方法論記事

PGR-ブループラスミドとゴールデンゲートアセンブリを使用してターミネータの迅速な検証

DOI：

10.3791/54064

⸱

2016年4月25日

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、ゴールデンゲートアセンブリとプラスミドpGR-blueを利用して、シリコで発見されたターミネーターの強度を迅速に定量化します。

要約

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このプロトコルの目標は、生体情報学的に同定されたターミネーターの迅速な検証を可能にすることです。さらに、プラスミド(pGR-Blue)は、このプロトコール専用に設計されており、ターミネーター効率の定量化が可能です。概念実証として、6つのターミネーターがマイコバクテリオファージBernal13でバイオインフォマティクス的に同定されました。同定されたら、ターミネーターを適切な粘着性末端を持つオリゴヌクレオチドとして作製し、一緒にアニールしました。その後、ゴールデンゲートアセンブリ(GGA)を使用して、ターミネーターをpGR-Blueにクローン化しました。可視光線下では、偽陽性のコロニーは青色に、陽性に形質転換されたコロニーは白色/黄色で表示されます。アラビノース誘導性プロモーター(pBad)をアラビノースで誘導した後、産生された緑色蛍光タンパク質(GFP)と産生された赤色蛍光タンパク質(RFP)の比率を測定することにより、コロニー強度を決定できます。pGR-Blueを使用すると、プロトコルはわずか3日で完了し、教育現場で理想的です。さらに、結果は、このプロトコルが転写の調節に関連するターミネーター効率のin silico予測を理解するための手段として有用であることを示しています。

概要

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大規模な合成生物学プロジェクトでは、遺伝子発現の調節を助けるために非常に効果的な転写ターミネーターの使用が必要です。新規ターミネーターの同定には、新規ゲノムのバイオインフォマティクス解析が必要です。しかし、バイオインフォマティクスソフトウェアが開発され、それぞれが予測に利用される独自のアルゴリズムを持つようになると、推定結果の間にはより多くの不一致が生じます。このプロセスはやや主観的であり、その場で行われるため、これらの予測には生物学的な確認が必要です。1 さらに、インシリコ分析によって同定された推定ターミネーターの量には、比較的短期間で完了できるクローニング戦略の使用が必要です。

PGR-Blueプラスミドは、PGRプラスミドの改良版であり、ゴールデンゲートアセンブリ(GGA)を使用してクローニング手順を簡素化し、すべての反応ステップを1つの微量遠心チューブで同時に実行できるようにしました。2,3 色選択をプラスミドに組み込んで、陽性コロニーの同定を容易にしました。ライゲーションを成功させるには、可視光線では白色/黄色で、アラビノースを含むプレート上で成長させると、青色(450 nm)または紫外線(UV)光の下で緑色に蛍光を発します。未カットのpGR-blueには青色の色素タンパク質(amilCP)が含まれているため、未修飾プラスミドを含むコロニーは可視光線下で青色になります。この簡素化と合理化されたプロトコルにより、研究者はバイオインフォマティクスの同定から生物学的確認までを3〜4日で進めることができます。このシステムの設計上の性質は、研究室と教育環境の両方で有益です。

pGR-Blueプラスミドは、ターミネーター強度の定量化を可能にします。4 単一のアラビノース誘導性プロモーターを使用して、緑色蛍光タンパク質(GFP)および赤色蛍光タンパク質(RFP)を産生します。ターミネーターは、GFP配列の後、RFP配列の前にプラスミドにクローニングされるため、RFPタンパク質の転写が停止します。ターミネーターの強度は、生成されたGFPと生成されたRFPの比率によって決まります。

ビジョンと変化5のレポートは、科学、技術、工学、数学(STEM)教育が研究に基づいた経験を教室に取り入れることを提案しました。6 ただし、これには、限られたスキルセットを持つ学生が定義された時間枠内で実行できるプロトコルの開発が必要です。このプロトコルはわずか3日で完了できますが、各主要なステップを毎週(2〜3時間)のラボ期間で達成して、コース研究体験(CRE)を作成できるようにも設計されました。このように使用すると、この手順は3週間から6週間かかり、遺伝学、細胞生物学、バイオインフォマティクスの入門コースと上級コースの両方に適しています。

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プロトコル

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1.適切な粘着末端を有するオリゴヌクレオチドを​​設計し、注文

  1. オンラインで自由に利用可能なプログラムを用いてゲノム解析を通じて潜在的なローに依存しないターミネータを識別します。7
  2. 二本鎖DNAを操作する場合は、テストされるターミネーターの方向を決定する。7 PGR-ブループラスミドは上部のみ（フォワード鎖）の5 'から3'方向に連結したターミネータを検証します。
    1. 底に変換し、無料のオンラインソフトウェア、 例えば 、APEを使用して、PGR-ブルーでテストするためのシーケンスを再配向するために、その逆相補体に鎖ターミネーター（リバース）。
  3. 向きが正しいと判断された後、上部の鎖の5 '末端に粘着末端「5'-CGAC-3 "'を追加します。下の鎖の5 '末端に粘着末端「5'-CCGC-3 "'を追加。8これが連結したインサートが適切に挿入されることを保証しますGGAを使用して向き。
  4. 配列が決定されると、商業的に一本鎖オリゴヌクレオチドとして注文します。

2.アニーリングオリゴヌクレオチドは、（凍結乾燥するDNAをのみ適用されます）

  1. 再懸濁、100μMの濃度にヌクレアーゼフリー水で個々のオリゴヌクレオチド。
  2. 1 M NaClおよび100 mMトリス - 塩酸pHが7.4：10×アニーリング緩衝液を作ります。アニーリング緩衝液は、数週間4℃で保存することができます。アニーリングバッファーが行われ、オリゴヌクレオチドが再懸濁された後、アニール8を開始します。
  3. 各終端抵抗をテストするためには、1.5ミリリットルのマイクロチューブに超純水16μlを添加します。
  4. 各マイクロチューブに10倍アニーリング緩衝液2μLを加えます。
  5. 希望ターミネータから上の鎖オリゴヌクレオチドの1μlの（100μM）を追加します。
  6. 希望ターミネータからボトム鎖オリゴヌクレオチド（100μM）の1μLを加えます。
  7. 沸騰したお湯のBAを作成します。ホットプレート上で水道水と場所の約400ミリリットルを含む千ミリリットルのビーカーを使用して目。
  8. フロートのステップ2.6からマイクロ遠心チューブを置き、4分間沸騰。 4分後、熱板をオフにするが、チューブを残し、水浴にゆっくりとクールなO / N（18時間）8に浮きます。 -20℃でアニールターミネータを保管してください。

3.ゴールデンゲートアセンブリ（標準ミックス - コスト効率のよいです）

  1. アニールターミネーターの40 nMの希釈を行います。アニールターミネーターミックス（100μM）の1μlにヌクレアーゼフリー水124μlを添加します。
    1. 氷上で30万×gで秒、店舗用の遠心分離機サンプル。
  2. 使用されているサーモサイクラーに適した新たなチューブに、ヌクレアーゼを含まない水の6μlを添加します。
  3. 市販のDNAリガーゼバッファー[300mMのトリス塩酸（pHが7.7から7.8）、100 mMのMgCl 2を、100mMのDTT、および10mM ATP]の1μLを加えます。氷の上で後続のすべての手順を実行します。
  4. 加えますPGR-ブルー（35-50 ngの/μl）をマイクロ遠心チューブに先プラスミドの1μlの。
  5. マイクロチューブに40 nMの焼鈍ターミネーターの1μLを加えます。
  6. マイクロチューブに0.5μlの市販の高忠実度のBsaI制限エンドヌクレアーゼを追加します。
  7. マイクロ遠心チューブに市販のDNAリガーゼの0.5μlを添加します。
  8. 120秒間万×gで反応混合物を遠心分離します。そして、サーマルサイクラーに直接チューブを配置します。
  9. サーモサイクラープログラムを実行する：37℃で1分間の20サイクル、37℃で15分間の1サイクル、続いて16℃で1分間続きます。使用サンプル直ちにまたは-20℃で凍結保存する。8

4.ゴールデンゲートアセンブリ（商業マスターミックス - 時間効率的な）

  1. これは、40 nmのターミネーターDNA濃度を希釈するステップ2で作成したターミネータをアニールし、100μMの1μlにヌクレアーゼフリー水124μlを添加します。新たに、このステップを実行し、1.5ミリリットルのマイクロチューブは、標識されました。
  2. サーモサイクラー用の新しいチューブの適切に、ヌクレアーゼフリー水14μlを添加します。新しいチューブはそれに応じてラベル付けされていることを確認します。
  3. マイクロチューブに商業マスターミックス緩衝液の2μlを添加します。
  4. マイクロチューブにPGR-ブループラスミド（35-50 ngの/μL）の1μLを加えます。
  5. マイクロチューブに40 nMの焼鈍ターミネーターの2μLを加えます。
  6. マイクロチューブに商業マスターミックスの1μLを加えます。
  7. 120秒間万×gで40 nMのチューブを遠心。そして、サーマルサイクラーに直接チューブを配置します。
  8. 55℃で15分間の1サイクル、続いて37℃で60分間の1サイクル：サーモサイクラープログラムを実行します。使用してすぐにサンプルまたは-20℃で凍結して保存。

5.形質転換およびコロニーの選択

  1. 準備の1mM concentratを含むペトリ皿の寒天ルリアベース（LB）アンピシリンのイオン（アンプ）とアラビノースの10 mMの濃度（ARB）。このストック溶液は、後の工程で使用されるため、1 MのL -arabinose原液の少なくとも10 mlで調製します。
  2. 任意の高効率使用（8月10日から9月10日までの形質転換体/μgのを）化学的コンピテントE.変換のための大腸菌 （JM109）細胞。最良の結果を得るために9、コンピテント細胞を50μlに連結反応の3-5μlを添加します。化学的コンピテント細胞を使用する場合、細胞が使用されている固有の形質転換プロトコルに従います。
  3. 無菌のL字型の「ホッケースティック」を使用して寒天プレート予熱したLB（アンプ/ ARB）に形質転換された細胞の半分（25μl）を広げ、37℃でO / Nインキュベートします。分解のアンピシリンの急速なレートに、24時間にわたって37℃でインキュベートしません。
  4. 目視による色に基づいて、コロニーの選択を行います。成功したライゲーションは、可視光で黄色/白と緑のアンクルを蛍光を発する必要がありますr個の青（450 nmの）またはUV光。 20時間 - 失敗したライゲーションは18の後に、可視光下での色は青であるコロニーを生成します。

6.検証とターミネーターの定量

  1. 1 mMのアンピシリンおよびアラビノースの10mMで5ミリリットル滅菌LBブロスチューブを準備します。必要な管の数は、試験されるターミネータープラスコントロール（細胞アンピシリン耐性を持つ蛍光を発しないとノーカットPGR-ブループラスミドを含む細胞）の数に依存しています。
  2. 可視光下で滅菌ループを使用して2-3の黄色/白色コロニー（ステップ5.4）を選択します。試料は37℃、16-18時間、160rpmでシェーカー上ブロスでインキュベートすることを可能にします。以上24時間これらのサンプルをインキュベートしないでください。
    1. 必要に応じて、適切な細胞の成長を確実にするために、600nmの（OD 600）での光学セル密度を決定するために分光光度計を使用します。一般的に、〜0.8〜1.0のOD 600は、成長の16-18時間後に観察されます。
  3. つかいます残りのステップのための滅菌96ウェルプレート。無菌環境と三重にこれらのステップを実施します。各ウェルに滅菌LB +アンプ/アラビノースブロス（1 mMのアンピシリン/ 10 mMのアラビノース）の199μLを加えます。 3つの別々のコントロールのプレート上でルームなどがあります。
    1. 次の3つのコントロールを使用します。ウェル（1）を含むLB +アンプ/アラビノースブロスのみとウェル（2）（空白）非形質転換コンピテントセルは空白として機能します。定量化のために（3）ターミネータ強度の、非終結配列と連結したノーカットオリジナルPGRを含むまたはPGR-ブルーを含む細胞は、（定量化のための基準制御）に含まれるべきです。プレートリーダーのレイアウトについては、 図1を参照してください。
  4. 96ウェルプレートの個々のウェルにO / N培養液から細胞溶液のピペット1μlの。
  5. 通気性のカバーとシールプレートとは、37℃で18-20時間、および160 rpmで振とうします。
  6. プレートリーダーを用いて読み取ることにより、OD 600を決定します600 nmの吸光度。次のようにGFP蛍光を測定する：励起395及び発光509メジャーRFP蛍光を次のように：励起575および発光605を18から20時間後、OD 600が約0.5であるべきです。
  7. 成長の変化を標準化するために、式を使用します。 figure-protocol-1 GFPとRFPの両方のために。
  8. 正規化の後、式を用いて相対的なターミネーターの強度を決定しますfigure-protocol-2

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結果

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このプロトコルは、ゴールデンゲートアセンブリ（ 図2）を使用して、GFPとRFPの間に連結ターミネータでPGR-ブルーを含む細胞を生成します。ライゲーションされた挿入物を含む陽性コロニーの色に基づいて選択することができます。可視光では陽性コロニーは白/黄色になり、偽陽性は37°C（ 図3）でのインキュベーションの18から20時間後に青色のコロニーを生成します。

コロニーを選択した後、プレートリーダーは、ターミネーター強度を決定するために用いることができます。コンセプトの証明としては、6推定上のターミネータ（T1-6）は、バイオインフォマティクスマイコBernal13で同定されました。 図4の結果は、対照として、未切断/未修正のPGRを発現する細胞との相対的なターミネータの強さを示しています。予測ターミネータはPGR（〜0.0）と同様のGFP / RFP...

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ディスカッション

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このプロトコルの中で最も重要なステップは、発注​​前に、適切なオリゴヌクレオチドの設計です。オリゴヌクレオチドは、適切な粘着末端は、GGAの取り込みが可能であることを保証するために、両方の上部と下部の鎖の5 '末端に付加されている必要があります。 GFPおよびRFP式が（トップ鎖に向かって右にあるのでさらに、右向きのものに左向きターミネーター（下の鎖上で転写を停止ターミネーター）の向きを切り替えることが重要である（上の鎖の転写を終結さ）ターミネータ）方向。

二つの別々のGGAプロトコルバッファミックスはPGRブルーで終端をテストするために使用することができます。標準的な経済ミックスを個別にした後、実験室8で混合材料の購入から構成されています。第二プロトコルは、市販の既製GGAマスターミックスを使用しています。両方がうまく機能している間。商業用マスターミックスは、より時間効率的であるが、標準的なミックスに比べて比較的高価です。教育の設定では、事前に標準GGAミックスを作成し、個々の学生の使用のためのアリコートを凍結することがより経済的です。

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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ゲノミクスと進化科学を推進するファージハンター（SEA-ファージ）プログラム - 著者は、Active教育のためのゲノムコンソーシアム（GCAT）とHHMI-科学教育連盟とマルコム・キャンベルとトッドEckdahlを承認したいと思います。

このプロジェクトは、研究資源のための国立センター（P20RR016460）と国立衛生研究所から一般医科学研究所（P20GM103429）からの助成金によってサポートされていました。この研究は、助成金＃のIIA-1457888の下で国立科学財団によって部分的にサポートされていました。さらに制度（ウォシタ・バプティスト大学）資金はJDパターソン夏の特別研究員を介して提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
pGR-Blue PlasmidAddgene68374
pGR-PlasmidAddgene46002
AeraSeal-(滅菌シート)Excel ScientificBS-25滅菌シートのみ
10x T4 DNAリガーゼ バッファーNEB
BsaI-HFNEBR3535S非HF酵素は機能しますが、熱安定性は劣ります。 
NEBゴールデンゲートアセンブリミックスNEBE1600Sコマーシャルマスターミックスは、プロトコルで参照されています。
T4 DNAリガーゼNEBM0202S
ラウンドマイクロ遠心分離機フローティングラックNova Tech InternationalF18875-6401
アンピシリンナトリウム塩SigmaAldrich A9518
L-(+)-アラビノースSigma AldrichA-3256D-アラビノースはpBADプロモーターを誘導しません
ルリアベース(LB) - ブロス、ミラーシグマアルドリッチL1900
ルリアベース (LB) - 寒天、ミラーシグマ アルドリッチL2025
テカン インフィニット M200 プレート リーダーテカン
ミックス &Go Competent Cells - Strain JM109Zymo ResearchT3005使用会社推奨形質転換プロトコル
ApE: プラスミドエディタソフトウェアhttp://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl、分子グレードPromegaH5121
塩化ナトリウム (結晶性/生物学的、認証済み)Fisher ChemicalS671
商業オリゴヌクレオチド合成統合DNAテクノロジー(IDT)http://www.idtdna.com/site
Microtest 組織培養プレート - 96ウェル(滅菌)ファルコン35-3072
マイコバクテリオファージ "Bernal13"GenebankKJ510413
Nuclease Free WaterIntegrated DNA Technologies(IDT)IDT004
滅菌、L字型ホッケースティック セルライフサイエンス製品6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis SpectrometerThermo Scientific2000c
ARNold: Rho 非依存性転写ターミネーターを予測するためのウェブツール。
http://rna.igmors.u-psud.fr/

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
  2. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  3. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  4. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  5. Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
  6. Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
  7. Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
  8. Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
  9. Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
  10. Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
  11. Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
  12. Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
  13. Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).

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