方法論記事

カチオン性およびアニオン性リポソームを用いてCNSへの治療用のsiRNAの送達

DOI：

10.3791/54106

⸱

2016年7月23日

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの目標は、神経標的ペプチドを持つカチオン性/アニオン性リポソームをCNS送達システムとして使用し、siRNAがBBBを通過することを可能にすることです。 siRNAのような治療のための送達システムの最適化は、プリオンや他の神経変性疾患に対するより多くの治療選択肢を可能にするでしょう。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プリオン病は、正常な細胞のプリオンタンパク質（PrPC）が異常なプロテアーゼ耐性異性体に誤ってフォールディングされることから生じます。 野生生物の個体群におけるプリオン病の出現と、人間の健康に対する脅威の増大により、これらの疾患の治療法を見つけるための努力が増加しています。 最近の研究では、感染性のPrPRes異性体を阻害したり、正常な細胞のプリオンタンパク質をダウンレギュレーションしたりできる多数の抗プリオン化合物が見つかっています。 しかし、これらの化合物のほとんどは、脳組織におけるPrPRes形成を効果的に阻害するために血液脳関門を通過せず、ニューロンのPrPCを特異的に標的とせず、動物やヒトの被験者に使用するには毒性が高すぎることがよくあります。

私たちは、血管内に送達され、ニューロンのPrPCを標的としたsiRNAがより安全で効果的な抗プリオン化合物であるかどうかを調査しました。このレポートでは、2つのsiRNAリポソーム送達ビヒクルを作製し、PrP siRNAをパッケージ化してニューロン細胞に送達するためのプロトコルについて概説します。 2つのリポソーム送達媒体は、1)カチオン性リポソーム(LSPC)を使用した複合体siRNAリポソーム製剤、および2)カチオン性または陰イオン性リポソーム(PALETS)を使用したカプセル化siRNAリポソーム製剤です。 LSPCの場合、負に帯電したsiRNAはカチオン性リポソームに静電的に結合しています。 正に帯電したペプチド(RVG-9r[狂犬病ウイルス糖タンパク質])が複合体に追加され、血液脳関門(BBB)を介して中枢神経系(CNS)のアセチルコリン発現ニューロンにリポソーム-siRNA-ペプチド複合体(LSPC)を特異的に標的とします。 PALETS(ペプチドアドレス付きリポソームカプセル化治療用siRNA)については、カチオン性脂質とアニオン性脂質をPrP siRNAによって再水和しました。この手順により、siRNAがカチオン性またはアニオン性リポソーム内にカプセル化されます。 ここでも、RVG-9r神経ペプチドをリポソームに結合させて、siRNA/リポソーム複合体を中枢神経系に標的とした。 これらの製剤を用いて、AchR発現ニューロンにPrP siRNAを導入させることに成功し、CNSにおけるニューロンのPrPC発現を減少させました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プリオンは、CNSに影響を与える深刻な神経変性疾患です。プリオン病は、PrP RESと呼ばれる感染性異性体によって、正常な細胞プリオンタンパク質、のPrP Cのミスフォールディングに起因します。これらの疾患は、人間1-3でシカで羊、慢性消耗病におけるスクレイピー、牛における牛海綿状脳症を含む種の多種多様な影響を及ぼし、およびクロイツフェルト・ヤコブ病。プリオンは、シナプスの損失で始まる神経変性を引き起こし、空胞化、グリオーシス、ニューロン損失、およびプラーク沈着に進行します。結局、4個々の動物/の死に至ります。数十年にわたって、研究者は、プリオン病の進行を遅らせるまたは停止することを意味する化合物を調査しました。しかし、研究者は、成功した治療や効果的な全身送達ビヒクルのいずれかを見つけていません。

内因性のPrP Cの発現は、プリオン病の発症のために必要とされる5 アップ。したがって、減少または排除するのPrP Cの発現が遅延または疾患の改善をもたらすことができます。いくつかのグループは、プリオン病でのPrP C発現レベルの役割を調べるために、マウス脳組織に直接shRNAを発現のPrP Cの減少したレベルまたは注入レンチベクターを用いてトランスジェニックマウスを作成しました。これらの研究者は、プリオン病の進行性の神経病理の停止をもたらし、動物6-9の寿命を延長し、ニューロンのPrP Cの量を低減することがわかりました。我々は、マウス神経芽腫細胞10内のPrP RESのクリアランスのことのPrP C siRNA処理の結果を報告しています。これらの研究は療法の使用は、低分子干渉RNA（siRNA）、切断するmRNAのように、のPrP Cの発現レベルを減少させるために十分なプリオン病の進行を遅らせることができることを示唆しています。しかし、プリオン病について調査し、最も治療法は実用的ではない方法で配信されていました臨床設定インチこのために、siRNA療法は、CNSに静脈内に送達し、標的とする全身性送達システムを必要とします。

研究者らは、遺伝子治療製品の送達ビヒクルとしてのリポソームの使用を研究しました。カチオン性およびアニオン性脂質は、両方の、リポソームの形成に使用されます。カチオン性脂質とDNA / RNA間の電荷の差が効率的なパッケージングを可能にするためのカチオン性脂質は、より広くアニオン性脂質よりも使用されています。カチオン性脂質の他の利点は、他の脂質11-14より容易に細胞膜を通過することです。しかし、カチオン性脂質はアニオン性脂質13,14よりも免疫原性です。そのため、研究者らは、リポソーム中のアニオン性脂質にカチオンを使用してからシフトし始めています。遺伝子治療製品を効率的にDNA / RNA分子15-19を凝縮正に荷電したペプチドの硫酸プロタミンを用いてアニオン性リポソーム中にパッケージングすることができます。アニオン性LIPIので、DSは、彼らが循環時間を増加していることがあり、より多くの動物モデル13,14に許容され得るカチオン性脂質よりも免疫原性が低いです。リポソームは、リポソームに結合しているペプチドを標的に使用して特定の組織を標的とします。ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するRVG-9R神経ペプチドは、CNS 17-20にsiRNAおよびリポソームを標的化するために使用されてきました。

このレポートは、3 siRNA送達車を生産するための、および神経細胞（ 図1）に対するsiRNAをパッケージ化して提供するためのプロトコルの概要を説明します。リポソームのsiRNAペプチド複合体（LSPCs）は、siRNAおよび静電リポソームの外表面に付着したRVG-9Rターゲティングペプチドを有するリポソームから構成されています。ペプチドは、RVG-9Rが共有脂質、PEG基に結合して、siRNAおよびリポソーム内に封入されたプロタミンで構成されている治療のsiRNA（PALETS）をカプセル化されたリポソームを取り上げました。 LSPCsとPALETを生成するには、以下の方法を使用してSは、のPrP C siRNAは、治癒または、実質的にプリオン病の病態の発症を遅延させるための途方もない約束を保持している神経細胞で90％、最大のPrP Cの発現を低下させます。

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プロトコル

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すべてのマウスは、コロラド州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って、ラボ動物ケア・インターナショナルの評価と認定協会の認定を受け、研究室動物資源で飼育し、維持しました。

LSPCsの調製

  1. 1 DOTAP（1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム - プロパン）：LSPCsのためのコレステロール比1を使用してください。 1クロロホルム：フラスコ内のメタノール溶液4ナノモルのリポソーム製剤については、DOTAPの2ナノモルと1の10ミリリットルへのコレステロールの2ナノモルを混ぜます。
  2. ドラフト内でN 2ガ ​​スを用いたメタノール溶液：クロロホルムの9ミリリットルを蒸発させます。ガスなしで一晩換気フード内の溶媒の最後の1ミリリットルを蒸発させます。フラスコの底に薄い脂質フィルムを観察します。
  3. 熱、55℃に10％ショ糖溶液10mlを。
  4. GEながら、 すなわち、1ml /分、徐々に薄い脂質フィルム上に加熱された10％スクロース溶液を注ぎntlyフラスコを旋回。脂質分子はゲル - 液相に残るように55℃での脂質と10％のショ糖、フラスコを維持します。多重膜小胞（MLV）の形成での再水和をもたらします。
  5. 脂質がリポソームをサイジングする前に、少なくとも1時間、55℃で再水和することができます。
  6. 1.0μmのフィルターを製造者の指示に従って、押出機を組み立てたり、サイジングのために1.0μmのシリンジフィルターを使用しています。
  7. 押出機での注射器のいずれかに加熱されたリポソーム懸濁液の1ミリリットルを追加し、2つのシリンジ11時間の間のサスペンションを渡します。懸濁液を11回通過した後に開始し、注射器よりも反対注射器であることを確認します。
  8. サイズその後、0.45μmの0.2μmのフィルターを通して再びリポソームは、大型単層小胞（LUVを）を生成します。簡単にサイズ調整のために加熱し、リポソーム懸濁液を保管してください。
  9. 20μM（4200μlで4ナノモルリポソーム懸濁液（200μM）の20μLをインキュベート室温で10分間ナノモル合計）株式のsiRNA溶液。
  10. RTで10分間のsiRNA /リポソーム溶液と500μM（40ナノモル合計）株式RVG-9R液80μLをインキュベートします。 LSPCsはできるだけ早く使用されるべきであるが、調製後数時間まで使用することができます。調製後、数時間のために4℃で保存しLSPCs。

PALETSの調製

  1. 40：：DSP​​E（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）のいずれかの5のモル比：コレステロール：DSPE-PEGまたはDOTAP：コレステロール：DSPE-PEG PALETSのための55を使用してください。 1クロロホルム：フラスコ内のメタノール溶液4ナノモルのリポソーム製剤については、2の10ミリリットルにDSPEまたはDOTAPのいずれかの2.2ナノモル、コレステロールの1.6ナノモル、及びDSPE-PEGの0.2ナノモルを混ぜます。
  2. ステップ1.1以上1.2で説明したように正確にリポソーム懸濁液を準備します。 1×PBS 10ml中DSPEリポソームを再水和を1ml /分を追加して、75℃に加熱しました。脂質は時のために75℃で再水和することを許可しますサイジングの前に少なくとも1時間。
  3. サイズステップ1.6から1.8に記載とおりにリポソーム懸濁液。
  4. 4ナノモルのそれぞれのピペットを20μl（200μM）リポソーム懸濁液の単一使用のアリコートへのDOTAPおよびDSPEリポソームはサイズされた後、およびベンチトップ凍結乾燥機（ 図2）を使用して、30分間凍結乾燥。
  5. DSPE PALETSリポソーム中に封入されるsiRNAをRTで10分間、硫酸プロタミンの26.6μM溶液を1.4μlの20μM（4ナノモル合計）株式のsiRNA溶液200μlをインキュベートします。
  6. siRNAの4ナノモルストック溶液の200μlでDOTAP PALETSリポソームを再水和またはsiRNA /プロタミン溶液を201.4μlのDSPE PALETSリポソームを再水和。 RTで10分間リポソーム/ siRNA溶液をインキュベートします。
  7. 60mMの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）の10μLをDOTAPとDSPE PALETS両方用リポソーム/ siRNA溶液の溶液を加えます。
  8. 両方のDOTAPおよびDSPE PALETS用リポソーム/ siRNA溶液に150mMのN-ヒドロキシ（スルホNHS）溶液10μlを加えます。
  9. RTで2時間のsiRNA /リポソーム懸濁液とEDCおよびスルホNHSをインキュベートします。
  10. RTで10分間この溶液を架橋するsiRNA /リポソームと500μM（40ナノモル合計）株式RVG-9R液80μLをインキュベートします。
    注：EDC /スルホNHSはPEG脂質に共有結合にRVG-9Rを可能にします。調製後、数時間以内にPALETSを使用してください。調製後、数時間のために4℃で保存しPALETS。
  11. PALETSのsiRNA封入効率を決定するには：
    1. 260nmで設定し、分光光度計を使用してプロタミン及びリポソームの添加前および後のsiRNAの濃度を測定します。
    2. 50kDaの遠心フィルターを使用してリポソーム/カプセル化されたsiRNAの懸濁液から封入されていないのsiRNAをフィルタリングします。 20分1,000×gで遠心分離します。
    3. の濃度を測定260nmで分光光度計を使用して、ろ液および保持液中のカプセル化されたsiRNAの濃度でカプセル化されていないのsiRNA。

3. LSPCsまたはPALETSをマウスに注射

  1. 血管系を拡張するために熱ランプに5〜10分間、マウスを公開します。
  2. 5〜10分間注入前、および注入中に2から3パーセントイソフルオラン/酸素流量でマウスを麻酔。動物がもはや通院で、呼吸がつま先のピンチを実行して、減速しているときに麻酔を確認していません。尾静脈にアクセスするには、その背面または側面にマウスを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を使用してください。
  3. ワイプ/ 70％エタノールで尾をスプレーし、26 Gインスリン注射器を用いて、マウスの尾静脈にLSPCsまたはPALETSの300μLを注入します。尾静脈に遠位に注入開始し、静脈が崩壊または破裂場合近位に移動します。
  4. それは胸骨横臥位を維持するまで、クリーンなケージにマウスを置きます。 MOを置かないでくださいそれは完全に回復するまで、他のケージの仲間と一緒に使用。マウスは、5〜15分で回復する必要があります。彼らは、回復に時間がかかる場合には、体温を維持するために加温パッド上又は加熱ランプの下に配置することができます。マウスは、過熱から保護するために注意深く監視する必要があります。
  5. 麻酔が切れる確実にするために数時間注入後に動物を監視し、治療の全く悪影響はありません。 LSPCsまたはPALETSは、少なくとも24時間循環させます。

フローサイトメトリーを介して、タンパク質発現の4解析

  1. 15分間、20％CO 2の流量でマウスを安楽死させます。
  2. ハサミを用いてマウスの皮膚と頭蓋骨を切り取ることにより、脳の半分の半球を解剖。ピール離れて半分離れトングやハサミの先端を使って頭蓋骨から脳の半球。
  3. プレス半分のFACS緩衝液2.5ミリリットルを使用して、40μmのメッシュセルストレーナーを介して、各マウスからの脳の半球（1倍、シリンジのプランジャーを有するペトリ皿にPBS、1％ウシ胎児血清、10mMのEDTA）。
  4. FACS緩衝液のさらに2.5 mlの細胞ストレーナーとペトリ皿をすすぎます。氷上で15ミリリットルコニカルチューブに単一細胞懸濁液を入れてください。
  5. ピペットで350×gで5分間1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機に5ミリリットル単一細胞懸濁液100μl。上清を捨て、FACS緩衝液1ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 5分間、350×gでスピン。 FACS緩衝液の別の1ミリリットルで繰り返します。氷上で細胞懸濁液を保管してください。
  6. 1100μlの細胞をインキュベート：FACS緩衝液中の0.5mg / mlのラット抗マウスFcブロックの100倍希釈を氷上で30〜60分間。ペレット化し、ステップ4.5のように細胞を洗浄します。氷上で細胞懸濁液を保管してください。
  7. 30〜60分間氷上でFACS緩衝液中で7％マウス血清中のマウスのPrP Cに対する20 / mlの蛍光抗体を100μlで細胞をインキュベートします。ペレット化し、ステップ4.5のように細胞を洗浄します。細胞懸濁液を保ちます冷やして。
  8. ペレットおよび1分RBC溶解緩衝液（1×PBS、155 mMのNH 4 Cl を 、12 mMの炭酸水素ナトリウム、0.1mMのEDTA）1ml中に再懸濁細胞。ステップ4.5のようにペレットとは、FACS緩衝液1mlに細胞を懸濁します。氷上で細胞懸濁液を保管してください。
  9. 以前10記載されているように、フローサイトメーターを使用してのPrP Cの発現を解析。ゲートは、全細胞集団から細胞を生きています。ゲートのPrP C + MFI（蛍光強度中央値）を決定するために、生細胞集団由来の細胞。

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結果

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アニオンPALETS内のsiRNAのカプセル化の効率を高めるために、siRNAは、プロタミンと混合しました。 1（ 図3A）：1〜2：siRNAのための最高のプロタミン濃度を決定するために、siRNAは、1から、プロタミンの異なる濃度で混合しました。プロタミンを使用せずに、アニオン性リポソームで60〜65%のsiRNA封入効率がありました。プロタミンとサンプル：siRNAのモル比は1：1〜1.5：1（133から266 nM）を80〜90％のsiRNAを封入していました。 1.5上記のモル比：1は、siRNA /プロタミン複合体の沈殿を生じました。これらの沈殿した複合体は、アニオン性リポソームにカプセル化されませんでした。 siRNAのにプロタミンを添加した後、希釈によるsiRNAの濃度のわずかな低下がありました。しかし、濃度は、プロタミンを添加した （ 図3B）の後に安定していました。 50 kDaのフィルタは、siRNAの90％〜95％で、リポソームをろ過した後siRN...

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ディスカッション

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このレポートでは、効率的にCNSに対するsiRNAをトランスポート2の標的送達システムを作成するためのプロトコルについて説明します。 CNSに対するsiRNAを送達する従来の方法は、脳、標的としたsiRNAの静脈内注射、または非標的リポソームのsiRNA複合体の静脈内注射に直接のsiRNA / shRNAのベクトルを注入含まれています。 CNSへのsiRNA / shRNAのベクターの注入は、標的タンパク質の発現レベルの減少を引き起こすことはありません。しかし、siRNAを/ shRNAがCNSを通して自由に拡散しません。さらに、これらの注射は、隣接する神経組織6-9に損傷をもたらします。標的としたsiRNAの静脈内注射は、標的タンパク質の減少をもたらします。しかし、siRNAのほとんどは血清タンパク質20によって分解されます。最後に、単核食細胞系21による肝臓や劣化内のsiRNAの取り込みにおける非標的リポソームのsiRNA複合体の結果の静脈注射。 siRNA送達上記の車両、LSPCsとPALETSは、CNSへの直接のsiRNAを送達することにより、以前の方法よりも、よ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

次の資金源に感謝します：CSU感染症トランスレーショナルリサーチトレーニングプログラム（ID:TRTP）およびNIH研究助成プログラム））R01 NS075214-01A1）。 モノクローナル抗体PRC5を使用していただいたTellingラボに感謝いたします。 また、DOTAPリポソームについて、またリポソーム生成に関する専門知識を共有してくださったダウ研究所にも感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DOTAP脂質Avanti Lipids890890
コレステロールAvanti Lipids700000
DSPEAvanti Lipids850715
DSPE-PEGAvanti Lipids880125
ChloroformFisher ScientificAC268320010
MethanolEMD Millipore113351
N2 GasAirGas
ショ糖Fisher ScientificS5-500
押出機Avanti Lipids610023
1.0, 0.4, 0.2 μm フィルターAvanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
硫酸プロタミンFisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980単回使用の分注
Sulfo-NHSThermo Scientific24510単回使用の分注
40 μm Cell StrainerFisher Scientific08-771-1
ラット抗マウス CD16/CD32 Fc blockBD Pharmigen553141
Anti-PrP antibody (PRC5)プロプライエタリ - PRC

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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