ここでは、細菌の胞子発芽中に還元糖の存在を検出するための比色分析法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
クロストリジウム・ディフィシルや他のクロストリジウムにおける内胞子の発芽過程は、モデル胞子形成細菌である枯草菌とは異なることがますます明らかになっています。発芽は低分子の発芽物によって引き起こされ、高分子合成を必要とせずに起こります。バチルスとクロストリジウムの種では胞子発芽のメカニズムに違いがありますが、共通の要件は、胞子コアが膨潤して再水和することを可能にするペプチドグリカン様皮質の加水分解です。水分補給後、代謝が始まり、最終的には栄養細胞の成長につながります。胞子発芽中の加水分解皮質断片の検出は困難であり、前述のアッセイに対する変更が混乱を招いたり、再現が困難になったりする可能性があります。したがって、このアッセイを使用した最近のレポートに基づいて、細菌胞子の発芽中に皮質断片を比色的に検出するための段階的なプロトコルについて詳しく説明します。
概要
内生胞子は、細菌が不利な環境で存続することを可能にする細菌の代謝的に休止状態の形態です。多くの胞子形成細菌は、胞子形成は、栄養欠乏によって誘導されるが、このプロセスは、pH、酸素への曝露または他のストレス1に変更することによって制御することができます。それらの代謝休眠胞子の形で、一方、細菌は、UV照射、乾燥、高温、および2の凍結に耐えます。胞子形成過程に関する知識のほとんどは、モデル生物での研究、 枯草菌（Bacillus subtilis）から来ています。胞子形成のプロセスは、DNA複製および軸方向フィラメント3,4の形成から始まります。非対称隔壁は、2つの不均等サイズの区画にセルを分割します。大きなコンパートメントは、母細胞は、小さな区画、前胞子を飲み込みます。母細胞とドーマンを解放し、胞子、最終的に溶解する母細胞を成熟するために遺伝子発現を調整する前胞子の両方周囲の環境1へのT胞子。
胞子の構造と組成は、多くの細菌種間で保存されています。胞子コアは栄養細胞よりも低い含水量を有しており、ジピコリン酸（DPA）1,2と豊富です。胞子形成中、DPAは、水と引き換えに胞子コアに圧送されます。コアを囲むことは、ほとんどの芽胞形成菌で、発芽を刺激する小分子を認識する受容体（germinants）が2に位置している....
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プロトコル
1.生成のサンプル
- 熱はCを活性化させます氷上で30分間、店舗65℃でディフィシレ胞子。
注：C.以前7,9,10説明したようにディフィシレ胞子は生産、精製することができます。 - Xは、サンプル数がアッセイ中に撮影されるX + 1 mlの発芽溶液を調製します。
注：発芽液が細菌の種に固有のもので検討されて胞子。 C.をアッセイするためのディフィシレ胞子発芽、我々は、10mMトリス（pH7.5）を、150mMのNaCl、脱イオン水中の100 mMグリシンおよび10mMタウロコール酸の溶液を用います。 - アッセイを開始する前に、皮質の断片を検出するためのブランクとして機能するように胞子をせずに発芽溶液1.0mlサンプルを描きます。
- すぐに発芽液と渦に〜3.0のOD 600に胞子を追加します。
注：Bの私たちの発芽試験のために枯草菌 、我々は同じODを使用6C.用として00胞子ディフィシル 。
注：胞子のこの量は、Cの間に皮質断片の放出をモニターするためによく働きましたディフィシレ胞子の発芽。このアッセイで使用される胞子の量は、それぞれ細菌ま....
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結果
表1は、NAG標準を使用した典型的な結果を示しています。データは、標準曲線を生成するために使用される。 表2は、100 mMグリシン及び10 mMのTA（発芽促進条件）、または100mMのグリシンのみ（未発芽状態）を補充した発芽バッファにおける発芽アッセイの代表的な結果を示しています。 TA、Cの非存在下ではディフィシレ胞子は発芽せず、溶液中の皮質の断片の存在はほとんど変化しません。しかし、C.、TAお よびグリシンの両方の存在下で、 ディフィシレ胞子は発芽し溶液中に皮質の断片を放出します。これは、反応した試料の経時的なOD 585の増加として観察されます。このアッセイの間に放出さ皮質断片（ナノモル）の合計量は、 図1Bと同様の標準曲線を用いて計算しました。このアッセイでは、皮質の大部分が加水分解される（または解放）15分後により発芽暴露、胞子の大部分はこの時間枠（
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ディスカッション
刺激を受けると、発芽の過程を経て胞子は巨大分子の合成を必要とせずに、それらの抵抗特性を失います。胞子の発芽がトリガされると、胞子コアは水2と引き換えにDPAを 解放します。休眠胞子の高いDPA内容に、胞子コアは、拡張2に対するバリアとして、おそらく、作用することにより、膨潤コアを防ぐことができます強烈な浸透圧や専門ペプチドグリカン、皮質下にあります。
上述の方法は、紫の色合いの測定シフトと還元糖の存在を検出するためにエールリッヒ試薬（黄色溶液）を使用します。皮質の加水分解の間、NAGとNAM糖が遊離する（加水分解酵素の程度に応じて、糖は、二糖類または多糖類として遊離させることができます）。塩酸（ステップ2.1）によるグリコシド結合の加水分解は、自由還元末端7で単糖を生成します。 neutraliz後水酸化ナトリウム（ステップ2.5）の等量酸る、NAGとNAM単糖類を囲むアルコールは無水酢酸（ステップ2.6）13によりアシル化されます。その後、未反応の無水酢酸を試料（ステップ2.8）を加熱して.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
説明プロジェクトは、アレルギーと国立感染症研究所から賞数5R01AI116895でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立アレルギー感染症研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2.0 mlスクリューキャップチューブ | USAサイエンティフィック | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorfピペット | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorfピペット | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorfピペット | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μlピペットチップ | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μllピペットチップ | VWR | 89079-458 | |
| N-アセチル-D-グルコサミン | シグマ | A3286-25G | |
| 塩酸-10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| 無水酢酸 | Alfa Aesar | L04295 | |
| 炭酸ナトリウム | BDH | BDH0280-500G | |
| 四ホウ酸塩四水和物 | Alfa Aesar | 39435 | |
| 水酸化ナトリウム | BDH | BDH8019-500G | |
| 4- (ジメチルアミノ) ベンズアルデヒド | Σ | 156477-100G | |
| 飽和フェノール | フィッシャー | BP1750-400 | |
| 2- メルカプトエタノール | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | 分子デバイス | ||
| 酢酸、氷 | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| 加熱、循環水浴 | VWR科学 | モデル1136 | |
| マイクロテスト96 | ファルコン | 353072 | 96ウェルクリア組織培養 |
| プレート培養チューブ | VWR89000-506 | ||
| 凍結乾燥機 | |||
| ヒートブロック | |||
| ボルテックスマシン |
参考文献
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species:....
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再版と許可
