微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Summary

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、2-D環境（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器（RWV）バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。

Abstract

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、多数の2次元環境における細胞培養の隙間（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）をブリッジする可能性があるからです。実際には、広くフラスコまたはディッシュで増殖した細胞は、脱分化し、それらが由来する組織の特殊な機能を失う傾向があることが認識されます。 （a）は、静的モデルとバイオリアクターを用いて（b）のモデル：現在、天然の細胞外マトリックス（ECM）を模倣する細胞が足場に播種される3-D培養系の2種類が主に存在します。最初のブレークスルーは、静的な3次元モデルでした。このような回転-壁容器（RWV）バイオリアクターなどのバイオリアクターを用いた3次元モデルは、より最近開発されています。 RWVバイオリアクターのオリジナルのコンセプトは、1990年代初頭にNASAのジョンソン宇宙センターで開発された、そのような低酸素性、壊死性コアの開発のような静的なモデルの限界を克服すると考えられています。 RWVバイオリアクターは、番目のを回避する可能性があります栄養と酸素の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって、問題です。これらのバイオリアクターは、彼らの曝気源の種類によって異なる培養容器の二つの異なるフォーマットをサポートし、回転させるのに役立つローテータベースで構成されています。中心部に同軸人工肺で（1）スローターニング横船舶（STLVsを）、または（2フラット、シリコーンゴムガス転写膜を介して酸素との）高アスペクト比の船舶（HARVs）。バブル形成とその結果としての乱流を回避しながら、これらの血管は、効率的なガス移動を可能にします。これらの条件は、モデルは、培養容器内部の重力（重力）を低減し、層流と最小限のせん断力が生じます。ここでは、RWVバイオリアクターが提供する腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力下で培養内皮細胞および線維芽細胞から成るヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。</ P>

Introduction

改善するために、最初の3-Dモデルを構築する画期的な科学者は、足場の異なるタイプの調査を開始したときに、1980年代の初頭に報告された（ 例えば 、ラミニン、コラーゲンタイプI、コラーゲンIV、およびフィブロネクチン）および成長因子のカクテル「静的」3次元モデル^1-7の細胞と細胞とECMの相互作用。それ以来、これらのモデルの主な問題点は、媒体および組織の構築⁸内^の栄養と酸素の転送の制限となっています。血管のネットワークを周囲から栄養と酸素の定常流を受ける生体内環境での細胞とは対照的に、これらのモデルの静的な性質は、細胞へのそれらの効果的な分散を妨げます。例えば、 インビトロで生成された細胞凝集体のサイズは数ミリを超える静的モデルは常に低酸素性、壊死性コア^9を開発^します。 RWVバイオリアクターは、この問題を回避する可能性があります栄養素および酸素^10〜12の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって。しかし、今日まで、RWVバイオリアクターを使用して作業は、1つまたは2つの細胞型^13〜17を含むことに限定されています。また、代わりにネイティブの組織に似た空間的配向の、それらの細胞は、細胞凝集体を形成しました。これらの制限の主な理由は、一元的に細胞を組み込むことができる足場の欠如となっています。現在までにRWVバイオ....

Protocol

倫理の声明：すべての血液標本は、プロトコル番号HP-00040025から1に参加したボランティアから採取しました。メリーランド大学施設内倫理委員会は、このプロトコルを承認し、この原稿に含まれた研​​究のための健康なボランティアからの血液標本のコレクションを承認しました。本研究の目的は、ボランティアに説明した、そしてすべてのボランティアが知らさ与えた、採血前に同意書に署名しました。

注：培地補充の準備については、 表1を参照してください。 3-D培養培地の調製のための表2を参照されたいです。

培養容器の調製

1. （ 例えば 、RPMI）50ミリリットル、容器の充填ポートのキャップを外し、無菌培養培地50mlで埋めます。層流フード内で無菌状態の下ですべての手順を実行します。
2. キャップを交換し、70％エタノールで任意の表面上の任意のこぼれたメディアを拭きます。
3. 容器はincubを許可します室温でO / Nに少なくとも15分間食べました。
4. 培地を廃棄し、3次元培養液の30ミリリットルを追加するために充填ポートを使用します。
5. 70％エタノールで任意の表面上の任意のこぼれた培地を拭いてください。

Results

これまで我々は、腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力条件^24（ 図1）で培養内皮細胞および線維芽細胞からなるヒトの腸粘膜の多細胞3次元器官モデルを設計してきました。線維芽細胞および内皮細胞は、追加の腸基底膜タンパク質^45（ すなわち 、ラミニン、コラーゲンIV、フィブロネクチン及びヘパリン硫酸プロテオグリカン）で富化Iは、マトリックスコラーゲン中に包埋し、バイオリアクターのRWVに添加しました。 10後 - 15日、組織染色分析は、構築物中の絨毛様構造の存在を実証しました。約60 -これらの上皮細胞の80％が、十分に分化した細胞（ 図2）の主要な機能であるECM、近い基礎位置にそれらの核と偏細胞の単層として組織されました。

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Discussion

本稿では、一次ヒトリンパ球、線維芽細胞、および内皮細胞、ならびに腸上皮細胞株^24を含む倍数細胞型から成る、ヒト腸粘膜の生物工学モデルの開発を記載します。この3次元モデルでは、細胞は、微小重力条件下²⁴の下で、コラーゲンが豊富な細胞外マトリックス内で培養されます。

前述したように、このモデルの主な特徴は次の通りである：（i）上皮組織の単層組織を模倣する能力、（ii）の上皮細胞、タイトジャンクション、デスモソームと微絨毛の適切な極性の誘導を、（iii）の長期用語の初代細胞（ すなわち 、線維芽細胞および内皮細胞）の高い生存率を用いた培養（20日まで）、（iv）の発現ビリン、サイトケラチン、E-カドヘリンおよびμを含む組織様分化マーカー抗原刺激の際にかなりのサイトカインの量（ 例えば 、IL-8）およびアルカリホスファターゼを生産するCIN、（V）

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
クワッドローテーター/独立回転壁容器(RWV)バイオリアクター	Synthecon	RCCs-4DQ	最大4隻まで対応。多かれ少なかれ容器を持つモデルも利用可能です。
使い捨て50ml血管	Synthecon	D-405	ボックス、4血管
HCT-8上皮細胞付き	ATCC	CCL-244
CCD-18Co 線維芽細胞	ATCC	CRL-1459
ヒト臍帯静脈内皮細胞	ATCC	CRL-1730	HUVEC
線維芽細胞成長因子-基本	Sigma	F0291	bFGF
幹細胞因子	Sigma	S7901	SCF
肝細胞増殖因子	Sigma	H1404	HGF
Endothelin 3	Sigma	E9137
Laminin	Sigma	L2020	マウスから分離されたEngelbreth-Holm-Swarm腫瘍
内皮成長因子	Sigma	V7259	VEGF
白血病抑制因子	サンタクルス	sc-4377	(LIF
アデニン	シグマ	A2786
インスリン	シグマ	I-6634
3,3',5-トリヨード-L-チロニン	Σ	T-6397	T3
コレラ毒素		Σ C-8052
フィブロネクチン	BD	354008	ヒト血漿から単離
アポトランスフェリン	Σ	T-1147
ヘパリン	Σ	H3149
ヘパラン硫酸  プロテオグリカン	Σ	H4777	マウスの基底膜から単離 Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍
コラーゲンIVシ	グマ	C5533	胎盤から分離された
熱不活化ウシ胎児血清	Invitrogen	10437-028
D-MEM、粉末	Invitrogen	12800-017
10% ホルマリン–PBSの	フィッシャーサイエンティフィック	SF100-4
ウシI型コラーゲン	Invitrogen	A1064401
トリプシン-EDTA	フィッシャーサイエンティフィック	MT25-052-CI
ピルビン酸ナトリウム	Invitrogen	11360-070
ゲンタマイシン	Invitrogen	15750-060
ペニシリン/ストレプトミンシン	Invitrogen	15140-122
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
内皮基礎培地	ロンザ	CC-3156	EBM-2
内皮細胞増殖サプリメント	ミリポア	02-102	ECGS