微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Summary

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、2-D環境（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器（RWV）バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。

Abstract

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、多数の2次元環境における細胞培養の隙間（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）をブリッジする可能性があるからです。実際には、広くフラスコまたはディッシュで増殖した細胞は、脱分化し、それらが由来する組織の特殊な機能を失う傾向があることが認識されます。 （a）は、静的モデルとバイオリアクターを用いて（b）のモデル：現在、天然の細胞外マトリックス（ECM）を模倣する細胞が足場に播種される3-D培養系の2種類が主に存在します。最初のブレークスルーは、静的な3次元モデルでした。このような回転-壁容器（RWV）バイオリアクターなどのバイオリアクターを用いた3次元モデルは、より最近開発されています。 RWVバイオリアクターのオリジナルのコンセプトは、1990年代初頭にNASAのジョンソン宇宙センターで開発された、そのような低酸素性、壊死性コアの開発のような静的なモデルの限界を克服すると考えられています。 RWVバイオリアクターは、番目のを回避する可能性があります栄養と酸素の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって、問題です。これらのバイオリアクターは、彼らの曝気源の種類によって異なる培養容器の二つの異なるフォーマットをサポートし、回転させるのに役立つローテータベースで構成されています。中心部に同軸人工肺で（1）スローターニング横船舶（STLVsを）、または（2フラット、シリコーンゴムガス転写膜を介して酸素との）高アスペクト比の船舶（HARVs）。バブル形成とその結果としての乱流を回避しながら、これらの血管は、効率的なガス移動を可能にします。これらの条件は、モデルは、培養容器内部の重力（重力）を低減し、層流と最小限のせん断力が生じます。ここでは、RWVバイオリアクターが提供する腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力下で培養内皮細胞および線維芽細胞から成るヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。</ P>

Introduction

改善するために、最初の3-Dモデルを構築する画期的な科学者は、足場の異なるタイプの調査を開始したときに、1980年代の初頭に報告された（ 例えば 、ラミニン、コラーゲンタイプI、コラーゲンIV、およびフィブロネクチン）および成長因子のカクテル「静的」3次元モデル^1-7の細胞と細胞とECMの相互作用。それ以来、これらのモデルの主な問題点は、媒体および組織の構築⁸内^の栄養と酸素の転送の制限となっています。血管のネットワークを周囲から栄養と酸素の定常流を受ける生体内環境での細胞とは対照的に、これらのモデルの静的な性質は、細胞へのそれらの効果的な分散を妨げます。例えば、 インビトロで生成された細胞凝集体のサイズは数ミリを超える静的モデルは常に低酸素性、壊死性コア^9を開発^します。 RWVバイオリアクターは、この問題を回避する可能性があります栄養素および酸素^10〜12の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって。しかし、今日まで、RWVバイオリアクターを使用して作業は、1つまたは2つの細胞型^13〜17を含むことに限定されています。また、代わりにネイティブの組織に似た空間的配向の、それらの細胞は、細胞凝集体を形成しました。これらの制限の主な理由は、一元的に細胞を組み込むことができる足場の欠如となっています。現在までにRWVバイオリアクターで使用される足場は、主に合成マイクロビーズ、チューブ状の円筒又は小シート^13-15,19-23のいくつかの例外を除い^16-18、で、構成されています。これらは、その組成や柔軟性に操作することができず、その細胞がその表面に結合して硬い材料です。したがって、一体的に、そのようなことだ間質細胞（ 例えば 、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞）のような種々の細胞成分、これらのモデルを評価するには、システムを提供するとは考えにくいですhouldは密接にヒト組織を模倣するために、足場内に分散します。

ここでは、腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、内皮細胞からなるヒト腸粘膜の多3次元器官型モデルの開発について説明し、線維芽細胞^24。これらの細胞は、RWVバイオリアクター^13,25-30によって提供微小重力下で培養しました。我々の3-Dモデルでは、ECM（ 例えば 、培養中に、無視できる拡散拘束）は、培地に類似オスモル濃度などの多くの異なる特性を有し、細胞および他の関連する細胞外マトリックスタンパク質を取り込む能力、ならびにバイオリアクター²⁴において使用される適切な剛性。生物学的システムは非常に複雑であり、過去数年間、isolatioでそれらを勉強するのではなく、その周囲との細胞の相互作用の検討に向けて粘膜研究の焦点のずれがありましたn個。具体的には、腸細胞の生存および分化に影響を与えるで細胞-細胞相互作用の重要性はよく^31-34に記載されています。具体的には、上皮細胞とそのニッチとの間の通信は、上皮細胞の増殖と分化³⁵に多大な影響を与えています。実際、それは広く受け入れられていることだけでなく、細胞間だけでなく、細胞 - ECM相互作用が3次元培養モデルにおける上皮細胞の維持および分化に重要です。以前の研究は、コラーゲンI ^24,36,37、ラミニン³⁸およびフィブロネクチン^39は、ネイティブ^の粘膜に似た空間的配向を獲得するために腸上皮細胞に影響を与えることに尽力しているとして、その腸のECMタンパク質を実証しました。したがって、腸の表現型の多様性を模倣することができ、当社の3次元モデル^24、のような新しい技術の開発が必要とされている研究者は、複雑な細胞及び構造のアーキテクチャを再作成する場合および腸の微小環境の機能。これらのモデルは、新しい経口薬やワクチン候補の開発および評価における重要なツールを表します。

Protocol

倫理の声明：すべての血液標本は、プロトコル番号HP-00040025から1に参加したボランティアから採取しました。メリーランド大学施設内倫理委員会は、このプロトコルを承認し、この原稿に含まれた研​​究のための健康なボランティアからの血液標本のコレクションを承認しました。本研究の目的は、ボランティアに説明した、そしてすべてのボランティアが知らさ与えた、採血前に同意書に署名しました。

注：培地補充の準備については、 表1を参照してください。 3-D培養培地の調製のための表2を参照されたいです。

培養容器の調製

1. （ 例えば 、RPMI）50ミリリットル、容器の充填ポートのキャップを外し、無菌培養培地50mlで埋めます。層流フード内で無菌状態の下ですべての手順を実行します。
2. キャップを交換し、70％エタノールで任意の表面上の任意のこぼれたメディアを拭きます。
3. 容器はincubを許可します室温でO / Nに少なくとも15分間食べました。
4. 培地を廃棄し、3次元培養液の30ミリリットルを追加するために充填ポートを使用します。
5. 70％エタノールで任意の表面上の任意のこぼれた培地を拭いてください。

細胞の調製

1. ヒト上皮細胞株^{（HCT-8）24,40。}
   1. RPMIで培養細胞、100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、50μg/ mlのゲンタマイシン、2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES緩衝液及び10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS ）（ 補足1）。 5：70％の密集度、1の割合で分割する細胞で。
2. ヒト結腸線維芽細胞（CCD-18Co細胞 ^）24,41。
   1. サプリメント1で強化された基礎イーグル培地で培養細胞密集度で、1の割合で分割する細胞：。3。
3. ヒト臍帯静脈内皮（HUVEC）細胞 24,42。
   1. 100μg/ mlのヘパリン、3 / mlの内皮細胞成長サプリメント（ECGS）、およびサプリメント1で強化された内皮基礎培地で培養細胞（EBM）媒体1の比率で70％の密集度、分割細胞で：。2。
4. リンパ球/単球
   1. 標準的な技術^43を用いた密度勾配遠心分離により血液から末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。
      1. 簡単に言えば、10ミリリットルピペットを使用して、慎重に希釈した血液の30ミリリットルを追加し（1：1の血液：リン酸緩衝食塩水（PBS））密度遠心分離培地の10ミリリットルを含む50ミリリットルコニカルチューブに。遠心分離工程の後、リンパ球および単球は、密度遠心分離媒体とプラズマ層との間の「白」層内に存在します。
      2. トランスファーピペットを用いて、白色層を収集します。密度遠心分離メディアのコレクションを制限することにより、顆粒球汚染を避けます。 ^43を洗浄した後、Uそれ自体PBMCであるか、または液体N ₂中で凍結保存。
         注：PBMCが大きく、樹状細胞および他の細胞型の小さな割合で、リンパ球および単球からなることを強調することが重要です。
5. 5％CO ₂の雰囲気中、37℃で、標準的な培養条件下ですべての細胞を増殖させます。

コラーゲン埋め込まれた細胞の調製

1. -セットアップする実験条件の数に基づいて、必要な挿入の数を決定します。 6ウェルプレートのウェルに挿入物の適切な数を配置します。
2. HUVECおよび線維芽細胞の懸濁液を準備します。
   1. PBS中で2回フラスコを洗浄し、0.05％トリプシン四ナトリウムエチレンジアミン（トリプシンEDTA）でトリプシン、0.25％（1×）を使用して細胞を剥離。細胞培養表面領域の全体をカバーするのに十分なトリプシン溶液を加えます。剥離は、通常15分に5以内に起こります
   2. 収集しますダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）-30％FBS培地30mlを含む50ミリリットルチューブで剥離した細胞。
   3. 10分間、500×gでチューブを遠心。
   4. DMEM-30％FBS培地30mlに細胞を再懸濁。
   5. トリパンブルー色素20μlの再懸濁した細胞を20μlを希釈することにより生存細胞の総数をカウントします。細胞混合物で血球計数器をロードします。生存PBMCを明確に白になります。非生存PBMCは、色素を取得し、青になります。
      1. 8×10 ⁷細胞ミリリットル^- - 5の濃度でDMEM-30％FBS培地中で再懸濁し、各細胞型^1。
3. 細胞含有コラーゲンゲルを準備
   注：各容器は、細胞含有コラーゲンゲルの〜5ミリリットルの準備が必要になります。
   1. 50 mlのコニカルチューブに50μg/ mlのゲンタマイシン、2mMのL-グルタミンおよび10％熱inactivatを補った1×DMEM培地を添加することにより、コラーゲンの混合物を調製エドFBSプラスに3mg / mlのウシコラーゲンI、10 / mlのラミニン、40 / mlのコラーゲンIV、10 / mlのフィブロネクチン、2 / mlのヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび15mMのNaOHで（生理的pHに到達します）。
   2. チューブを閉じて、混合物を完全に均質化されるまで、数回転倒混和します。気泡の形成を避けます。
      重要：ゲル化を防止するために、氷上で混合物を保管してください。
      1. 重要なステップ：混合物は酸性外観（黄色がかった色）を開発する場合は、混合物を中和するために、無菌の1N NaOH数滴を追加します。
   3. それぞれ濃縮されたコラーゲン混合物（上記）に、2.0×10 ⁶細胞/ ml - 1.2および1.5から1.0の密度で濃縮されたHUVECおよび線維芽細胞を追加します。チューブを閉じて、混合物を完全に均質化されるまで、数回転倒混和します。気泡の形成を避けます。重要：ゲル化を防止するために、氷上で混合物を保管してください。
   4. 細胞含有コラーゲンの5ミリリットル - 4を追加します。各インサートのゲルは、以前に6ウェルプレートにロードされ、1時間、ほとんど、あるいはまったく動きとフードにgelifyすることができました。
   5. さらに2時間- 1時間後、1 37℃、5％CO ₂インキュベーターに6ウェルプレートに移します。
   6. フードに6ウェルプレートを返し、そして滅菌ピンセットの助けを借りてとメス無菌的にカットオフ膜を膜から細胞含有ゲルを取り外し、挿入から。小さな正方形に切り離さゲル（〜5×5 mm）をカットします。
   7. 充填ポートを使用して50-mlのHARVに小細胞含有正方形を追加します。
4. HCT-8上皮細胞の懸濁液を準備します。
   1. PBS中で2回フラスコを洗浄し、トリプシンEDTA処理でトリプシン、0.25％（1×）を使用して細胞を剥離。細胞培養表面領域の全体をカバーするのに十分なトリプシン溶液を加えます。剥離は、通常10〜15分以内に起こります。
   2. DMEM-30％FBS培地30mlに剥離した細胞を収集します。
   3. Centrif10分間、500×gでチューブを含むUGE DMEM-30％FBS培地。
   4. DMEM-30％FBS培地30mlに細胞を再懸濁。
   5. 3.2.5で説明したように生存細胞の総数をカウントします。
   6. 10 ⁷細胞mlの濃度でDMEM-30％FBS培地中のHCT-8上皮細胞を再懸濁する^{- 1。}
   7. 充填ポートを使用して50-mlのHARVに濃縮されたHCT-8上皮細胞の1ミリリットルを追加します。
5. 容器がほぼ一杯になるまで、充填ポートを使用して、（〜20ml）でさらに3-D培養培地を加えます。
6. キャップを交換し、70％エタノールで充填ポートの唇を拭いてください。
7. RWVの各シリンジポートに注射器を置き：場所3を含む5ミリリットルシリンジ - 4つのポートでの3次元培養培地1mlと他のポートで5ミリリットル、空のシリンジを。
8. 媒体のほぼ同じボリュームが他のシリンジポートを介して注入されている間、空の注射器に引っ張ることによって、目に見える気泡を除去。
9. VESを配置SELSバイオリアクターで、電源をオンにし、毎分約13〜14回転に速度を設定。
   注：重要なステップ：回転速度は、それによって血管壁との接触を避け、容器内の旋回細胞を維持するために、実験中に数回に調整する必要があるかもしれません。
10. RWVバイオリアクターが提供する37°C、微小重力下での5％のCO ₂での培養細胞、。
11. 新鮮な3-D培養培地で約30 mlで置き換えることにより、4日 - すべての3変化培地。
12. 4日（±1日）の後、バイオリアクターから血管を除去し、（2×10 ⁷ /容器）容器にリンパ球/単球を追加します。
13. さらに5日（±1日）、37℃、5％CO ₂で戻ってバイオリアクター内の血管を置きます。
14. さらに5日（文化の日の9）の後、（2×10 ⁷ /容器）容器にリンパ球/単球を追加して、最大12の追加日間培養を続けます。
15. 新鮮な3-D培養培地で約30 mlで置き換えることにより、4日 - すべての3変化培地。

組織学のため4.収穫は、3次元培養

1. トランスファーピペット採取の補助各小ゲル断片と、現在の10％ホルマリン緩衝液10mlを含有する6ウェルプレートに「構築物」と呼ばれます。 RTで3時間のままにするか、12 - 4℃で16時間。
2. 標識し、各カセットに生検フォームパッドを2枚追加することで、組織処理および包埋カセットを準備します。
3. 10％ホルマリン緩衝液中にカセットを浸します。
4. 鉗子の助けを借りて2フォームパッドとの間に固定された構築物を配置します。
5. 10％ホルマリン緩衝液中にカセットを浸します。
6. 埋め込 ​​み切片、および^44を染色するための標準的な手順を進めます。

Results

これまで我々は、腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力条件^24（ 図1）で培養内皮細胞および線維芽細胞からなるヒトの腸粘膜の多細胞3次元器官モデルを設計してきました。線維芽細胞および内皮細胞は、追加の腸基底膜タンパク質^45（ すなわち 、ラミニン、コラーゲンIV、フィブロネクチン及びヘパリン硫酸プロテオグリカン）で富化Iは、マトリックスコラーゲン中に包埋し、バイオリアクターのRWVに添加しました。 10後 - 15日、組織染色分析は、構築物中の絨毛様構造の存在を実証しました。約60 -これらの上皮細胞の80％が、十分に分化した細胞（ 図2）の主要な機能であるECM、近い基礎位置にそれらの核と偏細胞の単層として組織されました。

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Discussion

本稿では、一次ヒトリンパ球、線維芽細胞、および内皮細胞、ならびに腸上皮細胞株^24を含む倍数細胞型から成る、ヒト腸粘膜の生物工学モデルの開発を記載します。この3次元モデルでは、細胞は、微小重力条件下²⁴の下で、コラーゲンが豊富な細胞外マトリックス内で培養されます。

前述したように、このモデルの主な特徴は次の通りである：（i）上皮組織の単層組織を模倣する能力、（ii）の上皮細胞、タイトジャンクション、デスモソームと微絨毛の適切な極性の誘導を、（iii）の長期用語の初代細胞（ すなわち 、線維芽細胞および内皮細胞）の高い生存率を用いた培養（20日まで）、（iv）の発現ビリン、サイトケラチン、E-カドヘリンおよびμを含む組織様分化マーカー抗原刺激の際にかなりのサイトカインの量（ 例えば 、IL-8）およびアルカリホスファターゼを生産するCIN、（V）

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
クワッドローテーター/独立回転壁容器(RWV)バイオリアクター	Synthecon	RCCs-4DQ	最大4隻まで対応。多かれ少なかれ容器を持つモデルも利用可能です。
使い捨て50ml血管	Synthecon	D-405	ボックス、4血管
HCT-8上皮細胞付き	ATCC	CCL-244
CCD-18Co 線維芽細胞	ATCC	CRL-1459
ヒト臍帯静脈内皮細胞	ATCC	CRL-1730	HUVEC
線維芽細胞成長因子-基本	Sigma	F0291	bFGF
幹細胞因子	Sigma	S7901	SCF
肝細胞増殖因子	Sigma	H1404	HGF
Endothelin 3	Sigma	E9137
Laminin	Sigma	L2020	マウスから分離されたEngelbreth-Holm-Swarm腫瘍
内皮成長因子	Sigma	V7259	VEGF
白血病抑制因子	サンタクルス	sc-4377	(LIF
アデニン	シグマ	A2786
インスリン	シグマ	I-6634
3,3',5-トリヨード-L-チロニン	Σ	T-6397	T3
コレラ毒素		Σ C-8052
フィブロネクチン	BD	354008	ヒト血漿から単離
アポトランスフェリン	Σ	T-1147
ヘパリン	Σ	H3149
ヘパラン硫酸  プロテオグリカン	Σ	H4777	マウスの基底膜から単離 Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍
コラーゲンIVシ	グマ	C5533	胎盤から分離された
熱不活化ウシ胎児血清	Invitrogen	10437-028
D-MEM、粉末	Invitrogen	12800-017
10% ホルマリン–PBSの	フィッシャーサイエンティフィック	SF100-4
ウシI型コラーゲン	Invitrogen	A1064401
トリプシン-EDTA	フィッシャーサイエンティフィック	MT25-052-CI
ピルビン酸ナトリウム	Invitrogen	11360-070
ゲンタマイシン	Invitrogen	15750-060
ペニシリン/ストレプトミンシン	Invitrogen	15140-122
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
内皮基礎培地	ロンザ	CC-3156	EBM-2
内皮細胞増殖サプリメント	ミリポア	02-102	ECGS