20RR016460）と国立衛生研究所から一般医科学研究所（P20GM103429）からの助成金によってサポートされていました。この研究は、助成金＃のIIA-1457888の下で国立科学財団によって部分的にサポートされていました。さらに制度（ウォシタ・バプティスト大学）資金はJDパターソン夏の特別研究員を介して提供されました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
pGR-Blue PlasmidAddgene68374
pGR-PlasmidAddgene46002
AeraSeal-(滅菌シート)Excel ScientificBS-25滅菌シートのみ
10x T4 DNAリガーゼ バッファーNEB
BsaI-HFNEBR3535S非HF酵素は機能しますが、熱安定性は劣ります。 
NEBゴールデンゲートアセンブリミックスNEBE1600Sコマーシャルマスターミックスは、プロトコルで参照されています。
T4 DNAリガーゼNEBM0202S
ラウンドマイクロ遠心分離機フローティングラックNova Tech InternationalF18875-6401
アンピシリンナトリウム塩SigmaAldrich A9518
L-(+)-アラビノースSigma AldrichA-3256D-アラビノースはpBADプロモーターを誘導しません
ルリアベース(LB) - ブロス、ミラーシグマアルドリッチL1900
ルリアベース (LB) - 寒天、ミラーシグマ アルドリッチL2025
テカン インフィニット M200 プレート リーダーテカン
ミックス &Go Competent Cells - Strain JM109Zymo ResearchT3005使用会社推奨形質転換プロトコル
ApE: プラスミドエディタソフトウェアhttp://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl、分子グレードPromegaH5121
塩化ナトリウム (結晶性/生物学的、認証済み)Fisher ChemicalS671
商業オリゴヌクレオチド合成統合DNAテクノロジー(IDT)http://www.idtdna.com/site
Microtest 組織培養プレート - 96ウェル(滅菌)ファルコン35-3072
マイコバクテリオファージ "Bernal13"GenebankKJ510413
Nuclease Free WaterIntegrated DNA Technologies(IDT)IDT004
滅菌、L字型ホッケースティック セルライフサイエンス製品6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis SpectrometerThermo Scientific2000c
ARNold: Rho 非依存性転写ターミネーターを予測するためのウェブツール。
http://rna.igmors.u-psud.fr/

参考文献

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  1. Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
  2. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability....

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GFP RFP

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