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方法論記事

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

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DOI：

10.3791/54127

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2016年7月4日

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

この記事について

サマリー

この記事では、電子常磁性共鳴研究のためのサイト指向スピンラベリングと五量体配位子依存性チャネルの再構成の方法について説明します。このプロトコールは、あらゆる膜タンパク質に適合させることができます。ここで説明する再構成法は、定義された脂質システムにおける巨視的電流および単一チャネル電流のパッチクランプ測定にも使用できます。

要約

イオンチャネルゲーティングは、タンパク質の動きを刺激的に調整し、閉じた状態、開いた状態、および鈍感な状態の間の遷移を引き起こします。これらの遷移の基本となるのは、タンパク質の本質的な柔軟性であり、これは膜脂質組成によって決定的に調節されます。チャネル機能の構造的基盤をより深く理解するためには、生理的膜環境におけるタンパク質動態を研究する必要があります。電子常磁性共鳴(ESR)分光法は、機能状態間のコンフォメーション遷移を特徴付けるための重要なツールです。NMRやX線結晶構造解析と比較すると、ESRから得られる情報は本質的に解像度が低いです。しかし、他の技術とは異なり、ESRではタンパク質の分子量に上限はなく、サンプルの必要量は大幅に低く、さらに重要なことに、タンパク質は結晶格子力によって制約されません。したがって、ESRは、再構成されたシステム内の大規模なタンパク質複合体やタンパク質の研究に特に適しています。この記事では、Gloeobacter violaceus(GLIC)由来の原核生物プロトン依存性五量体リガンド依存性イオンチャネル(pLGIC)を例に、部位特異的スピン標識と膜再構成の一般的なプロトコールについて説明します。定常状態の連続波(CW)とパルス(Double Electron Resonance-DEER)ESRアプローチの組み合わせについて説明し、チャネルダイナミクスの完全な定量的特性評価を可能にします。

概要

過去10年間、五量体リガンド依存性イオンチャネル（pLGIC）の構造的理解は、家族のいくつかのメンバーの高分解能構造の群衆に起因して、飛躍的に成長してきました。フィールド内の現在の進歩につながった主な要因は、構造決意アプローチ中の原核pLGICチャンネルの発見、真核生物の膜タンパク質の発現に1-3主要な進展、4-6と驚異的なブレークスルーを含む。7これらの構造は、上の明確なコンセンサスを提供しますpLGICの3次元構造の全体的な保全。しかし、背後に引きずるように見える二つの主要な分野は、これらのチャネル製剤の機能的特徴およびチャネル機能のメカニズムの説明があります。

ゲーティングコンフォメーション変化は複雑であり、チャネルの長さに沿って60オングストロームの距離にわたって起こり、これらの遷移は広くによって調節されます膜脂質。具体的には、負の脂質、コレステロール、およびリン脂質はpLGIC 8-11の機能を調節することが示されています。チャネル機能におけるこれらの脂質成分の正確な役割は不明のままであるが、ゲーティングの完全な分子的理解は、彼らのネイティブ環境でこれらのチャネルを研究が必要となります。部位特異的スピンラベリング（SDSL）および電子常磁性共鳴（EPR）分光法は、再構成されたシステムでは、タンパク質のダイナミクスを研究するための選択肢の技術です。 EPR分光法（蛍光分光法のように）分子の大きさ（NMRのように）、またはサンプルの光学的特性によって制限され、それによって天然の脂質状態に再構成全長構築物の測定が可能です。技術は非常に敏感であり、（ピコモルの範囲内で）比較的低いサンプル要件があります。これらの両方の側面がミリグラム以上で表現することが困難な大規模な膜タンパク質を研究するための技術は非常に適して作ります量。

部位特異的スピン標識と組み合わせて、EPR分光法を使用することは、ウェインハベルらによって開発された、およびタンパク質の種類の範囲を研究するために適合されている。12-24 EPRデータは、二次構造を調査するために使用されている、タンパク質の変化を立体構造、膜挿入深さ、およびタンパク質 - タンパク質/タンパク質 - リガンド相互作用。

この方法は、部位特異的突然変異誘発により、目的の位置にシステイン置換を含みます。部位特異的な標識化を確実にするために、システインレステンプレートを作成する別のアミノ酸（ 例えば 、セリン）で天然のシステインを置換することが必要です。これまでのところ、最も人気のあるスピン標識は、チオール特異的MTSLである：（1-オキシル2,2,5,5-テトラメチルΔ3-ピロリン-3-メチル）ジスルフィド結合のブリッジを介してタンパク質に付​​着methanethiosulfonate。その高い特異性、比較的小さいサイズ（トリプトファンよりわずかに大きい）、およびフレキシへリンカー領域の性は、このスピン標識も埋め込みシステインに優れた反応性を有することが示されています。さらに、反応性を最大化するために、タンパク質の標識反応は、界面活性剤可溶化形態で行われます。サイズ排除クロマトグラフィーにより過剰の遊離スピン標識を分離した後、タンパク質は、リポソームまたは定義された脂質組成物の二重層模倣システムに再構成されています。一般的には、システイン突然変異誘発はよくタンパク質のほとんどの地域では許容され、かつスピンプローブの比較的小さいサイズは、二次および三次構造に最小限の摂動を引き起こします。修飾は、野生型の機能を保持することを保証するために、標識され、再構成されたチャネルは、パッチクランプ測定によって研究することができます。

標識機能性タンパク質は、その後、本質的に情報の主に3つのタイプを提供する分光測定に供される：lineshにより12,14,15,20,22,23,25-27スピンプローブダイナミクスを猿の分析;常磁性緩和剤に対するプローブのアクセス;距離分布27 EPR距離は、2つの異なるアプローチによって測定されます。最初は（8 - 20Åの距離範囲）をスピン標識との間の双極子相互作用に起因するスペクトルの広がりは連続波（CW）技術に基づいている。距離を決定するために使用されている28,29秒パルス、EPRであります距離測定は、二重電子電子共鳴（DEER）で70Å。30-34にまで拡張することができる方法は、スピンエコー振幅の振動は、距離と距離の分布を決定するために分析されます。ここでのスピンエコーは双極子相互作用の周波数で変調されます。一緒に、これらのパラメータは、タンパク質のトポロジーは、二次構造要素、およびタンパク質コンホメーション変化を決定するために使用されます。

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プロトコル

1.部位特異的変異誘発およびCys変異

  1. クローニングおよび変異導入
    注：GLIC野生型（WT）35、システインレス背景を作成するために、セリンに変異された単一の天然システイン（C27）を、持っています。システイン変異は、所望の位置36にシステインコドンを運ぶプライマーを用いて、部位特異的突然変異誘発により、システイン少ない背景に導入されています。
    1. 10×反応緩衝液5μl、100 ngの1μlのミックス/μlのシステインレスGLIC鋳型DNA 35、0.5μlの前方に40μMの各プライマーおよびリバースプライマー36、dNTP類（100 mM）の1μlの、および脱イオン水41μlの。それを徹底的に混合するために、サンプルを数回ピペットで、スピン（6000回転）、最終的には、DNAポリメラーゼの1μlを添加します。
    2. 次のプロトコルにサーモサイクラーを設定します。
      1. 4分95ºCでの変性。
      2. 30秒間、95ºCでの変性。
      3. 焼きなまし1分間55ºCでる。
      4. 10分間、68ºC（kbのプラスミド長さ当たりおよそ1分）での伸び。
      5. 18サイクルの1.1.2.4 - を繰り返して、1.1.2.2を繰り返します。
      6. 10分間68ºCでの最終伸長。
      7. 4ºCで温度を保持
        注：アニーリング温度は、プライマーのTmに基づいて計算されます。
    3. 、反応混合物にDpnIのの1μl加え、ピペッティングにより完全に混合し、1分間（6,000 rpm）をスピンダウン。 37℃で2時間インキュベートします。
  2. 変換
    1. 雪解けE.氷上で大腸菌コンピテントセル。 14ミリリットル滅菌変態チューブに小分けした細胞の30μLを、細胞に消化されたDNAの1μlを添加します。チューブの側面をタップして混ぜます。氷上で20分間インキュベートします。
    2. 45秒間42ºCの水浴中にチューブを配置し、2分間氷上に戻って置きます。 incuで細胞を400μlの滅菌SOC培地を追加して振ります1時間37ºCでウランバートル。
    3. プレートカナマイシン（50μM）および1％グルコースを含有するLBプレート上に細胞100μl。 37ºCでプレートO / Nインキュベートします。
    4. プレートから単一コロニーを採取し、5mlのLB /カナマイシン培地を含有するO / N培養に接種します。インキュベーターシェーカーで37ºCでの文化O / N（〜16時間）インキュベートします。
    5. ミニプレパレーション37によってO / N培養物からDNAを抽出します。 260 nmの波長で吸光度を測定することによって分光光度計を用いてDNAの収量を定量化します。 200 ngの/μL - 濃度は〜100でなければなりません。標準的な組換えDNAシークエンシング戦略38,39によって変異の存在を確認してください。

2. GLICの発現および精製

  1. 変換
    1. GLをコードする遺伝子を含有するプラスミドの - （200 ngの/μL〜100）のセクション1.2に記載の手順に続いて、1μlのC43コンピテントセル30μlのを変換しますヒトライノウイルス（HRV）-3℃のプロテアーゼ切断部位と一緒にIC 35（ステップ1.2.5から）（プラスミドと遺伝子の配列については、補足テキストを参照してください）。
    2. プレート1％グルコースおよび50μg/ mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上の細胞を100μl、およびインキュベーターで37ºCでO / N（〜16時間）、それらをインキュベートします。
    3. コロニーを視覚的に確認し、それらが過成長していないことを確認またはサテライトコロニーの存在を示します。速やかにパラフィルムでプレートをシールし、4ºCで保管してください。
  2. O / N培養物および増殖培地の調製の設定
    1. ループ接種ワイヤーを使用して、単一の孤立コロニーを採取し、滅菌1％グルコースおよび50μg/ mlカナマイシンを補充したルリアブロス（LB）培地20ミリリットルを含む100ミリリットルの滅菌フラスコに移します。 250 rpmで振とう機で37ºCでO / N（〜16時間）、それらをインキュベートします。
    2. 2.8でオートクレーブ900ミリリットルテリフィックブロス（TB）メディア（メディアおよびバッファー組成を参照してください）20分間、121ºCでの蒸気サイクルにおける細菌培養用のLフェルンバッハガラスフラスコ。
  3. 大きな成長の文化を設定します
    1. オートクレーブ処理TB培地に滅菌リン酸カリウム緩衝液の100ミリリットルを（メディアおよびバッファー組成を参照）を追加します。滅菌グルコース（0.2％最終濃度）、カナマイシン（50μg/ ml）、およびO / N培養の10ミリリットルを追加します。 250 rpmで振とう機で37ºCでインキュベートします。
    2. それが0.5（〜2時間）に達するまで濃度計や分光光度計毎時を使用して、600 nmの波長（OD 600）での光学密度を確認してください。この時点で、回転数150rpmに速度が低下し、18ºCに温度を下げます。それが0.8（〜1時間）に達するまでOD 600 30分毎に監視します。
    3. （ - 30分〜15） -グリセロールの50ミリリットルを追加し、OD 600が 1.0に達するまで振とう培養し続ける1.2。
      注：これらの条件の下で、それは37ºCから18ºCに到達するための培養のための時間ほどかかります。それはインプですそれは18ºCに冷却した後にグリセロールを培養物に添加することortant。
    4. 200μMのIPTG（イソプロピルチオβ-D-ガラクトシド）で細胞を誘導し、戻って250回転にシェーカーをリセットし、18ºCで〜16時間、さらにインキュベートします。
  4. タンパク質精製
    1. 8500×gで、15分間の4.0ºCで回転させることにより、1.0Lの遠心ボトル内のセル18収穫- 16〜16時間の終わりにOD 600であることを確認してください。上清を除去し、細胞ペレットとボトルの重量を量ります。総重量から空のボトルの重量を差し引くことにより、ペレットの重量を計算します。
      注：期待される細胞ペレットの重量は約30である - 56 G / L。が、変異体の両端の最終OD 600細胞ペレットの重量の変動があってもよいことに留意すべきです。
    2. 文化の1.0 Lあたりの氷冷緩衝液Aの150ミリリットル（100mMのNaCl、20mMのトリス、pH7.4）中の細菌ペレットを再懸濁します。 DNアーゼI（100μg/ ml）およびプロテアを追加E阻害剤（フェニルメチルスルホニルフルオリド（1ミリモル）、ロイペプチン（2.0 / mlの）、アプロチニン（2.0 / mlの）、および（1 / mlのペプスタチン））。
    3. 4.0ºC低温室で細胞破砕を通すことによって、細胞を均質化。細菌のほとんどが溶解されるように、プロセスを3回繰り返します。 15分間14,000×gで細胞を遠心分離し、上清をピペットで清潔な遠心管に移します。未溶解細胞および封入体が含まれているペレットを、捨てます。
    4. 1時間168,000×gで上清を遠心。慎重に膜ペレットを乱すことなく、上清をデカントします。
    5. 50mlを最終体積の緩衝液A（10％グリセロールを補充した）中に培養物1 Lの膜ペレットをプールし、再懸濁します。 4.0ºCで2時間膜懸濁液とうなだれるにn型ドデシル-β-D-マルトピラノシド（DDM）の0.5グラムを追加します。
    6. 膜可溶化した後、centrifugによって溶解物から細胞破片を除去1時間のために168,000×gでエーション。その間にアミロース樹​​脂を準備します。転写空ポリプロピレンクロマトグラフィーカラムにピペットを用いて樹脂を3ml。 0.5 mMのDDMを含む緩衝液Aの10ベッドボリュームで、次に水で3倍の10ベッドボリュームを通過して樹脂を洗浄します。
    7. 遠心分離した後、静かにピペットを用いて上清を取り出し、きれいな50mlコニカルチューブに移します。バッチ式結合のために、コニカルチューブに予め平衡化アミロース樹​​脂を追加します。 4.0ºCで2時間混合物を章動により、アミロース樹​​脂に抽出したタンパク質をバインドします。
    8. クロマトグラフィーカラムを通してスラリー全体をパスし、フロースルーを収集します。その後、樹脂を介して結合最大化するための第2の時間を全体の収集フロースルーを渡します。
    9. 未結合のタンパク質を除去するために、0.5mMのDDM、0.5 mMのトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いて緩衝液Aの10ベッドボリュームを通過します。
    10. BUF 10mlでGLICタンパク質を溶出0.5 mMのDDMおよび0.05 mMのTCEPに加えて、40mMのマルトースを含むFER A。 TCEPは、システイン側鎖の酸化を防止します。全体の溶出を収集します。
    11. 4に遠心濃縮器（分子量カットオフ= 50キロダルトン）を使用して溶出したタンパク質を集中 - 6 mg / mlでとHRV-3Cプロテアーゼ（200μgの10 1mgあたりタンパク質）を追加し、4.0ºCでO / Nインキュベートします。
      注：SDS PAGEゲル上でサンプルを実行することにより、プロテアーゼ消化の完了を確認する（ステップ2.5.5および図1を参照してください）。
  5. 部位特異的スピン標識
    1. DMSO中の（1-オキシル2,2,5,5-テトラメチルΔ3-ピロリン-3-メチル）MTSL 40の200 mMストックを約100μlを行い、25μlのアリコートで-20ºCでの在庫を保管してください。
    2. MTSLとスピン標識するためのプロテアーゼ消化されたサンプルを使用してください。 MTSLスピンラベルの10倍モル過剰（1:10モル比でMTSL GLICモノマー）を追加します。氷上で1時間インキュベートします。 5倍モル過剰でスピンラベルのセカンドショットを追加します。比、さらに1時間インキュベートします。
      注：（ 後述する低スピン標識効率で）埋設位置について、スピン標識の30倍モル過剰を添加し、タンパク質を6時間インキュベートします。
    3. GLIC五量体から切断されたMBPおよび過剰のフリースピンラベルを分離するために、緩衝液Aおよび0.5mM DDMで予め平衡化されたサイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）カラムに通してサンプルを渡します。 30ミリリットルの溶出の合計1mlの画分を収集します。 GLIC五量体（ 図1）を含む画分をプール。 FPLCを実行するには、製造元の指示に従ってください。
    4. 280 nmの波長での吸光度を測定することによって分光光度計を用いて試料の濃度を決定します。モル吸光係数とGLICモノマーの推定分子量は、49850 M -1 cm -1でそれぞれ36380ダあります。 （分子を遠心濃縮器を用いてタンパク質溶液を濃縮〜8-10 mg / mlとし、氷の上に置き、最終濃度に量カットオフ= 50キロダルトン）。サンプルは現在、再構成のための準備ができています。
    5. 追加の品質チェックは準備が生化学的に均質であることを確実にするためにしたように、還元（1.0％β-ME）SDS-PAGEゲルを実行します。
      注：クーマシー染色ゲルは〜33 kDaのGLICモノマーに対応する（ 図1）で単一のバンドを示すべきです。
    6. 、双極性の広がりを示す疑いのあるスピン標識変異体については反磁性ラベル41の存在下でサンプルを下に、ラベルを付けます。 0.1倍のMTSLで溶出したタンパク質をインキュベートし、1.0時間氷上でインキュベートします。その後、反磁性ラベル（1-アセトキシ2,2,5,5-テトラメチルΔ3-ピロリン-3-メチル）メタンチオスルホネートの20倍モル過剰を追加します。
      注：ここで使用される反磁性試薬は、同一の標識化学と常磁性標識にイソ立体的です。
    7. 2時間氷上でサンプルをインキュベートします。 SIZを通して試料を渡しますステップ2.5.3のように緩衝液Aおよび0.5 mMのDDMで予め平衡化された電子の排除クロマトグラフィーカラム。
  6. スピンラベリングの効率
    1. スピン標識効率は、システイン側鎖（GLICモノマー）の濃度にスピンラベル濃度の比として定義されます。サンプルのスピン標識の効率を決定するために、サンプルの積分強度は、較正プロットを使用して、既知の濃度の標準と比較されます。水に溶解して - （250μM10）濃度の範囲内：（TEMPOなど2,2,6,6-テトラメチル-1- piperidinyloxyl）EPR標準のソリューションを作成します。
    2. これらの溶液の各々のためのEPRシグナルを測定し（ステップ6.1に記載されるように）各濃度の曲線下面積（EPR信号の二重積分）を決定します。 TEMPO濃度の関数として測定された領域をプロットし、直線でフィッティングすることにより検量線を生成します。
      注：アールデリバティブEPR信号の下のピーク振幅にピークよりもスペクトル強度の優れた記述です。最初の誘導体のEPR信号は吸収スペクトルを与える統合、第2積分は、その後、（スピン濃度に比例する）吸収スペクトル下の面積を与えます。スペクトルの低磁場および高電界領域における一定の基準の両方を確認してください。
    3. （ステップ2.5.4のように）分光光度計を使用して、洗剤中のスピン標識タンパク質の濃度を測定します。これで、サンプルのEPR信号を測定した後、6.1節の手順に従って、EPR信号の二重積分の面積を決定します。較正プロットを使用して、測定されたEPR信号に対応するラベルの濃度を決定します。スピン標識、タンパク質濃度のモル比として、スピン標識効率を算出します。

アゾレクチン膜3. GLIC再構築

  1. のリポソームの調製
    1. クロロホルム5mlで清潔な25ミリリットル丸底フラスコをすすぎ、ドラフト内でN 2ガ ​​スの流れの中で、フラスコを乾燥。フラスコに移すアゾレクチン10mgの（クロロホルム中ダイズ極性抽出物を25mg / mlストック）とN 2ガ ​​スの連続的な流れの下で脂質を乾燥させます。
      注：再構成のための脂質の選択は、セクション4での実験からの知見に基づくものです。
    2. クロロホルムが蒸発するときに、完全な乾燥を確実にするために、1時間真空中でフラスコを置きます。乾燥した脂質に再構成緩衝液Aの1ミリリットルを加え、懸濁液中に脂質ペレットを得るためにフラスコを激しくボルテックス。
    3. （ - 15分およそ10）を単層小胞を調製するために、小胞のソリューションは、多かれ少なかれ半透明になるまで、冷浴超音波処理における脂質懸濁液を超音波処理し、何の塊が観察されません。この混合物に、4 mMの最終濃度にDDMを追加し、室温で30分間インキュベートします。
  2. 再構成
    1. 脂質混合物へのステップ2.5.4から精製したタンパク質を追加します。
      注：タンパク質対脂質比は、実験の種類に依存します。巨視的な電流測定のために、1 10,000比が使用されます。信号を最大化するために：EPR研究のために、再構成は、脂質比（2500 1）へのより高いタンパク質で行われます。先にこれらの濃度では、横方向の凝集が42観察されないことが示されています。
      注：プローブした位置に基づいて、より少ない量も同様に動作しますが、EPRのためのGLICの典型的な作業量は、約1 mgです。
    2. その後、緩衝液Aで15ミリリットルにサンプルを希釈し、穏やかに回転させながら1時間、4ºCでサンプルをインキュベート
      注：この手順は、臨界ミセル濃度（CMC）以下の界面活性剤濃度をもたらします。
    3. （そのトラップ洗剤疎水性細孔を有する）ポリスチレンビーズを添加することにより、懸濁液中の残留洗剤を取り除きます。きれいなビーズ80mgのを追加し、liposをインキュベート4ºCでの旋回装置上の青梅サスペンションO / N。
      1. 使用するためにビーズを準備するには、〜100mgの重量を量ると50ミリリットルコニカルチューブに移します。メタノール10mlを加え、激しく振る、2分間8000×gでビーズをスピンダウンし、メタノールをデカント。メタノールのこのプロセスを3回洗浄繰り返します。 3回洗浄し、脱イオン水30mlで同じプロセスを繰り返します。
    4. 翌日、ビーズを除去し、さらに25ミリリットルにサンプルを希釈するために列フィルタを使用して25ミリリットル超遠心分離管にリポソームを移します。 2時間168,000×gでサンプルを遠心。上清を除去し、緩衝液Bの100μLを使用してペレットを再懸濁

4. FRETによって再構成するための最適な脂質組成を決定します

  1. タンパク質は、単分散の維持膜組成を決定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ベースのアッセイを使用します。
  2. 重量を精製 GLIC。
  3. 各脂質組成物は、試験するための3つの異なるサンプルを準備し、再構成のためのセクション3.2の手順に従って、 まず 、1のモル比でGLICをフルオレセイン標識：1500（五量体：脂質） 第二に 、ローダミン標識モル比でGLIC 1500：1の（ペンタマー：脂質）。 （1：1モル比）第三に、GLICラベルされた洗剤可溶化されたフルオレセインおよびローダミンを混ぜます。 1に、この混合物を再構成：750（五量体：脂質）比。
    注：アゾレクチン、POPC：POPG（3：1のモル比）、およびE.我々は、三脂質系を使用し大腸菌極性抽出物。 （1：1と比較して750：1,500 EPR研究のために使用される）FRET実験におけるタンパク質の脂質に対する再構成比は、EPR測定のために使用されるものよりも高いです。
  4. 希薄（光散乱信号を低減するために、緩衝液Aの995μlの中〜5μl）をリポソーム懸濁液は、その後、石英キュベットに試料をピペットし、蛍光光度計に入れてください。
  5. （：フルオレセインドナーの吸収極大に相当）490の励起波長を設定します。製造元の指示を用いて、500ナノメートルから660ナノメートルに発光スペクトルを記録します。
    注：フルオレセイン標識GLICのサンプルでは、​​（ローダミン発光に対応）572 nmのピークと518 nmの（フルオレセイン発光に対応する）にピークが表示されます。ローダミン標識GLICのサンプルでは、​​518 nmではなく、490nmのローダミンの直接励起に起因する572 nmのピークは表示されません。フルオレセインおよびローダミンラベルの両方を含有する試料については、フルオレセインのピーク強度の減少およびローダミンのピークの対応する増加は、おそらく、膜上のタンパク質の横凝集の指標であるFRETシグナルです。
  6. モニター最初の6時間毎時間で記録した後、O / Nインキュベーション後（ 図2） - （24時間0から）様々な時間間隔で572 nmでのローダミン発光の振幅。各間隔について、（ローダミン用：Ia）で572 nmでの蛍光強度を測定し、518 nmで（フルオレセイン用：同上）。 Iaの（IAC）からの直接ローダミン活性化（ステップ4.3のサンプル2）の寄与を引きます。 Iacを/（IAC + Ib）のようFRET比を決定します。異なる時間間隔で、異なる脂質組成物全体にFRETの比較。
    注：コントロールとして、洗剤可溶化サンプルのためのステップ4.5および4.6を実行し、再構成したリポソームからのものに発光スペクトルを比較します。 （ステップ4.3で説明）、界面活性剤で標識したタンパク質の等モル混合物を使用し、緩衝液Aで希釈して0.5 mMのDDMを補いました。洗剤サンプルを最小限のFRETシグナルを示すことが期待されます。

パッチクランプ記録5.機能測定

  1. 広報の準備EPRの研究（3.1節）とまったく同じ方法でパッチクランプ測定のためoteoliposomes。
    注：（巨視的録音対シングルチャネル）行われた測定のタイプに基づいて脂質比：しかし、タンパク質を調整します。使用するまで-80ºCで液体窒素とストア内のプロテオリポソー​​ムをフラッシュ凍結。単一チャネル記録のための50,000モル比：巨視的な電流および1のための脂質（モル比）：万タンパク質：一般的に、1にGLICを再構成。
  2. 氷上で解凍リポソーム。水とエタノールできれいなガラススライドをすすぎ、完全に乾燥。真空下で4°Cのでデシケーター中でスライドし、乾燥O / Nの中心にプロテオリポソーム10μlのドロップを置きます。
  3. 緩衝液B（150mMのNaCl、10mMのHEPES、pHは7.0）の20μLを添加することにより、乾燥したプロテオリポソー​​ムを水和物-Reおよび湿った濾紙の上にpetriplateでスライドを配置します。プレートをカバーし、再水和は、約2時間進行させます。
    注：このプロセスyieLDSからパッチを適用することが助長されている巨大なマルチラメラリポソーム。
  4. メーカーの推奨するピペットプラー上の設定を使用して - （2ミクロンの先端径〜1）薄肉ホウケイ酸ガラスキャピラリーからパッチピペットを引き出します。ヒートポリッシュ1.5の抵抗に火鍛造を使用して - 緩衝液Bで満たされたときに2MΩ
  5. ピペットを用いて、緩衝液Bで記録チャンバーを記入し、銀/塩化銀の接地電極を取り付けます。 2μlのピペットチップを使用して、静かに記録チャンバーにサスペンションのエッジと転送1μlのからリポソームを取り除きます。リポソームは底に沈殿するまで数分間待ちます。
  6. 非金属注射針を用いて、緩衝液Bとパッチピペットを記入し、アンプのヘッドステージにマウントします。パッチへの単一の単離された小胞を識別します。目詰まりからパッチピペットを防止するために、わずかな正の圧力を適用し、記録室に先端を挿入します。
  7. ピペットresistaを測定するための試験パルスを適用しますNCEとオフセットピペット電圧を補償します。ベシクルに接近し、接触が行われたとき、穏やかにギガオームのシールを形成するパッチピペットに対して小胞を引くわずかな負圧を適用します。
  8. 全体の処理中にピペットの抵抗を監視します。ギガオームのシールが形成されると、インサイドアウトパッチを形成するために慎重に離れてリポソームからピペットを撤回。テストパルスをオフにします。
  9. -100mVのに保持電位を設定し、そしてpHパルスを適用します。低pHは、10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液C（150​​mMのNaCl、10mMのクエン酸、pHが3.0）を用いて得ました。 （ 図3）
    注：録音は、肉眼では10 kHzからシングルチャンネル測定のための40kHzのサンプリング周波数で作られています。

6. EPR測定

  1. 連続波EPR分光
    1. 200μlのチューブにステップ3.2からリポソーム懸濁液を移し、遠心分離機を用いてサンプルをペレット化。 supernataを破棄NTおよびサンプルは、EPR測定のための準備ができています。
      注：EPR測定のためには、できるだけリポソーム試料からできるだけ多くのバッファを除去することが重要です。水性サンプルは、加熱及び感度の低下をもたらすマイクロ波の電気部品を吸収するからです。
    2. バッファー交換を行うために、マイクロチューブにピペットを用いてリポソームペレットを20μlを移します。緩衝液D（100mMのNaCl、10mMのクエン酸、pHは3.0）の180μl添加し、5分間42ºC水浴でインキュベートします。遠心分離機のサンプルは、完全なバッファー交換を確実にするために3回をピペットを用いて上清を除去し、プロセスを繰り返します。
      注：あるいは、バッファー交換は、複数の凍結/解凍サイクルに試料を供することによって作製することができます。
    3. ガス透過性プラスチックキャピラリーはスペクトル線、形や溶媒接近の両方の測定に適しています。内部のサンプルを描き、骨ワックスで終了を密封するためにペレット化プロテオリポソー​​ムに毛細血管をタップします。
      NOTE：典型的なサンプル量は、約5マイクロリットルであり、望ましいスピン濃度は150μMです。目的は、単独行の形状を測定することである場合は、1が0.4ミリメートルOD石英キャピラリー管を使用することができます。必要であれば、ピペット、毛細管内の試料を充填するために使用することができます。
    4. 分光器を操作
      1. メーカーの取扱説明書に従って、誘電体共振器を搭載したXバンド分光計で - RT（297 K 292）でCW-EPR測定を行います。
      2. 水チラー、電源、およびマイクロ波ブリッジのコンソールをオンにします。熱記録前に、約30分間平衡化するシステムを可能にします。取得ソフトウェアを開きます。
      3. 共振器内に試料管/キャピラリを挿入し、サンプルを充填した管のセクションでは、共振器空洞の中心にあることを確認してください。チューン分光計のマニュアルの指示に従って、共振器。
      4. フィールド掃引によって一次微分吸収スペクトルを記録します1.0ミリワット、100キロヘルツの変調周波数の入射マイクロ波電力と100 Gの掃引幅は、累進飽和実験一次微分CWのピーク高さを行うことにより、実験のための最適な電力を決定しますEPR信号は、入射マイクロ波電力の平方根の関数として測定されます。
        注：下のマイクロ波電力で、電力の平方根に比例して、信号の強度が増す限り、スピン状態の平衡人口は影響を受けません。電力がさらに増加する場合には、スピン - 格子緩和は、もはや2つのスピン状態の平衡人口差を維持することができない、信号振幅がプラトーまたはし始める「飽和します」。この点を超えて、信号振幅は、実際によるスピンsatesの反転分布に電力を観察増加とともに減少することができます。また、大規模な翼を持つ、より広いスペクトルのために明確に定義されたフラットなベースラインがviのない場合面積の損失を防ぐために200 G - sible、150に掃引幅を拡張します。
      5. 1.0 Gの変調振幅を使用して起動します
        注：この値は試料に依存し、信号の低周波ノイズを減少させるように調整されます。あまりにも大きい値が使用される場合、それは、信号を歪ませるか、広げることができます。
      6. 1024ポイントに20.97秒、および解像度に掃引時間、20.48ミリ秒までの時間定数と変換時間を設定します。
        注：時定数は、サンプルに基づいており、高周波ノイズを除去するように調整されます。
      7. 最初のスキャンの後、EPR信号の中央にセンターフィールドを設定し、トレースがどちらかの側の信号と十分なベースラインを含むように、掃引幅を選択します。
        注：また、信号/雑音比を改善するEPR信号の強度に基づいて、スキャンの数を増加させます。掃引幅と点の数を含めます
      8. 衝突リラックスエージェントにスピンラベルのアクセシビリティを測定するO 2 またはステップ6.1.4.4で説明した電力飽和プロトコル27を使用してエチレンジアミン酸（NiEDDA）。
        注：以前に26記載されているようNiEDDAを準備します。
      9. まず（O 2を洗い流すために）5分間N 2でキャビティ内にサンプルを灌流。 30 G.の掃引幅で3デシベルのステップで35デシベル - 5間の各マイクロ波電力のためのスペクトルを測定します
      10. 次いで、キャビティ内に試料を灌流 ステップ6.1.4.9のように - （3デシベルのステップで35デシベル5）異なるマイクロ波電力でスペクトルを10分間空気および測定します。
      11. 5分間42ºCの水浴中（緩衝液Bまたは緩衝液Dで）50 mMのNiEDDAの180μlのリポソームペレットを20μlをインキュベートします。サンプルを遠心し、ピペットを用いて上清を除去します。キャピラリーにサンプルをロードし、共振器空洞に配置します。手順を繰り返し6.1.4.9。
        注：この実験の原理は、その常磁性リラキシンとの相互作用ハイゼンベルグスピン交換を通じてグラム・エージェントは、信号と反転分布の飽和を防止するであろう。水溶NiEDDA及び脂溶性分子O 2を水（両方のバルクとintraprotein前庭）のためのレポーターとして使用され、膜がそれぞれ、タンパク質上の位置を暴露しました。
  2. データ分析：
    注：EPRデータの分析は、次の手順を実行します。14,22,23,25-27
    1. スピンプローブの移動度を算出する（ΔHO -1）、一次微分吸収スペクトルの中心線幅の逆数として。 ΔHoは -1運動の自由またはプローブのダイナミクスを反映しています。
    2. 以下で説明する手順を使用して、他の常磁性衝突リラックス薬へのプローブの接近の推定値であるアクセシビリティパラメータ（П）を、計算します。
      注：常磁性リラックス薬剤とのスピンプローブの相互作用ハイゼンベルグスピン交換によりニトロキシドのスピン-格子緩和率（T 1）を強化します。27
      1. 一次微分EPRスペクトルの中心線の垂直ピーク・ツー・ピーク振幅は、異なるマイクロ波電力で測定されたパワーの飽和実験（6.1.4.8）からアクセス可能パラメータ（П）を推定25プロット信号の振幅マイクロ波電力の平方根の関数として、次式27に合います。
        figure-protocol-1
        注：Aは信号の振幅であり、（通常は0.5と1.5の間である）共鳴線の飽和の均一性の尺度であり、Iは、スケーリング係数であり、Pは、入射電力であり、かつ表します値は、一次導関数の振幅が、その不飽和値の半分です。
  3. ΔPを計算します Pの差として1/2プレゼンス（O 2またはNiEDDA）および非存在下で1/2値は、常磁性弛緩薬の（N 2で灌流）。式を用いて、アクセシビリティパラメータ（П）を計算します。
    figure-protocol-2
    注：P 1/2 基準及びΔHoを基準 27（例えば、DPPH（2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル）など）の参照標準のために、それぞれ、半最大電力飽和値と中心線幅です。

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結果

スピン標識GLICの変異体の生化学的特徴

培養の12ミリグラム/ L - 上述のプロトコールに従って、典型的には10の範囲でGLIC-MBP融合タンパク質を生じます。この値は、特にタンパク質内に埋め込ま位置について、異なる変異体を横切って変化することができるが、収率が著しく損なわれる可能性があります。これらの場合には、培養容積はスケールアップが必要な場合があります。融合の切断HRV3Cプロテアーゼによる構築物は、便宜上、O / Nで行われます。 60分 - SDS PAGEゲル上でサンプルを実行することによって、我々は、この切断が30以内に完了したことを見出しました。 （ 図1A）。サイズ排除ゲル濾過カラム上で精製されたGLICは11.3ミリリットルの保持容量を持つ五量体として主に溶出します。 MBP画分を15 mlで溶出し、凝集体はカラム（〜7.0 ml）での空隙容積で溶出しま...

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ディスカッション

EPR分光法はネイティブに近い環境での膜タンパク質の立体構造変化を定量化するに比類のない構造的アプローチであることが証明されました。このアプローチは、私たちにX線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡から高解像度の構造に隠されているタンパク質のダイナミクスの分子の詳細にのぞき見することができます。しかし、他のシステムへの一般的な適用に影響を与える可能性があり、また、心の中で道に沿って潜在的な実験的な障害を保つために、このアプローチの技術的な制限を考慮することが重要です。私たちは、以下のトラブルシューティングのための推奨戦略に沿って、これらの態様のいくつかを議論します。

1は、大規模な突然変異摂動を伴う技術で遭遇した、より一般的な問題の中でタンパク質の収率が低く、貧しいオリゴマー安定性があります。このようなイオンチャネルのような複雑な多量体膜タンパク質で作業するときに、この態様はさらに悪化します。それは番目です広範囲の突然変異誘発に着手する前に、これらの2の生化学的な側面を最適化することが重要erefore。私たちは、有毒なGLIC変異体の発現がBL21細胞のC41とC43株における忍...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは、原稿上の重要な読書とコメントChakrapaniラボの現在および過去のメンバーに非常に感謝しています。 この作品は、国立衛生研究所の助成金（1R01GM108921）とアメリカ心臓協会（NCRPサイエンティスト開発グラント12SDG12070069）によって、およびSCにサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction bufferAgilent Technologies600380-52
dNTPSNew England BioLabs Inc‎N0447L10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA ポリメラーゼAgilent Technologies600380-512.5 U/ul
DPNINew England BioLabs Inc‎R0176S20,000 U/ml
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
SOC mediaNew England BioLabs Inc‎B9020S
カナマイシンフィッシャー サイエントフィックBP905
LB 培地Invitrogen127957084
Miniprep キットQIAGEN27106
C43 コンピテントセルLucigen60446
発現と精製
グルコースフィッシャー サイエントフィックD16
トリプトンフィッシャーバイオ試薬BP1421-500
酵母エキスアムレスコJ850
グリセロールフィッシャーバイオ試薬BP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG (イソプロピル-チオ-ベータ;-ガラクトシド)ゴールドバイオテクノロジーI2481C25
Trizma ベースSigma ライフサイエンスT1503
NaClSigma-AldrichS7653
DNase IシグマライフサイエンスDN25
PMSFアムレスコM145
ロイペプチンアムレスコJ580
ペプスタチンアムレスコJ583
DDM(n-ドセシル-&ベータ;-D-マルトピラノシド)アナトレースD310S
アミロース樹脂イングランドバイオラボインク‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
MaltoseAcros Organics329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
空のポリプロピレンクロマトグラフィーカラムBioRad731-1550
サイトデレクテッドスピンラベリング
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) メタネチオスルホン酸トロントReaserch chemicals IncO873900
(1-アセトキシ-2,2,5,5-テトラメチル-&デルタ;3-ピロリン-3-メチル) メタネチオスルホン酸トロント Reaserch chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
再構成
アソレクチン脂質Avanti polar lipids Inc541602C
バイオビーズ (ポリスチリンビーズ)Bio Rad152-3920
メタノールフィッシャー ケミカルズA413
FRET
フルオレセイン-マレイミドサーモフィッシャーサイエンティフィックF-150
トラメチルローダミン-マレイミドサーモフィッシャーサイエンティフィックT-6027
POPCアバンティ極性脂質株式会社850457C
POPGバンティ極性脂質株式会社840457C
大腸菌極性脂質抽出物Avanti極性脂質株式会社100600C
HEPES シグマライフサイエンスH3375
EPR測定
TPXプラスチック毛細血管ブルカーER221
EDDA(エチレンジアミン-N、N'-二酢酸)アルドリッチ158186
Ni(OH)2アルドリッチ283622
ニューテ ア

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