ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型

サマリー

ミニブタの滑液と骨髄から分離され、注射器吸引を使用して非侵襲的に採取された間葉系幹細胞(MSC)を確立するプロトコルが提示されます。細胞表現型は、細胞単離後のフローサイトメトリーを使用し、MSCに由来する骨髄および滑液のin vitro培養を用いて行いました。

要約

間葉系幹細胞(MSC)は、骨髄や滑液を含むさまざまな組織源からの分離後に確立されています。近年、滑液由来のMSCは、多系統分化能と免疫調節性を有することが報告されており、これらの細胞が組織工学や全身治療に利用できることが示唆されています。この研究は、細胞表現型およびin vitro培養のための細胞表面マーカーを分析するために、ミニブタの骨髄および滑液に由来するMSCの単純で非侵襲的な単離のためのプロトコルを提示します。生後6ヶ月の性成熟したミニブタを用いて、骨髄抽出器を用いて腸骨堤骨から骨髄を採取し、大腿脛関節から滑液を吸引した。両方の供給源からサンプルを採取する手順は非侵襲的であった。回収した細胞源からのMSCの効果的な単離、およびミニブタからの安定MSCを拡大するためのin vitro培養条件の作成、および全身性自家治療の適用のためのプロトコルが提供されます。細胞表現型解析のために、両細胞の細胞表面マーカーをフローサイトメトリーを用いて解析しました。その結果、ミニブタの滑液からMSCを単離し、滑液由来MSCが骨髄由来MSCと類似した形態と細胞表現型を有することを示しました。したがって、非侵襲的に得られた滑液はMSCの貴重な供給源です。

概要

多能性間葉系幹細胞(MSC)は間葉系細胞系統に分類することができ、MSCは骨髄、臍帯、胎盤、脂肪組織、真皮、骨格筋、毛包、滑膜、歯など、さまざまな組織源から確立され、単離されています^1-5。現在、同性体由来のMSCは、骨分画、変形性関節症、関節リウマチ(RA)などの関節疾患の治療に役立つ可能性があり、損傷した軟骨や骨におけるMSCの再生能により、免疫調節や自己免疫疾患の治療にも役立つ可能性があるため、同性葉系幹細胞に注目が集まっています^6-8。滑液源に由来するMSCの研究の大部分は、滑液^2,9ではなく滑膜からのMSCを使用してきました。したがって、滑液由来MSCの生物学的理解は限られています。

Synovial fluidは、患者の診断や治療中、および変形性関節症やRAなどの侵襲的な処置を必要としないさまざまな関節炎の状態の診断確認中に吸引できるMSCの容易な供給源です。滑膜腔内の滑液由来MSCの集団は、非関節炎患者と比較して関節炎患者で有意に増加しています^10-12。したがって、滑液はMSCの優れた供給源であり、特に炎症を起こしたまたは損傷した関節の患者の自家幹細胞療法に有効です。さらに、滑液由来のMSCは、軟骨形成能力、免疫調節能力、および高い増殖率を備えています。この研究では、非侵襲的方法を使用したミニブタからの骨髄抽出と滑液吸引、および単離された細胞のin vitro増殖と細胞表現型の分析のためのプロトコルを確立しました。

プロトコル

動物実験は、慶尚大学校での生物医学実験用動物センターによって承認されました。

動物手順1.準備

1. 骨髄および滑液からのMSCの非侵襲的なコレクションのために成人女性のミニブタを準備します。麻酔および試料収集の1日前ミニブタの臨床検査を実行します。
   1. 完全血球計数検査を使用して、体温、呼吸数、および心拍数を含む健康診断のための、および豚の行動と血液学的状態の観察のために臨床的に正常な動物を提供します。
      注：臨床的に健康なミニブタのパラメータ間隔は11です - 呼吸数29 /分、68 - 心拍数98 /分、および37 - 体温のために38°C。
2. 12時間のPRIO - 6の術前絶食期間中にケージからすべての食用の寝具を削除若者や成人のミニブタのための麻酔の投与rは、空腹時の3時間は、新生児のために観察されるはずです。麻酔時まで飲料水を提供します。

麻酔のための動物の作製

1. アセプロマジン（0.1ミリグラム/キログラム）、メデトミジン（0.03ミリグラム/ kg）で麻酔の投与前ミニブタを薬で治療し、アトロピン（0.04ミリグラム/キログラム）。
   1. 成人ミニブタについて少なくとも30mmの長さの21 G針を使用して、すべての薬剤を筋肉内（IM）を注射します。横子宮頸部筋肉内または大腿部筋肉に1〜3センチメートル耳の後ろにIM注射を実行します。
      注意：動物で恐怖やストレスを誘発または安全に前投薬​​を注入するために乱暴な取り扱いを必要とせずに、すべての手順を実行します。
2. 背臥位でミニブタを置きます。
3. 15分前投薬の投与後、1.5％イソフルラン管理を使用して麻酔を開始吸入を介してistered。
   1. キャリアガスとして酸素（/分1.5 L）で、2.5％の濃度の増加に続いて、気管内チューブを介してイソフルランの吸入（1.5％）を継続します。
4. 連続麻酔中ミニブタの心拍数、体温、および経皮的血液酸素飽和度（SpO _2）モニタ。体温を維持するために39°C - 38の温度で循環水ブランケットを使用してください。麻酔中に乾燥から目を保護するために眼科軟膏を適用します。
5. 麻酔¹³の深さを評価するGuedelの分類に従ってください。

細胞の単離および培養のための3の準備

1. 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した高度ダルベッコ改変イーグル培地（ADMEM）、1％グルタマックス500mlの、塩基性線維芽細胞成長ファクトを10ng / mlのを準備する、骨髄および滑液由来するMSCを培養しますR（bFGFを）、および1.0％ペニシリン - ストレプトマイシン（それぞれ万IU 10,000μgの/ mlの、ペニシリン - ストレプトマイシン）。
   1. CO ₂インキュベーター内で5％CO ₂の加湿雰囲気中で38.5℃でADMEMをインキュベートします。
2. 細胞分離および洗浄のための製造業者の指示に従ってダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）500mlのを準備します。

4.ミニブタから骨髄を収集

1. エリア腸骨稜（ 図1）上のサイズは約15×15センチ選択し、滅菌剃刀や電気バリカンを使用して、この領域から毛を取り除きます。ポビドンヨードおよび70％エタノール：ミニブタが配置されると、交互に次の消毒剤を使用して手順サイトを3回スクラブ。領域が完全に乾燥した後、滅菌ドレープを適用します。
2. ejec前にヘパリンの4ミリリットル - プレコート10mlを3でそれをすすぐことによって、ヘパリンの100 U / mlのシリンジティン抗凝固剤。
   注：骨髄穿刺時にシリンジ内の凝固を避けるために、この手順を実行します。
3. しっかりとヘパリンプレコートされた10ミリリットルの注射器に取り付けられた骨髄抽出（3.0×100ミリメートル）を使用して、麻酔下でミニブタの腸骨稜骨から骨髄の5ミリリットルの最小値を抽出します。

骨髄からとインビトロ栽培で抽出した細胞の単離5.

1. 抽出された骨髄から細胞を単離します。
   1. 室温で15 mLのコニカルチューブ中のDPBSの等量で抽出した骨髄を希釈します。
   2. 15ミリリットルコニカルチューブに密度遠心分離培地（フィコール・パック）の3ミリリットルを追加します。
   3. 室温で40分間、400×gでで4 mLの混合せずに密度遠心分離媒体上に配置されるDPBSで骨髄の層、及び遠心分離して希釈します。
   4. 単核細胞層を回収します血漿（上層）と密度遠心分離媒体（下層）を含む二つの層の間に軟膜から（多国籍企業）、そして15mlコニカルチューブに多国籍企業を移します。
   5. 7で転送多国籍企業を希釈 - DPBSの8ミリリットル、室温で10分間、500×gで、それらを遠心分離します。上清を捨て、DPBSで細胞を2回洗浄します。
   6. ADMEM 2ml中の細胞ペレットを中断し、35mm組織培養皿に移します。 5％CO ₂の加湿雰囲気中で38.5℃で培養皿をインキュベートします。
2. 骨髄から単離された細胞のインビトロ培養で 。
   1. 48時間後、皿に付着していない細胞を含む培地を吸引し、ADMEMの2ミリリットルを交換し、5％のCO ₂の加湿雰囲気中で38.5℃で静置します。すべての第三日間培養液を交換します。
   2. 80％の密集度、DPBSで細胞を洗浄し、0.25％の1mlでそれらを分離 - 70でトリプシン/ EDTA、3 37℃でそれらをインキュベートする - 細胞が剥がれるまで5分。
   3. ADMEMを10mlを用いて細胞を収穫を15mlコニカルチューブにそれらを転送し、室温で5分間、300×gで、それらを遠心。上清を捨てます。
   4. 新鮮なADMEMの1ミリリットルで収穫された細胞を懸濁し、血球計数器を使用してそれらを数えます。
   5. 5に細胞を置き- ADMEMの4ミリリットルを含む7.5×10 ⁵ / 25Tフラスコ、5％CO ₂の加湿雰囲気中で38.5℃でそれらをインキュベートします。二日おきに培地を変更します。

ミニブタから関節液の6集

1. 骨髄穿刺するための手順と同様に、大腿関節の上に約15×10センチメートル（長さ/幅）の適切な領域を選択し、滅菌剃刀や電気バリカンを使って髪を除去、消毒手順（ステップ4.1）によって従ってください。
2. 23 Gで3 mlシリンジを挿入触診のランドマーク（膝蓋骨と脛骨稜）の後に関節に針。
   1. 関節における滑液の吸引のための注射器に穏やかな吸引を適用します。 1ミリリットルが、これはミニブタや関節の大きさに応じて変化する - 関節から採取した滑液のおおよその体積は0.5です。滑液の収集量が少なすぎると滑液腔にDPBSを通してフラッシュします。
   2. 直ちに血液による汚染を避けるために注射器を引き抜きます。

収集された関節液からおよびインビトロ栽培7.細胞の単離

1. 吸引滑液から細胞を分離します。
   1. 室温で15ミリリットルコニカルチューブ内のDPBS等量の吸引滑液を希釈します。
   2. 破片を除去するために、40μmのナイロン細胞ストレーナーを用いて希釈滑液をフィルタリングします。
   3. フィルタリング滑膜を含むチューブにDPBSの10ミリリットルを追加します。流体、室温で10分間、400×gで遠心分離して。上清を捨て、DPBSで細胞を2回洗浄します。
   4. 2のセルを配置し、ADMEM 2ml中の細胞ペレットを懸濁- ADMEM 2mlで3×10 ⁵細胞/ 35 mm組織培養皿、および5％CO ₂の加湿雰囲気中で38.5℃でそれらをインキュベート。
2. 孤立した滑液由来MSCのin vitro培養のための手順を繰り返し5.2。

ミニブタの8.ポスト手順ケア

1. 必要に応じて、骨髄採取後、皮膚ステープラーを使用して、単一の縫合糸を用いて骨髄抽出注射部位の皮膚を閉じます。
2. 手順が完了した後、3日間1日1回ミニブタへのエンロフロキサシン（5mg / kg）およびメロキシカム（0.2ミリグラム/ kg）を筋肉内注射を投与します。
3. 手順が完了した後、骨髄および滑液収集部位を消毒3日間、一日一回、0.1％ポビドンヨードを持ちます。慎重な合併症の兆候（ 例えば 、腫れ、膿、または赤み）を監視するために毎日観察します。

フローサイトメトリーを使用した9セルの表現型

1. 継代3 80％コンフルエント - 5 - 、DPBSで細胞を洗浄し、0.25％（v / v）のトリプシン/ EDTA 1mlで扱うMSCは70である場合。細胞が剥離するまで5分 - そして、3 37℃でそれらをインキュベートします。
2. DPBSを10mlを用いて細胞を収穫を15mlコニカルチューブにそれらを転送し、室温で5分間、300×gで、それらを遠心。上澄み液を捨てます。
3. 細胞を固定し、3.7％ホルムアルデヒド溶液10mlに細胞ペレットを懸濁し、分析前に一日4℃でそれらを維持します。
   1. ある日固定した後、DPBSは二回5分毎時間、300×gで遠心分離を用いて細胞を洗浄。上澄み液を捨てます。
   2. 4ミリリットル中に細胞ペレットを一時停止1％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA）を補充し、非特異的Fc媒介性相互作用をブロックするために4℃で1時間ペレットをインキュベートさDPBSの。
   3. 1.5ミリリットルチューブに細胞懸濁液の500μlのアリコートを配布します。
   4. 非結合抗体（CD29及びビメンチン）のために、3分間300×gでの遠心分離によって細胞を洗浄します。上澄み液を捨てます。
   5. 1500μlの中で細胞ペレットサスペンド：一次抗体の100倍希釈をし、4℃で1時間静置します。
   6. 毎回5分間、300×gで遠心分離することにより、1％ウシ血清アルブミンで細胞を2回洗浄します。上澄み液を捨てます。
   7. 二次抗体を抱合フルオレセインイソチオシアネート（FITC）の100倍希釈し、4℃の暗所で1時間のためにそれをインキュベート：1500μlの中で細胞ペレットを中断します。
4. FITC結合抗体（アイソタイプ、CD34、CD44およびCD45）について、centrifuによって細胞を洗浄3分間300×gでゲーション。上澄み液を捨てます。
   1. 1500μlの中で細胞ペレットサスペンド：100 FITC結合抗体を、4℃の暗所で1時間のためにそれをインキュベートします。
   2. 両方の染色条件のために、5分間G×300での遠心分離によってDPBSで2回時間細胞を洗浄します。上澄み液を捨てます。
   3. DPBS500μlの中に細胞をサスペンド、5ミリリットル丸底チューブにそれらを転送し^、8フローサイトメーターを使用して結果を分析します。

結果

ミニブタの骨髄および滑液由来MSCの設立

MSCは、正常（ 図2）骨髄およびミニブタの関節滑膜関節から単離され、 インビトロで増殖させました。滑液のシリンジ吸引が簡単であり、初代細胞のインビトロ培養中に十分な接着性細胞を得ることが可能です。滑膜流体由来MSCの形態は、骨髄由来のMSCと同様であり、両方のMSCは、線維芽細胞、スピンドル形状を有し、均一に付着されています。第三の継代培養が完了した後、それらは、アルカリホスファターゼ（AP）染色陽性発現を有することが観察されました。

骨髄および関節液由来MSCの細胞表現型の評価ミニブタの

ディスカッション

ミニブタは、骨髄および滑液からのMSCの単離を確立するために使用しました。年齢、性別、および疾患などの様々な生理的条件を、排除するために、同質遺伝子背景ドナーからのミニブタは正確に細胞源に依存する特性化を評価するために選ばれました。ブタであることが知られている解剖学的、生理学的、および遺伝的にヒトに類似し、特に、サイズが一致した臓器を作り出すことができるミニブタ。従って、それらは、異種移植^14,15の代替ドナー種とし ​​て使用することができます。ブタおよびヒトからMSCは同じIDOを持っているがMSCは、インドールアミン2、3ジオキシゲナーゼ（IDO）と一酸化窒素合成酵素（NOS）の最近示唆免疫調節プロパティについては、種特異的である免疫抑制を媒介するためのMSCで使用された⁹ 。したがって、MSCの供与体としてブタモデルは、ヒトの治療のためのMSCの免疫応答の重要な洞察を提供するかもしれません。さらに、ブタの幹の研究細胞は、in vitroでのプロセスと人間^16,17におけるそれらの様々な前臨床用途の生物学を理解する上で重要な役割を果たしています。骨...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高度なダルベッコ '修正イーグル培地(ADMEM)	Gibco	12491-023	MSC培地
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)	Gibco	14190-144	Ca2+/Mg2+supsup
ウシ胎児血清	Gibco	16000-044	MSCs培地の成分
Glutamax	Gibco	35050-061	MSCs培地の成分
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	10378-016	MSCs培地の成分
塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)	Simga	F0291	MSCs medium
ウシ血清アルブミン (BSA)	の成分 Sigma	A6003	MSCs medium
Trypsin-EDTA	の成分 Gibco	25200-072	細胞解離試薬
β-メルカプトエタノール		Σ M7522	MSCs培地
の成分 アイソタイプ抗体	BD Pharmingen	BD 550616	アイソタイプコントロール
CD29抗体	BD Pharmingen	BD 552369	インテグリンβ-1 MSCsマーカー
CD44抗体	BD Pharmingen	BD 553133	細胞表面糖タンパク質MSCsマーカー
CD45	BD Pharmingen	BD 340664	造血幹細胞マーカー
CD34抗体	BD Pharmingen	BD 555821	造血幹細胞マーカー
CD90抗体	BD Pharmingen	BD 555595	Thy-1膜糖タンパク質MSCマーカー
MHCクラスII抗体	Santa Cruz	SC-32247	抗原提示細胞マーカー
Vimentin抗体		Sigma-S6389	タイプIII中間フィラメントMSCマーカー
ホスファターゼ	Promega	S3841	5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)とニトロブルーテトラゾリウム(NBT)の混合物
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	密度勾配遠心分離
セルストレーナーBD	Falcon	352340	40 & micro;m ナイロン製セルストレーナー
15ml ポリスチレン製円錐管	BD ファルコン	351095	サンプル収集と細胞分離
35 mmディッシュ	Nunc	153066	細胞培養ディッシュ
骨髄抽出器	GmbH Medizintechnologie, Germany	1145-1W010	TrokaBone, 3.0 x 100
mm ヘマトクリットチャンバー	マリンフェルド	640130	セルカウンティングチャンバー
アトロピン	ジェイルファーマシューティカル株式会社、韓国		トロピン硫酸水和
物アセプロマジン	サム中央値、韓国		麻酔前鎮静剤および制吐薬
メデトミジン	ファイザー		麻酔薬および鎮痛薬
エンロフロキサシン	バイエルヘルスケア、ドイツ		抗生物薬
メロキシカム	獣医学、		炎症薬および鎮痛薬
ソフルラン	ハナファーム、韓国		吸入麻酔
ポビドンヨード	韓国製薬、韓国		滅菌剤
エタノール	シグマ	E7023	滅菌剤
ヘパリン	シグマ	H3393	抗凝固剤
ホルムアルデヒド	シグマ	F8775	細胞固定剤
眼科軟膏	ファイザー		オキシテトラサイクリンHCl ポリミキシンB硫酸塩
循環水ブランケット	ゲイマー・インダストリー		ズ 麻酔中および麻酔後のウォーミングシステム
スキンステープラー	Covidien, USA		縫合糸 スキンクロージャー
CO2 インキュベーター	サーモフォーマ	3111	細胞培養装置
フローサイトメーター	BD	バイオサイエンス	細胞分析装置
Minipig	PWG Genetics Korea, Ltd.	T型	ミニチュアブタ