中に組み込み血管新生による組織工学インビボティッシュ・エンジニアリング商工会議所

サマリー

これは、組織工学チャンバー内の顕微動動静脈ループまたはフロースルー椎弓根構成を使用して、in vivo血管新生組織を構築するためのガイドラインです。生成された血管新生組織は、臓器の再生や組織欠損の置換、薬物試験や疾患モデリングに利用できます。

要約

再建手術では、複雑で自家復興の現在の方法に代わる、コスト高と貿易別のものの欠陥のための臨床的な必要性があります。組織工学は、この需要の増加に対処するための約束を保持しています。しかし、ほとんどの組織工学戦略が悪いため、血管新生の安定した機能的組織代替物を生成することができません。本論文では、灌流動脈と静脈のいずれかの動静脈ループまたはフロースルー椎弓根構成としては、保護された中空室の内部に向けられている固有の血管新生のin vivo組織工学室モデルに焦点を当てています。この室ベースのシステムでは、血管新生発芽は、動静脈の血管から発生し、このシステムは徐々に線維血管組織でチャンバ空間を埋め駆動虚血性および炎症性の内因性の細胞遊走を魅了しています。外因性の細胞/チャンバーの構築時に行列注入は、セルシュールを強化しますvivalと開発工学組織の特異性を決定します。我々の研究は、この室モデルがうまくそのような脂肪、心筋、肝臓などのような様々な組織を生成することができることを示しています。しかしながら、修正及び改良は、標的組織の形成を一貫して再現可能であることを確認する必要があります。この記事では、生体内で二つの異なる血管組織工学室モデルの製造のための標準化されたプロトコルについて説明します。

概要

機能的な血管化組織を作製する組織工学アプローチを使用して再生医療における新興のパラダイムである。損傷した組織または欠陥のある臓器の置換のために新しく健康な組織を操作するために^1,2の多くのアプローチが開発されている^、3-6実験で小動物モデルで有望な臨床的可能性^。7,8。しかし、血管新生は、臨床的に関連する大きさの組織を成長させる可能性を制限する組織工学のための大きな課題の一つである^。9

組織は新しい血管が受信者血管床から成長外因性経路のいずれかに従うと、移植された組織は^、10または脈管構造が成長し、新たに開発組織と一体となって展開する内因性血管新生経路を構築を通じて侵入する血管新生化するための現在のアプローチ^。11外因性アプローチ伝統的な足場上に細胞を播種することを含みます血管の内部成長が遅すぎると非常に薄いインプラント（としてin vitroで 、以前に培養培地により供給される栄養素は、血液循環から供給されることを期待して生きている動物に完全な構築物を注入する^。12,13コンセプトは<単純化されて1〜2ミリメートルの厚さ）が生存したままになります。十分かつ迅速な血管新生によって栄養と酸素を提供することは、骨、筋肉、脂肪および固体臓器など、より複雑で、より大きな組織工学代用を成長させるための任意の成功した試みの心臓部である^。14,15組み込み血管新生は、の可能性を提供していますより大きな構築物は、その拡大の血液供給に見合ったプログレッシブ組織の成長によって開発します。一つのデザインは、細胞播種足場を伴うまたは伴わない血管茎のチャンバ内へのin vivoでの移植である^。5,6これは厚い本質的に血管新生した組織の生成のための新しい手順への道を開いた^。16,17

より最近では、戦略は、移植前に、事前血管を通す組織移植片に開発されてきました。これらの組み込まれた血管ネットワークは、移植厚い組織移植片のすべての部分の生存率を改善するための完全な血液供給の迅速な提供を可能にする注入でホスト血管と吻合することを目的としている^。18

私たちは、灌流血管茎と細胞含有生体材料を含む皮下移植半硬質の密閉チャンバを伴う小動物におけるインビボ血管組織工学モデルを開拓してきました。室は、移植された血管からの血管新生発芽を刺激し、虚血性環境を作成します^。3血管茎が再構成された動静脈ループまたは無傷のフロースルー動脈と静脈をいずれかであることができる^。3-6,19この血管茎の芽機能と豊富な動脈を両方の芸術でリンク-capillary、静脈網erioleと静脈は血管茎で終わる^。3,20また、周囲の中空の支持室が潜在的に機械的な力を変形させることから、発達中の組織を保護し、血管新生を高めるために、虚血性ドライブを延長する^。3,21,22血管茎は単純に移植された場合室内の保護された空間内の正常組織ではなく、血管新生発芽は通常の創傷と同じタイムラインに沿って停止し、新しい組織が椎弓根の周りに蓄積されません。調べでは、支持的脈管構造とし、臨床的に関連する大きさの3次元機能に血管新生組織構築物を生成するために、このin vivoでの設定を使用しています^。4,23さらに、その無傷の血管茎と工学血管組織構築物は、損傷部位でのその後の移植のために採取することができます^。24,25より臨床的に実現可能なシナリオは、復興のための決定的なサイトでチャンバを作成することになります胸としてUCH。したがって、この新規組織工学アプローチは、再建手術のための機能的な標的組織の新たな供給源を提供するための臨床的可能性を有することができる^。26-28

以下のプロトコルは、異なる動物モデルで適応および血管新生、マトリックス産生、および細胞遊走および分化の複雑な過程を調べるために使用することができるラットにおけるインビボ血管新生組織工学室を構築する一般的なガイドを提供します。

プロトコル

ここで説明するプロトコルは、セントビンセント病院メルボルン、オーストラリアの動物倫理委員会によって承認されており、オーストラリア国立保健医療研究評議会のガイドラインに厳守下で行いました。

注：二室プロトコールを以下に記載します。 2つの異なるモデルおよびその特定のチャンバ設計は、 図1に示されている。チャンバは、（1）（ラット動静脈ループ室モデルの場合）、ポリカーボネートで作られています。これは、内径13ミリメートル、高さ4ミリメートルを有する円筒形です。壁内の1つのポイントでウィンドウが椎弓根のために妨げられることなくアクセスすることができます。 （ラットのフロースルー茎室モデルの）第2のモデルでは、チャンバは、アクリル製の矩形（10×4×8 mm ³で内部寸法）です。それは、チャンバを犯すように大腿動脈および静脈に適応するように両側に2つの1.5ミリメートルの開口部を有します。

1.ラット動静脈ループ商工モデル（Oneチャム動物当たりBER）

注：手術を開始する前に、すべての機器が適切に滅菌されていることを確認してください。同様に、滅菌タオル上の機器の残りを確保し、手続き中の汚染を避けるために、手術野から合理的な距離にあります。

1. 手術のための動物の準備
   1. 動静脈ループを作成するための血管のサイズが大きいために、少なくとも250gのラットを使用してください。
   2. 4％のイソフルラン吸入で動物をAnaesthetize。つま先ピンチに無応答性を評価することによって麻酔の十分な深さを裏付けます。麻酔した後、適切に2％イソフルランと手順を通して麻酔動物を維持します。
   3. 温暖化パッド上に仰臥位で動物を置き、手術中の乾燥を防ぐために、目に無菌潤滑剤を適用します。
   4. 電気かみそりを使用して、両方の股間を剃ると湿ったガーゼで髪を削除します。
   5. クロルヘキシジンと手術部位をPREP/ 70％エタノール溶液および無菌タオルで動物をドレープ。鎮痛剤としてカルプロフェン（5 mgの/ kgを皮下）の単回投与を管理します。
2. 大腿静脈グラフトの収穫
   1. ＃15ブレードを使用して、鼠径靱帯に左鼠径部に平行に長さ4cmの皮膚切開を行います。これは、鼠径部脂肪パッドを露出させます。
   2. 上腹部管に基づいて、その血管茎に取り付けられ、それを残してはさみで円周方向に脂肪パッドを通してカット。
   3. マイクロはさみを使用して、腹壁とその下にある大腿血管の間にフィルム状の結合組織の癒着を解放します。
   4. 腹壁に開創器を置き、内側引き出します。これは、鼠径靱帯と大腿血管の全長を公開しています。
   5. マイクロ鉗子を使用し、湾曲したハサミを静かに引っ張り、切断によって上腹部静脈を分析し、その周囲の脂肪からそれを分離します。ループを構築するときに、この静脈は、テザーとして機能します。
   6. Usinグラムマイクロ鉗子湾曲マイクロハサミは大腿血管や神経の心窩部支店への分岐末端に鼠径靭帯からのすべての方法を含む血管周囲鞘を開きます。
   7. マイクロ鉗子を使用して、その外膜によって大腿静脈をピックアップし、静かに周囲の組織および添付動脈からそれを分離します。離れて組織を引っ張り、それを介して切断することにより、マイクロ鉗子湾曲ラウンド尖ったマイクロハサミでこれを行います。
      注：これは血栓症の脆弱性が発生内膜への外傷を引き起こす可能性があるとして、静脈壁の全体の厚さをつかむことはありません。
   8. ライゲーション側枝は10/0ナイロン縫合糸で切開中に発見されたまたはバイポーラ凝固でそれらを凝固します。
   9. 大腿静脈完全に無料で、4/0シルク縫合糸で、その近位端および遠位端を連結。少なくとも10ミリメートルの長さの静脈グラフトを取得することを確認しますと、男のロープのテザーとして使用する上腹部の枝の約0.5センチメートル長を含みますチャンバー内の開ループを保持します。
   10. マイクロ鉗子とストレートマイクロはさみを使用して、静かに引き出し、切断することにより、移植片の端部から外膜をトリミングします。これはまた、顕微吻合前に、後に行うことができます。
   11. ヘパリン添加生理食塩水（ヘパリンの10 U / ml）で静脈グラフトをフラッシュし、溶液中で休むようにそれを残します。連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じます。
3. 商工会議所の動静脈ループと移植の作成
   1. 繰り返しは、対側肢にまったく同じ方法で、1.2.4に1.2.1を繰り返します。
   2. マイクロ鉗子を使用して、上腹部動脈と静脈の両方を分析し、単離周囲の脂肪パッドを形成します。静かに血管から組織を引っ張ることによってこれを行います
   3. マイクロ鉗子を使用して、その外膜により大腿動脈をピックアップし、周囲の組織からそれを解放します。マイクロ鉗子湾曲ラウンド尖ったマイクでこれを行います離れて組織を引っ張り、それを切断することにより、roのはさみ。その側枝を結紮または凝固。
   4. 4/0絹縫合糸を用いて、上腹部管の出現に大腿動脈と静脈の先端を連結。
   5. 大腿動脈と静脈のそれぞれの近位に単一のクランプを置きます。鋭いストレートマイクロはさみを使用して、上腹部枝の出現に各容器の先端でクリーンな横カットを行います。船の下の滅菌プラスチックコントラストの背景を配置します。
   6. すべての血液が内腔から除去されるまで、ヘパリン化生理食塩水の寛大な量と激しく血管をフラッシュします。
   7. 術野に静脈グラフトを持参し、必要に応じて、ステップ1.2.10に従って船 '末端から任意の冗長な外膜を除去します。
   8. 10/0ナイロン縫合糸と顕微吻合の両方を実行します。大腿静脈と大腿動脈への遠位端部に静脈グラフトの近位端を吻合。これがf血液が流れるようになります静脈グラフトの内側バルブから抵抗なく静脈側への動脈をROM。
      注：任意のねじれずに大腿血管とその自然な位置にある静脈グラフトの残りの部分を確認してください。
   9. 両方の吻合部に漏れがないか確認してください。上に脂肪の小片を置き、静かに5〜10分間圧縮することにより、吻合部位から出てくる非脈動血のように見える小さな漏れを解決します。急速にフィールド全体をあふれさせるより大きな脈動漏れが追加ステッチが必要になります。
   10. 動静脈ループの開存性を確認してください。大腿動脈の穏やかな閉塞は、大腿静脈内の同じがそれをガブガブ飲むべきである、それが縮小する必要があります。
   11. ねじれやよじれのないその自然な位置にある後者の休息と動静脈ループの下に組織工学室のベースを置きます。
   12. 6/0ナイロン縫合糸で鼠径靭帯およびその下の筋筋膜に、チャンバのベースを固定します。
   13. 上に蓋を置きベース大腿血管は、ノッチ（室側の窓）を通ってチャンバに入るようにします。蓋を閉じたとき、それはテザーを所定の位置に動静脈ループを保持するように作用チャンバーベースと蓋との間で、心窩部枝をキャッチしていることを確認します。
   14. 連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じます。
   15. 動物は加温パッド上で麻酔から回復することを可能にします。
   16. それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。同様に、完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。 24時間後、鎮痛剤としてカルプロフェン（皮下5ミリグラム/キログラム）の別の単一用量を投与。
   17. 5日間のための局所抗生物質軟膏で傷口を扱います。傷口が開いている場合、1.1.5を介してステップ1.1.2のように動物を麻酔し、1.3のように傷口を閉じます0.14。毎日、動物の健康状態を監視します。動物はinacitivity、食欲不振、体重減少及び色の損失の複数の適度な兆候を示している場合（23 G針で0.25ミリリットルで163ミリグラム/ kg）を腹腔内lethabarb注入の致死量を用いて動物を安楽死させます。

2.フロースルー椎弓根商工会議所（動物ごとに2つのチェンバース）

1. 手術のための動物の準備
   1. 繰り返しは、1.1.4を介して1.1.1を繰り返します。二つのチャンバは、単一のラットの双方の鼠径部領域に移植することができます。
2. 大腿血管の単離と商工会議所の挿入
   1. 繰り返しは、1.2.8を介して1.2.1を繰り返します。
   2. 動脈と完全に周囲の組織から解放され、その枝を結紮静脈の両方で、術野にチャンバをもたらします。
   3. チャンバーベースがないねじれやよじれがないことを確認することの対応するスリットに無傷の大腿血管のそれぞれを置きます。
   4. attachiによってチャンバを閉じますベースに蓋をngの。連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じ、前述のように、動物が回復することを可能にします。

3.チェンバースの収穫と組織処理

1. 実験の時間点（4-6週間移植後）に到達したら、ステップ1.1.2のように動物を麻酔し、1.1.5まで手順1.1.3を繰り返します。
2. ＃15ブレードを使用して傷を開き、チャンバが完全に露出するまでハサミで組織を切断。
3. その後、遠位方向に血液を牛乳、静かに2マイクロピンセットで血管を閉塞し、最終的には近位鉗子を解放：血管開通のための構築物およびテストに大腿骨近位部の血管を公開します。容器は再び血液でいっぱいになると、これは、開通性を確認します。動静脈ループの場合には近位大腿血管を結紮し、両方の近位および遠位番目の場合には電子フロースルー設定、および一括含む組織でチャンバーを削除します。
4. 実験の最後に、（23 G針で0.25ミリリットルで163ミリグラム/ kg）を腹腔内lethobarb注入の致死量を用いて動物を安楽死させます。
5. 24時間室温で4％パラホルムアルデヒド中で組織を修正しました。ディバイド複数の横断切片に組織（1-2 mm厚）、パラフィンワックスまたはそれぞれパラフィン切片のための最適な切削温度化合物（5ミクロン）または凍結切片（10μm）を、中に埋め込 ​​む^{。3,4,8,17,22、 24}
6. 組織の一般的な形態を調べるために、このようなヘマトキシリン​​およびエオシンなどの日常的な組織学的染色を実行します。例えば心筋細胞のための心筋トロポニンTの免疫染色を関心^{、3,4,8,17,22,24,29}の細胞型を同定するための特定の抗体を用いて免疫組織化学染色を行ってください。

結果

上記のプロトコールに記載されるように、組織工学室の顕微作成を行いました。チャンバ内部で発生組織3.種々の組織タイプの正常インビボ血管新生室（ 図2）を使用して操作されたプロトコルのステップで説明するように組織学的に調べることができます。これらは、新生児ラット心筋細胞（ 図2A）、脂肪組織の細胞外マトリックス（ 図2C）に由来ハイドロゲルラット骨格筋芽細胞（ 図2B）、および脂肪組織と筋肉組織との心臓組織が ​​含まれます。

組織の形態学的評価は、ステレオ治験システムまたはImageJソフトウェアのいずれかで行うことができる^{。3,4,8,17,22,29}様々な組織成分の定性的評価に加えて、立体学システムは、公平な定量化を可能にします特定の組織体積のfication。例えば、レクチン...

ディスカッション

微小循環のエンジニアリングは、現在、二つのアプローチを通して、本質的に検討されています。最初は、移植されたときに、ホストの血管床からの毛細血管は、このように周囲に栄養素だけでなく、の配信を保証する、吻合と呼ばれるプロセスを通じて移植構築物のものと接続するようにin vitroでの構文内で高度に相互接続血管網を開発したが含ままた、コア^。21,32,33にこれは前血管新生と呼ばれています。毛細管発芽前または同時に移植された細胞の分化と組織の成長とのいずれかが発生するように第2のアプローチは、 生体内で直接宿主自身の血管系を強化しようとします^。17,34

ここで提示インビボ組織工学室プロトコルでは、いずれかの動静脈ループまたはフロースルー茎構成と、動脈と静脈を配置することによって、後者の概念を活用します。保護された空の空間内に、時間をかけて新しい毛細血管の有意な発芽および形成を可能にするチャンバ³の利点は、インビトロ操作の（1）存在しないことを含みます...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 15ブレードメス		BB515
1歯付き広告鉗子	ブラウン	BD527R
1ニードルホルダー	ブラウン	BM201R
1バイポーラ凝固器	ブラウン	US335
1マイクロニードルホルダー B-15-8.3	S &T	00763
1マイクロ拡張鉗子D-5a.2	S&T	00125
1 マイクロジュエラーズフォーセプス JF-5	S &T	00108
1マイクロハサミ - ストレートSAS-11	S &T	00098
1マイクロはさみ - 湾曲SDC-11	S&T	00090
2シングルクランプB-3	S&T	00400
2 10/0ナイロン縫合糸	S&T	03199
1 6/0 ナイロン縫合糸	ブラウン	G2095469
2 4/0 シルク縫合糸	ブラウン	C0760145
キシロカイン 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
ヘパリンナトリウム	Dealmed		272301 5,000 UI/ml
リンガー乳酸	バクスター	JB2323	500 ml
1 ドーム型組織工学チャンバー	カスタムメイド
1フロースルーチャンバー	カスタムメイド
レクチンI、グリフォニアシンプリシフォリア	ベクターラボラトリーズ	B-1105	1.67 μg/ml
トロポニン T 抗体	Abcam	Ab8295	4 μg/ml
ヒト特異的Ku80抗体	Abcam	Ab80592	0.06 μg/ml
デスミン抗体	Dako	M0760	2.55 μg/ml
Cell Tracker CM-DiI dye	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 細胞
Lethabarb (ペントバルビトンナトリウム)	Virbac Animal Health	LETHA450	325 mg/ml
ヒートパッド flexible	レッドゾーン暖房	RZ/ミディアム