マウスをモデルシステムとして使用して、ヒトの疾患に関連する遺伝子ファミリーを理解するための逆遺伝学的なアプローチが提示され、その後のマウス表現型スケジュールが記述されています。目的の遺伝子であるHtrA2に欠損のあるマウスはパーキンソン病の症状を発現したため、表現型判定レジメンは神経学的欠陥の特定に焦点を当てています。
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方法論記事
老化のヒトの疾患に関与する遺伝子を研究するために使用される遺伝子改変マウス用表現型レジメン
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
加齢に伴う病気はますます蔓延しており、人口の高齢化に伴いその負担は増え続けています。衰弱性疾患の影響を軽減するためには効果的な治療法が必要ですが、多くの場合、とらえどころのないままです。老化に伴う疾患の原因と病理を理解することによってのみ、科学者は潜在的な治療標的を特定し、介入のための戦略を立て始めることができます。最も一般的な加齢性疾患は、パーキンソン病や失明などの神経変性疾患です。加齢性黄斑変性症(AMD)は、高齢者の失明の主な原因です。ゲノムワイド関連解析により、この疾患に対する感受性の増加に関連する遺伝子座がこれまでに同定され、補体因子H(CFH)と加齢性黄斑症感受性2(ARMS2)および高温必要因子A1(HtrA1)遺伝子が位置する10q26遺伝子座の2つの関心領域が同定されています。CFHは補体系の代替経路(AP)の負の調節因子として作用し、HtrA1は細胞外セリンプロテアーゼです。ARMS2は霊長類ゲノムのHtrA1の上流に位置していますが、マウスにはこの遺伝子は存在しません。これらの遺伝子の影響を研究するために、CfhおよびARMS2のヒト化ノックインマウス系統、Cfh、HtrA1、HtrA2、HtrA3およびHtrA4のノックアウト、ならびにHtrA2の条件付き神経欠失を作製しました。 遺伝子改変マウスのうち、HtrA2を欠損したマウスのみが全身または神経組織で明確な表現型を示した。これらのマウスを徹底的かつ体系的に調べるために、AMDとパーキンソン病という2つの主要な疾患に関連する一連のテストからなる初期の表現型スケジュールが確立されました。遺伝子改変マウスは、ヒトの関連疾患に関連する可能性のある表現型を特定するために、適切な実験を行うことができます。ここでは、ミトコンドリアに焦点を当てた表現型レジメンを、関心のあるテストの代表的な結果とともに紹介します。
概要
加齢関連疾患は、現代社会でますます普及してきています。医学が向上し、平均余命が増加すると、人口は年齢に続き、これらの疾患の負担が大きくなります。有効な治療法は衰弱させる条件の影響を軽減するために必要であるが、多くの場合、とらえどころのないまま。唯一の加齢に伴う疾患の原因と病態を理解することによって、科学者たちは、潜在的な治療標的を同定し、介入のための戦略を開発するために始めることができます。一般的な加齢関連状態は、パーキンソン病（PD）及び加齢性黄斑変性症（AMD）などの神経変性疾患が挙げられます。 PDは、ヒトにおいて神経変性によって引き起こされる最も一般的な運動障害です。ほとんどのPD患者は、年齢の50年後振戦、動作緩慢、剛性を休んなどの症状を示しています。早期発症はまた、症例の約10％において観察されています。
AMDは失明の主要な原因であります目の中の高齢者、漸進的にダメージを与える光受容体および網膜色素上皮（RPE）。中心視力が損なわが、周辺視野は、一般的に影響を受けません。 AMDの2つの形式があります。 「ドライ」の形式では、RPEとブルッフ膜（BM）との間のドルーゼンの形として知られている細胞外タンパク質の沈着は、地理的萎縮につながると中心視力のぼやけ。より深刻な「ウェット」フォームRPEと感光層へのBM全体の脈絡膜から新生血管形成の結果とは、網膜組織に永久的な損傷を引き起こす網膜の下にhamorrhagingにつながることができます。染色体1および10q2....
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プロトコル
倫理文：動物に関わる研究は、実験動物の管理と使用に関するガイドとイェール大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）における衛生勧告の国立研究所に準拠して実施しました。
遺伝子改変マウスの1行動試験
注：すべてのマウスは取り扱いに慣れの違いを制限するために、同じ試験レジメンに供されるべきです。試験日の同じ時間に毎回実行されるべきです。
- 新生児後肢テスト
注：後肢試験は、近位後肢の筋肉の強さ、弱さや疲労を評価するために、P10に生後日（P）4から毎日行われています。- 交通マウステストエリアへと試験前に30分間休ませることができます。
- Tの底部に2つ（P4-P8）または1（P9-P10）、コットンボールを押し込み、70％エタノールを用いて50mlコニカルチューブを洗浄することにより、試験装置を準備宇部および垂直位置に固定します。
- ケージから1子犬を削除し、重量を記録します。テストが行われていないときはいつでも熱パッドの上にトレイを保持するの子犬を保管してください。
- そっとそれはコットンボールに向かって下向きにされるように、円錐管の縁の上に新生児の後肢を一時停止します。作られたプル試行回数をカウントし、ストップウォッチを使用して落下するレイテンシを測定します。
- マーカーで子犬にラベルを付け、その後もう一度繰....
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結果
このセクションでは、これらの方法を用いて得られる結果の例を説明します。後肢試験では、プル試行回数が行われ、待ち時間は、毎日のための2つの連続した試験にわたって合計される落下します。この試験は、減少筋強度を有するマウスを区別するために、遺伝的に異なる群を比較するために使用することができ、図1AのHtrA2のtm1jhoh（HTRA2 KO）マウス- B還元しP4-6から落下するプルし、待ち時間の数の変化を示しません同腹子（HTRA2 WT）と比較して、P7-10での神経筋強度、インチ加齢に伴う強度の予想増加は、野生型動物でも観察可能です。離乳観察試験では、総活性は、テストの3日連続にわたって平均（線が飼育やイベントをグルーミング、トラバース）すべてのイベントを合計することによって評価することができます。また、イベントの各特定のタイプとすることができるindividuallyは分析しました。ここでは代表的な結果は、WT同腹仔と比較して、HTRA2 KOマウスの減少し.......
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ディスカッション
堅牢な治療法は、ヒトの老化に関連した条件を衰弱させるの影響を制限するために必要な、しかし、彼らは多くの条件のためにとらえどころのないままにされています。潜在的な治療標的を識別し、介入のための戦略を開発するには、加齢に伴う疾患の原因や病態を最初に理解しなければなりません。ていないこれらの遺伝子は、以前にヒトでの研究で条件にリンクされている場合でも、興味の疾患に関連する明確な表現型を有するすぐに存在するすべての遺伝的に改変マウス。したがって、より体系的な研究が必要とされ、遺伝的に改変されたマウスは、ヒトでの関連疾患に関連する可能性の表現型を識別するために、適切な実験に供されるべきです。
無数の行動試験は、マウス50,51における神経学的機能をアッセイするために存在します。本明細書で概説行動試験は、ヒトの調査結果と実際の表現型に基づいて仮説を立てた表現型に適しているOBSEマウスでrved。また、これらのテストは、行動実験を行うにはほとんど、あるいは経験のない研究室で実行するのが簡単です。そこに洗練された機器のための要件はありませんが、適切に収集されたときの結果は有.......
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開示事項
著者には開示すべき競合する利益はありません。
謝辞
この研究のための資金は、シャクナゲ医療財団とイェール大学医学部ディーンの研究基金（JH）から来ました。私たちは行動実験のヘルプは博士クレアケーニッヒに感謝します。遺伝子操作したマウス系統はOzgene（パース、オーストラリア）で生成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エタノール | デコン(フィッシャーサイエンティフィック) | 435541 | |
| 50mlコニカルチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 1443222 | |
| コットンボールウォル | マート | ||
| ヒートマット | ビーム | 0000756-500-000 | |
| ディングトレイ(アイスキューブトレイ) | ウォルマート | ||
| 電子ストップウォッチ | GOGO | PC396 | |
| で構築された | プレキシガラスの箱 | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 ビデオカメラ | キヤノン | 8155B004 | |
| 9 オンス クリア カップ | ウォルマート | ||
| 1/4 インチ ワイヤー メッシュ | ホーム デポ | 204331884 (オンライン) / 554219 (店舗内) | 12" by 12" |
| プチプチ | VWR | 470092-416 | |
| ストレート試料鉗子 | VWR | 82027-438 | |
| 細先端解剖鉗子 | VWR | 82027-408 | |
| 細かいはさみ | VWR | 82027-578 | |
| パラホルムアルデヒド 16% 溶液 | 電子顕微鏡科学 | 15710 | |
| 10x リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| ショ糖 | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris 塩酸塩 | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型二ナトリウム塩水和物 | Sigma | N8129 | |
| ニトロテトラゾリウム青色塩化 | Sigma | N6876 | |
| アセトン | JT Baker | 9006-05 | |
| リン酸ナトリウム一塩基性一水和物 | Sigma | S9638 | |
| リン酸ナトリウム二塩基性七水和物 | Sigma | S9390 | |
| コハク酸ナトリウム二塩基性六水和物 | Σ | S2378 | |
| VectaMount水性封入媒体 | Vector Labs | H-5501-60 | |
| カバーガラス | フィッシャーサイエンティフィック | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 顕微鏡 | ツァイス | ||
| ビデオカメラ三脚 | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning マシン | ライカ | CM1900 | 製造中止になりましたが、CM1950 に置き換えられました |
参考文献
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at....
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再版と許可
