このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。
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方法論記事
C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
筋強直性ジストロフィー1（DM1）は、筋ジストロフィーの一般的な形式です。いくつかの動物モデルは、DM1のために確立されてきたが、彼らは細胞および分子事象を研究するための効率的な細胞の代替を提供するので、筋芽細胞モデルは依然として重要です。 C2C12筋芽細胞は広く遺伝子トランスフェクション、またはウイルス形質導入に筋形成、抵抗性を研究するために使用されているが、C2C12細胞の研究を妨げています。ここでは、C2C12筋芽細胞および筋細胞分化の誘導に遺伝子を導入するために日常のメンテナンス、トランスフェクションおよび形質導入手順が含まれて最適化されたプロトコルを記述します。まとめると、これらの手順は、最高のトランスフェクション/形質導入効率を可能にするだけでなく、一貫性の分化の結果。筋緊張性ジストロフィーの研究だけでなく、他の筋肉疾患に利益をもたらすDM1筋芽細胞モデルの確立に記載されているプロトコル。
概要
筋強直性ジストロフィー（DM）は、複数のシステム、最も特に心臓および骨格筋1に影響を与える常染色体優性疾患です。この病気、DM1とDM2の2つのサブタイプがあります。 DM1は、より一般的であり、DM2 2よりも深刻な症状を持っています。 DM1の根底にある遺伝的変異は、DMプロテインキナーゼ遺伝子（DMPK）3の3 '非翻訳領域（UTR）に位置するCUGトリプレットリピートの拡大です。影響を受けていない個体でのCUG繰り返し数は対照的に、5から37まで変化し、それが50以上に、そして時にはDM1患者4で数千にまで増加します。その結果、のようなRNA結合タンパク質、マッスルのような1（MBNL1）、CUGBP、及びELAV様ファミリー1（Celf1）、誤調節されています。拡大CUGリピート上の隔離に、MBNL1は、選択的スプライシング5を調節する能力を失います。 Celf1が、一方、6,7アップレギュレートされています。 Celf1の過剰発現は、筋肉の損失に関連付けられていますMBNL1機能の喪失に起因しておらず、衰弱、。 DMPK 3'-UTR CUG拡張、MBNL1の損失、およびCelf1の過剰発現を含むDM1関連の変化をシミュレートする動物モデルは、確立されています。しかし、筋芽細胞にDM1をモデル化することは、特にDM1に関連する細胞および分子事象を解....
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プロトコル
1. C2C12細胞培養
- 20％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを補充した増殖培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））中で100mMのプレートでC2C12マウス筋芽細胞を維持します。 60％コンフルエント - C2C12継代細胞が約50になることを許可します。
- 増殖培地を廃棄3 mLの室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でC2C12細胞を洗浄します。 PBSを削除し、細胞を剥離するために、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 5分- 37°C、3、5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。
- 3mlの増殖培地を添加することによりトリプシンを中和します。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。新規の100mmプレートに懸濁させ、細胞1 mlを加え、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
2. C2C12細胞トランスフェクション/形質導入および選択
- C2C12のプラスミドトランスフェクション
- トランスフェクション前、pまで24時間各トランスフェクションのための6ウェルプレートの1ウェルに遅れて7.0×10 5 C2C12細胞。
注：これは50につながる - トランスフェクシ....
- トランスフェクション前、pまで24時間各トランスフェクションのための6ウェルプレートの1ウェルに遅れて7.0×10 5 C2C12細胞。
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結果
C2C12細胞を、GFP-CUG5またはGFP-CUG200でトランスフェクトしました。薬剤耐性の選択の後、安定したプールは、GFP発現（ 図1A）によって可視化することができる、確立しました。分化した筋芽細胞における筋管形成は、10（ 図1B）を免疫染色重鎖ミオシンによって検出しました。筋管形成の定量化は、融合指数は2.6±1.1％に35.4±4.1％から減少し、筋管領域は、GFP-CUG200（ 図1C）に異常CUG拡大により2.7±0.8％に35.6±2.2％から減少したことを実証しました。融合インデックス及び筋管領域が核の総数は、それぞれ、筋管で覆われた総画像面積の割合で割った筋管（≥2核）における核の総数を介してカウントしました。リアルタイムRT-PCR 10は、異なる筋肉の数の発現を分析するために行きました。MyoD、MyoG、MEF2CとCelf1含むiation関連遺伝子。 CUG5培養物と比較して、CUG20.......
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ディスカッション
C2C12細胞株は、筋形成11-14を研究するためのモデルとして使用されてきました。これらの細胞は、線維芽細胞様の外観を保持し、20％ウシ胎児血清を含む培地中で急速に増殖し、容易に2％ウマ血清15を含む培地中で分化します。速い増殖および分化は、筋形成細胞モデルにおいて有利な特性です。ここでは、C2C12細胞にcDNAを、3'-UTR、およびshRNAをを導入するプラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクターの使用を実証します。トランスフェクション/形質導入および分化の一貫性の維持のための重要なポイントは以下の強調表示されます。
毎日の細胞の維持における細胞密度が非常に重要です。 70％コンフルエンス - これらの細胞は、50の下で培養される必要があります。一晩放置したときにより短い集団倍加時間に、高合流（> 70％）C2C12文化が自然に分化します。自然発生的に分化した細胞の割合は小さいかもしれないが、存在分化した細胞のその後の分化実験の不一致に貢献していきます。さらに、低継代数を有する新たに解凍したC2C12細.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
試薬について、ベイラー医科大学のトム・クーパー博士、ウィスコンシン大学マディソン校のマニ・S・マハデヴァン博士、ジュネーブ大学のディディエ・トロノ博士に感謝します。この研究は、ヒューストン大学のスタートアップファンド(YL)、米国心臓協会の助成金(YL、11SDG5260033)、および中国国立自然科学基金会(XP、81460047)によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM、高グルコース | Life Technologies | 11965-084 | 培養培地 |
| 用 Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for 培養培地 |
| スリン ウシ膵臓 | Sigma Aldrich | I6634-100MG | 分化培地 |
| 血清 | Atlanta Biologicals | S12150 | 分化培地 |
| 用 FuGENE HDトランスフェクション試薬 | Promega | E2311 | トランスフェクション用 |
| G418硫酸塩 | ゴールドバイオテクノロジー | G-418-10 | 薬剤耐性選択用 |
| ピュロマイシン二塩酸塩 | Sigma Aldrich | sc-108071 | 薬剤耐性選択用 |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x)Life | Technologies | NP00061 | western blot |
| NuPAGE MES SDS Running buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | ウェスタンブロット用 |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE ヘルスケアライフサイエンス | 10600015 | スタンブロット用 |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | 一次抗体 免疫染色用 |
| ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、Texas Red-X コンジュゲート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | T-862 | 二次抗体免疫染色 |
| ワンステップ qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 抗体 (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | ヤギ ポリクローナル IgG ローディング制御用 |
| 293T Ecopack | レトロウイルス調製のための | Clontech | 631507 |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | レトロウイルス調製のための空のレトロウイルスベクターpMSCV-Celf1Flag-puro |
| 家は | レトロウイルス調製に使用されたレトロウイルス調製に使用Celf1Flagをコードするレトロウイルスベクターをコード化していません | ||
| Didier Tronoからの贈り物 | ウイルス調製には | 利用できません | |
| ディディエ・トロノからの | pMD2.G | レンチウイルス製剤に | 利用できません |
| MSマハデヴァンからの | GFP-CUG5 | 参照10 で | 詳細が利用できません |
| GFP-CUG200 | M.S. Mahadevanからのギフト | は、 | 参考文献10 |
| トリトン X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma Aldrich | P6148 | 染色用 |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | 免疫染色用 |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 染色用 |
参考文献
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al.
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