方法論記事

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

DOI：

10.3791/54121

⸱

2016年7月6日

 ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光安定性シアニン色素は、エネルギー移動によるハイブリダイゼーションを監視するためにオリゴヌクレオチドに結合します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、我々は、2'-アルキンの合成のための方法を示す標準的なホスホルアミダイト化学を用いて自動化固相合成によってデオキシリボ核酸（DNA）鎖を修飾。オリゴヌクレオチドは合成後の銅触媒によるクリックケミストリーを使用して、2つの新しい光安定シアニン色素によって標識されています。両方のドナーとアクセプター色素の合成が記載されており、三つの連続工程で行われます。それらはハイブリダイゼーションにより近接させられるときに、周囲のアーキテクチャとしてDNAと、これら2つの色素が、エネルギー移動を受けます。したがって、2つの一本鎖DNA鎖のアニーリングは、蛍光色の変化によって視覚化されます。この色の変化は、蛍光分光法によって特徴付けられるだけでなく、直接ハンドヘルド紫外線（UV）ランプを使用して観察することができます。デュアル蛍光色読み出しの概念は、これらのオリゴヌクレオチドプローブを分子イメージング特に記載フォーのための優れたツールを作りますtostable染料が使用されています。これにより、イメージングプローブの光退色を防止し、かつ生物学的プロセスは、より長い期間のために実時間で観察することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分子イメージングは、生きた細胞内の生物学的プロセスを理解するための基本的な技術を表している。1-3、化学、生物学的応用のための蛍光核酸ベースのプローブの開発が拡大する研究分野となっています。これらの蛍光プローブは、細胞イメージングのために適したツールとなるために、いくつかの要件を満たす必要があります。まず、適用される染料は、in vivoイメージングに長期を可能にするために、高い量子収率、大きなストークスシフトと、最も重要なのは、高いphotostabilitiesで蛍光を示すべきです。そして第二に、彼らは信頼性の高い蛍光読み出しを示すべ​​きです。従来の発色団-消光剤、システムは、蛍光強度の簡単な変更によって、単一の蛍光色の読み出しに基づいている。4このアプローチは、細胞内の成分の自己蛍光または低い信号対雑音比に起因する偽陽性または偽陰性結果のリスクを負います他のCOMによって望ましくない消光によるものンポーネント。4

我々は最近、二つの異なる発色団を使用して二重蛍光色の読み出しを示す「DNAの交通信号灯」の概念に報告した。5-6概念は蛍光を変更するアクセプター色素にドナー色素からのエネルギー移動（ET）に基づいています色（ 図1参照）。これは、より信頼性の高い読み出しを可能にし、それによって蛍光イメージングプローブのための強力なツールを提供します。蛍光色素を有するオリゴヌクレオチドの標識には、2つの異なるアプローチによって達成することができます。染料は、それに応じて修正されたホスホルアミダイトビルディングブロックを使用して、固相に化学的DNA合成の間に組み込むことができる。7、この方法は、標準的なホスホルアミダイトおよび脱保護条件下で安定であり、色素に限定されます。別の方法として、合成後修飾方法は、オリゴヌクレオチドの化学的性質に設立されました。ここでは、私たちの新しい写真の1の合成を実証しますテーブルのエネルギー伝達対8,9とアジドとアルキン（CuAAC）間の銅触媒1,3-付加環を使用して、DNAの合成後の標識。10

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。これらの合成に使用される化学物質のいくつかは、毒性および発癌性があります。典型的には、実験室のコートを着て安全メガネや手袋などの有機化学研究室で必要とされるすべての適切な安全対策を使用してください。

染料の1の合成

注：両方の色素は、反応の同じタイプによって合成することができる。図2は、これらの反応の概要を示します。

  1. 1-（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）ビニル）ピリジン-1-イウムヨウ化物（染料1）の合成
    1. 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化物の合成（図2（a）は、工程a）
      1. 466 mgの4-ピコリンと20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの10ミリリットル中5.91グラムの1,3-ジヨードプロパンを溶解し、セプタムキャップでしっかり密封。
      2. 16時間85℃に加熱します。
      3. その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。
      4. 残油に酢酸エチル20mlを加え、3分間120 W超音波浴中の混合物を扱います。
      5. 濾過により形成された沈殿物を回収し、酢酸エチルで5回洗浄します。真空O / Nの下で固体生成物を乾燥させます。
    2. 1-（3-アジドプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウム（図2A、ステップb）の合成
      1. 、20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの12ミリリットル中に900mgの1-（3-ヨードプ​​ロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化を溶解し、アジ化ナトリウムの376ミリグラムを追加し、セプタムキャップでしっかり密封。
      2. 16時間85℃に加熱します。
      3. その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。
      4. 残渣にジクロロメタンの15ミリリットルを追加します。
      5. オフフィルターと得られた沈殿物を捨てます。
      6. 腐敗を用いて減圧下で溶媒を除去進蒸発は、褐色の油状物として生成物を得ました。
    3. 1-メチル-1H-インドール-3-カルバルデヒド（図2A、ステップc）の合成
      1. 不活性ガス（アルゴン）下で、還流冷却器を備えた50ml丸底フラスコ中の10 mlの無水ジメチルホルムアミド1.45グラムインドール-3-カルバルデヒド1.52グラムの炭酸カリウム2.70グラムのジメチルカーボネートを溶解します。
      2. 19時間130℃で混合物を攪拌します。
      3. その後、氷の上に混合物を注ぐ、室温まで冷却します。
      4. 水層を150 mLの酢酸エチルで3回抽出します。
      5. 有機層を合わせ、水でそれらを洗浄し、硫酸ナトリウム上でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下50℃で溶媒を除去します。
    4. カップリングの1-（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）ビニル）ピリジン-1-イウムヨウ化物（染料1）（図2A、ステップd）
      1. アルゴン下、湿気の排除下で働きます。 Dissol還流冷却器を備えた20 mL丸底フラスコ中で4 mlのエタノール中に90mgの1-（3-アジドプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウム及び48mgの1-メチル-1H-インドール-3-カルバルデヒドまし。
      2. 4時間80℃に0.07ミリリットルピペリジンと熱を追加します。
      3. RTに冷却します。
      4. 濾過により得られた沈殿物を収集し、ジエチルエーテルで3回洗浄します。
      5. 上澄み液にジエチルエーテルを加え、濾過により得られた沈殿物を収集します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。
      6. 沈殿物を組み合わせます。
  2. 1-（3-アジドプロピル）の合成-4-（2-（1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-イル）ビニル）キノリン-1-イウムヨウ化物（色素2）
    1. 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化物の合成は、（図2Bには、工程a）
      1. 715 mgの4 - メチルキノリン及び20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの10ミリリットル中5.91グラムの1,3-ジヨードプロパンを溶解し、セプタムキャップでしっかり密封。
      2. 熱16時間85℃です。
      3. その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。
      4. 残りの油を酢酸エチル20mlを加え、3分間120 W超音波浴中の混合物を扱います。
      5. 濾過により形成された沈殿物を回収し、酢酸エチルで5回洗浄します。真空O / Nの下で固体生成物を乾燥させます。
    2. 1-（3-アジドプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムの合成（図2B、ステップb）
      1. 、20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの12ミリリットル中に900mgの1-（3-ヨードプ​​ロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化を溶解し、アジ化ナトリウムの333ミリグラムを追加し、セプタムキャップでしっかり密封。
      2. 16時間85℃に加熱します。
      3. その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。
      4. 残渣にジクロロメタンの15ミリリットルを追加します。
      5. オフフィルターと得られた沈殿物を捨てます。
      6. 溶剤のuを削除しますファインダー褐色の油状物として生成物を得るために、ロータリーエバポレーターを使用して圧力を減少させました。
    3. 1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒドの合成（図2B、ステップc）
      1. 不活性ガス（アルゴン）下で、還流冷却器を備えた50ml丸底フラスコ中の10 mlの無水ジメチルホルムアミド1.45 G 2フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒド、0.996グラムの炭酸カリウム1.77グラムのジメチルカーボネートを溶解します。
      2. 19時間130℃で混合物を攪拌します。
      3. その後、氷の上に混合物を注ぐ、室温まで冷却します。
      4. 水層を150 mLの酢酸エチルで3回抽出します。
      5. 有機層を合わせ、水でそれらを洗浄し、硫酸ナトリウム上でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。
    4. 1-への結合（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-2-脱pheニル-1H-インドール-3-イル）ビニル）キノリン-1-イウムヨウ化物（図2B、ステップd）
      1. argの下での作業上と水分の排除下で。を備えた20 mL丸底フラスコ中で4 mlのエタノール中に90mgの1-（3-アジドプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウム及び59.7 mgの1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒドを溶解還流冷却器。
      2. 4時間80℃に0.06ミリリットルピペリジンと熱を追加します。
      3. RTに冷却します。
      4. 濾過により得られた沈殿物を収集し、ジエチルエーテルで三回洗浄します。
      5. 上澄み液にジエチルエーテルを加え、濾過により得られた沈殿物を収集します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。
      6. 沈殿物を組み合わせます。

DNAストランドの2合成

注：DNA合成機でM.カルザース11で説明したようにDNA鎖の合成は、固相上のホスホルアミダイト法を用いて行われます。シンセサイザーの機能は、合成手順の前にテストされ、試薬があれば更新します必要。

  1. Prearrangements
    1. アミダイト希釈剤（余分な乾燥アセトニトリル）の1.2ミリリットルで、市販の2'-O-プロパルギルdeoxyuridinephosphoramidite（CU）を溶解します。シンセサイザーバイアルにバイアルにソリューションを移動して、シンセサイザーにねじ込み。
    2. 何のアルゴンガス漏れがないことを確認する（製造者の指示に従って）、「リークテスト」を実行します。 「リークテスト」が失敗した場合は、より緊密にバイアルにねじ込みます。
    3. プライム固相合成室に接続する管を充填することによりCuのソリューション。
    4. アセトニトリルですべての行を洗ってください。
  2. DNA鎖の合成
    1. 製造業者のプロトコルからの指示に従って、DNA配列との結合方法を入力するように接続されたコンピュータを使用してください。 CUビルディングブロックのカップリング工程は、従来の7パルスで40秒に比べ7パルス（各パルスは16マイクロリットルである）で168秒を要しビルディングブロックとしてホスホラミダイト。
    2. シンセサイザーに最初の塩基（DNA合成は、3 'から5'から行われる）の1マイクロモルで修飾されている固相としてCPG（孔制御ガラス）を含むカラムをマウントします。
    3. DNA合成11上の合成を開始します。
  3. 合成されたDNA鎖の後処理
    1. 真空O / Nの下で合成されたDNA鎖の列を乾かします。
    2. 列を開き、反応バイアルにCPGを解放するためにピンセットを使用してください。オリゴヌクレオチドを​​脱保護し、CPGからDNA鎖を解放するために濃アンモニア水溶液700μlのを追加します。
    3. 18時間50℃にバイアルを閉じて、破裂を防ぐために、反応容器にセキュリティ蓋を適用し、熱。
    4. 30℃で30分間減圧（100ミリバール）下での遠心分離によってアンモニアを除去。
    5. CPGからろ過を開始します。遠心分離容器を11,000×gでFOでR 3分。上清を取り、孔径0.45μmの遠心分離装置にそれを転送します。 4分1,000×gで遠心分離します。
    6. 一方CPG、3分間、11,000×gで20秒間遠心のための渦に蒸留水300μlを添加します。 4分間の千×gで遠心分離装置及び遠心分離に上清を移します。 2回洗浄手順を繰り返します。
    7. 0.1ミリバールと25°CO / Nで遠心分離することにより、合わせた水溶液から水を除去します。

3.「クリック」の手順

  1. 、アスコルビン酸ナトリウム溶液（水中0.4 M）を25μl、50μlの34μlのトリスを二重蒸留水を追加 - [（1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（0.1 DMSO中のM / tBuOH 3：アジ化物の1）、114μL（0.01 DMSO中のM / tBuOH 3：1）およびテトラキス17μlの（アセトニトリル）銅（I）ヘキサフルオロリン酸溶液（0.1 DMSO中のM / tBuOH 3： 1）凍結乾燥されたアルキン修飾DNAサンプルへ。
  2. 1.5時間、60℃でサンプルをインキュベートします。
  3. RTに冷却します。
  4. DNAサンプルと10ミリリットルチューブへの転送に150μlののNa 2 EDTA（水中の0.05 M）および450μlの酢酸ナトリウム（水中の0.3 M）を追加します。
  5. 10ミリリットルのエタノール（100％）を加え、16時間、-32℃で保管してください。
  6. 千×gで15分間遠心分離容器、上清を除去します。
  7. 2ミリリットルの冷エタノール（80％）でDNAペレットを洗浄します。
  8. 減圧下で乾燥したペレット。

4. HPLC精製

注：HPLCは正常に動作していることを確認するDNAの鎖を分離する前に、十分な溶媒が利用可能で、列がきれいです。バッファ/アセトニトリルの出発濃度でカラムを洗浄します。

  1. 二重蒸留水250μlの粗DNAペレットを溶解し、HPLCバイアルに移します。
  2. 染料1およびgradiのためにアセトニトリルの15％、0％アセトニトリルの勾配で45分のHPLCの実行を開始します色素2のアセトニトリルの17％、0％のアセトニトリルの耳鼻咽喉科を、260nm（DNA吸収）と459 nmの（染料1）または542 nmの（色素2）をチェックすることによって実行を監視します。両方の波長チャネルでの吸収を示し、それらの画分を収集します。
  3. 3-ヒドロキシ酸（3HPA）とdiammoniumhydrogencitrateからなる行列を使用して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法によって権利質量のために集めた画分を確認してください。
    1. 水中のdiammoniumhydrogencitrate溶液（100グラム/ L）100μlのアセトニトリルと水の1：1混合物に飽和3-HPA溶液を900μLを混合することにより、マトリックスを準備します。
    2. ターゲット上のDNAプローブのピペット1-2μlを、空気にそれを乾燥させてください。
    3. サンプルに3-HPA / diammoniumhydrogencitrate行列の0.2μlを添加して、それが結晶化するまで混合します。
    4. MALDI質量分析を実行します。
    5. 右の質量を示すそれらのHPLC画分を兼ね備えています。
_title "> 5。濃度​​の決意

注：濃縮は、DNA塩基と色素の吸光係数（ε260）に基づいて、UV /可視分光光度計を用いて260nmでの吸収を測定することによって決定されます。

  1. 二重蒸留水200μlの - 100でDNAを溶解します。
  2. UV /可視分光光度計でのDNA溶液1μlを適用します。
  3. 260nmの吸収を測定します。 3回繰り返します。
  4. 溶液の濃度を計算するために平均値をとります。吸光係数の計算のために、全体のDNA鎖のεの260nmのを得るために4つの天然塩基12のε260nmのと（自然ウリジンとみなす）を購入ビルディングブロックCUのεの260nmの 12を使用します 。染料1については、使用率ε260nmの = 10200のL *モル-1 * cm -1で色素2、使用率ε260nmの = 13100のL *モル -1 * cm -1で。吸光係数と測定された吸光度に基づいて、ランバート・ベールの法則以下の溶液の濃度を計算する。13

6.サンプル調製と分光

  1. 一本鎖サンプルの調製
    1. 200mMのNaCl、50mMののNaP iはバッファに変更されたDNA1とDNA2の各2.5μMのソリューションの個別に1ミリリットルのpH = 7を準備します。
  2. 二本鎖サンプルの調製
    1. 反応容器中で200mMのNaCl、50mMののNaP iは緩衝液、pH = 7にDNA2の2.5 DNA1のμM、2.5μMを含む溶液の1ミリリットルを準備します。
    2. 10分間90°Cに安全キャップと熱で蓋を固定します。その後、加熱をオフにして、RT O / Nまで冷却することができます。
  3. 吸光分光法
    注：蛍光スペックの励起波長を決定するにはtroscopy吸収スペクトルが記録されています。
    1. 一本鎖の測定
      1. 唯一の200mMのNaCl、50mMののNaP iは緩衝液、pH = 7を含むブランク測定を記録します。
      2. 1cmの石英ガラスキュベットにDNA1の調製した溶液を移し、吸収を記録します。ブランクデータに対する測定を修正してください。色素吸収の最大値を決定します。
      3. DNA2のために繰り返します。
  4. 蛍光分光法
    1. 一本鎖の測定
      1. 唯一の200mMのNaCl、 私はバッファ50 mMの仮眠を含むブランク測定を記録し、pH = 7に。色素1の励起波長を使用して。
      2. 1cmの石英ガラスキュベットにDNA1ソリューションを転送します。
      3. 蛍光スペクトルを記録します。
    2. 二本鎖の測定
      1. 石英ガラスキュベットに二本鎖のソリューションを転送します。
      2. 染料1の励起波長を用いて蛍光スペクトルを記録します。
  5. 可視化実験
    注意：適切な眼の保護が目に紫外線によるダメージを回避するために着用する必要があります！
    1. 記録されたスペクトルが表示されているものをよりよく理解するために、携帯型UV-ランプ（ 図5）でキュベットを照射します。二本鎖DNAへのシングルからの蛍光色の変化を観察します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図4に示すように、一本鎖および二本鎖DNAの吸収および蛍光スペクトルが記録されています。

記録された吸収スペクトル（ 図4右）一本鎖DNA1（染料1）と一本鎖DNA2（色素2）のために546 nmのための465 nmでのショーの吸収極大λmaxを。アニールDNA1_2（染料1＆染料2）は、469 nmおよび567 nmの両方で最大値を示しています。両方の吸収極大は、これらの小さな分光変化、色素2用染料1および21 nmのための4nmの深色シフトを示す二重らせんDNAアーキテクチャ内の色素間の励起子相互作用の結果です。

単一のための607 nmにおける対応する蛍光スペクトルの一本鎖DNA1（染料1、435 nmでの励起）のために537 nmの（...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、アジド修飾された蛍光色素によりCuAAC経由して、DNA合成後に標識するための完全な手順を示しています。これは、染料およびアルキン修飾DNAの合成と同様にラベリング手順を含みます。

色素の合成は、4つのステップに従います。すべての製品は、それらの正電荷のためにではなく、簡単な沈殿によって得ることができ、何時間のかかるカラムクロマトグラフィーは必要ありません。中央のカップリング工程の前にアジド官能基の導入は、4の代わりに、5つの連続反応工程への色素の合成を短縮します。 1,3-ジヨードプロパンの代わりに、アルキル化工程、アペル反応およびヨード機能にヒドロキシル官能基を​​変換するには、次のフィンケルシュタイン反応のための3-ヨードプ​​ロパノールの適用は回避されました。公表された方法と比較してこれらの変更は、私たちは、より大きなスケールと時間の短い期間で色素を合成することができます。

適用される色素は、優れた光安定性ではなく、固相DNA合成および後処理時に必要な安定性を示します。このため、...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ドイツ学術協会（DFG、ワ1386 / 17-1）によって財政支援、研究研修グループGRK 2039（DFGが資金提供）およびKITは深く感謝されています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
synthesis
4-PicolineSigma Aldrich239615
1,3-ジヨードプロパンSigma Aldrich238414
アセトニトリルフィッシャー・サイエンティフィック・10660131HPLCグレード
酢酸エチルフィッシャー・サイエンティフィ・サイ10456870 テクニカル・グレード
アジ化ナトリウムシグマ アルドリッチ71290p.a. グレード
ジクロロメタンフィッシャー サイエンティフィック10626642テクニカル グレード
インドール-3-カルボキシアルデヒド; 98%ABCRAB112969
炭酸カリウム、99+%アクロス424081000
ジメチルカーボネートシグマ アルドリッチ517127
N,N-ジメチルホルムアミド、99.8%、モレキュラーシーブアクロス348435000
ナトリウムントクラフト12623.46
エタノール、99.5%アクロス397690010
ピペリジン、99%アクロス147181000
ジエチルエーテルッシャーサイエンティフィ10407830テクニカルグレード
2-フェニルインドール-3-カルボキシアルデヒド、97%ABCRAB125050
4-メチルキノリンABCRAB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid SynthesizerApplied Biosystems -
DMT-dA(bz) ホスホロアミダイトΣ AldrichA111081
DMT-dT ホスホロアミダイトΣ Aldrich
DMT-dG(dmf) ホスホロアミダイトSigma アルドリッチG11508
DMT-dC(bz) ホスホロアミダイトΣ アルドリッチC11108
DNA合成用アミダイト希釈剤シグマアルドリッチL010010
超高純度DNA合成用アセトニトリルシグマアルドリッチL010400
キャップAシグマアルドリッチL840000
キャップ Bシグマ アルドリッチL850000
CPG dT コラム 1.0 &マイクロ;モルProligo 試薬T461010
CPG dA(bz) カラム 1.0 &マイクロ;モルProligo 試薬A461010
CPG dG(ib) カラム 1.0 &マイクロ;モルProligo 試薬G461010
CPG dC(bz) カラム 1.0 &マイクロ;モルProligo試薬C461010
アンモニア(水溶液) フルーカ・アナリティカル318612
遠心装置 nanosep 0.45 &マイクロ;mポールODGHPC34
5-(ベンジルチオ)-1H-テトラゾール(活性化剤)シグマ・アルドリッチ75666
2'-O-プロパルギル・デオキシウリジンホスホロアミダイト化学遺伝子ANP-7754
workup
vacuum concentratorChrist
clicking procedure
テトラキス(アセトニトリル)銅(I)ヘキサフルオロリン酸シグマアルドリッチ346276
酸ナトリウムシグマアルドリッチS2889
(+)-L-アスコルビン酸ナトリウムシグマアルドリッチA7631EDTA
二ナトリウム塩シグマアルドリッチE5134TBTA
配位子 - -文献手順に従って合成1
HPLC
>HPLC-system島津
MALDI-Biflex-IV分光計Bruker Daltonics
LC-318 C18Supelcosil via Sigma Aldrich58368
濃度の決定
ND 1000 分光光度計nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 BioVarian
Fluoromax-3 fluorimeterJobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.
ックエンティフィック 硫酸ベルフィックT111081酢製作所 カラム

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  3. Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
  4. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
  5. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
  6. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
  7. Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
  8. Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
  9. Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
  10. Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
  11. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  12. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589(1975).
  13. Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
  14. Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
  15. Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

DNA

関連記事