初代ヒト気管支上皮細胞は形質導入が困難です。このプロトコルは、レンチウイルスの産生とその濃度、および偽層別皮への分化を通じてこれらの細胞で非常に効率的な形質導入を達成するために必要な最適な培養条件について説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
初代ヒト気管支上皮（HBE）細胞のインビトロ培養で気液界面条件を用いて気道細胞の分化と機能の過程を研究するための有用なモデルを提供します。過去数年間で、導入遺伝子の送達のためのレンチウイルスベクターの使用は、一般的な慣行となりました。特定の非HIV擬似型付けされたレンチウイルスと完全に分化した気道上皮細胞の形質導入の報告がありますが、全体的な形質導入効率は、通常15％未満です。ここで紹介するプロトコルは、レンチウイルスを生成すると、一次ヒト気管支上皮細胞を形質導入するために信頼性の高い効率的な方法を提供します。細胞が付着しながら4の感染因子の多重度で、未分化の気管支上皮細胞、気管支上皮増殖培地で形質導入を使用すると、100％に近い効率を提供します。このプロトコルは、高力価のレンチウイルスベクターの、ステップ・バイ・ステップ、準備と集中を説明し、第電子伝達プロセス。これは、初代ヒト気管支上皮細胞の高効率形質導入を達成するために最適な培養条件を決定した実験について説明します。
概要
複製欠損、偽レンチウイルス（LV）の開発は、 インビトロ 1 で導入遺伝子を提供するために、安全かつ効率的な方法で研究者に提供してきました。それらの長期発現のために、これらのLVはまた、 インビボ 2,3 における治療剤の送達のために使用することができます。トランスファーベクター、パッケージングのgag / POL、パッケージ回転 、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）プラスミドエンベロープ：LVの製造は、いくつかのプラスミドを有するヒト胚腎臓（HEK）細胞の同時トランスフェクションを必要とします。 rev遺伝子は、別々のパッケージングプラスミド上にコードされているため、第三世代のパッケージングシステムは、それによって複製コンピテントレンチウイルスを生成するための組換えの可能性を低減する、第二世代のシステムよりも安全と考えられています。第二世代のパッケージングシステムが5倍高い総伝達ユニットを得ているが、元のウイルスゲノムの分割が作成します第三世代のシステムは、最小限3,4形質導入のレベルを減少しました。
細胞株は、より容易かつ効率的に形質導入することができるが、これらは、 インビボの組織5,6のより代表的なもので....
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プロトコル
1.ステージ1：HEK 293Tの文化
- 高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより（HEK媒体という）HEK細胞の培地を調製します。
- コートコラーゲンのコラーゲンI.ミックス30μlの私の蒸留水2ml中で1 10cmの組織培養皿。皿にミックスを広げ、37℃で2時間、5％CO 2インキュベートします。
- ミックスを削除し、15分間クリーンベンチ内の食器乾燥させます。
- 10ミリリットル中に1×10 6細胞の密度HEKメディアでコーティングされたディッシュ上にプレートHEK細胞と、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
- HEK細胞50〜60％コンフルエント（ 図1a、メッキ後2-3日）である場合、密集度の2視覚的評価が十分にあるステージに進みます。いいえ定量化は必要ありません。
注：HEK細胞（上記参照）HEK培地中で培養されます。彼らはコンフルエントに達し、トンちょっと分割（ 例えば 1/5）以降の使用のためにダウンして凍結することができます。
2.ステージ2：HEK細胞でのレンチウイルス（LVの）の生産と集中....
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結果
図1は、トランスフェクションプロセス中に細胞およびソリューションを評価する別の重要なステップを示している。 図1aは、従来のウイルス産生のためのトランスフェクションHEK293T細胞の最適なコンフルエンシーを示します。細胞をシャーレ全体に均等に分配されることが重要である。 図1bは、明視野光学と10倍の対物レンズを用いてトランスフェクション混合物の低下に沈殿物を明らかにする。より多くの析出物は砂粒よりもむしろ凝集塊のように見え、より効率的なトランスフェクションになります。この絵では、沈殿物は、ビット粗いです。沈殿物をトランスフェクションは、ウイルスの高力価を生成するかどうか信頼できる指標です。成分のいずれかが欠落しているか、品質に問題（例えば、ベクターDNA）のいずれかである場合、凝集体は不吉な兆候である、形成されます。このような場合は、その確認して、手順を中止して再起動する賢明です全ての成分は混合されている、および/ またはベクターDNAとパッケージDNAの品質を.......
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ディスカッション
ここで説明するプロトコルは、100％の形質導入効率に近い保証します。しかし、この目標を達成するために重要な工程中のステップがあります。例えば、トランスフェクションプロセスの間に、日形質導入（ 図1b及びd）の後、形質導入ミックス（ドロップ）または皿の中の析出物の存在は、両方の良いトランスフェクションのために関連しています。沈殿物または凝集体の存在の欠如が原因のトランスフェクション試薬の1つの省略、pHが発行、または不良のプラスミド調製物であることができます。沈殿物が存在しない場合は、いずれも次の日に表示されなくなる可能性が高いです。さらに、トランスフェクションおよび歩留まりを妨げ、HEK細胞をデタッチすることがありすぎて、高速トランスフェクション混合物またはHEKメディアを追加します。良好な収率の別の指標は、遠心分離工程の前に6日目である：白色沈殿物をチューブの底に見えるはずです。ほとんどと悪いトランスフェクション何のウイルスは、この白色沈殿物を作成しないだろう。導入プロセスの間に、脱分化し、高い形質導入効率を達成するために、状態のような幹細胞であるれている一次HBE細.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
我々は肺を提供するためのマイアミ大学のライフアライアンスオルガン回復庁に感謝します。我々はまた、我々はまた、ガブリエルGaidoshに感謝図2Bおよび3-D、Cに図3（a）に実験に使用しmCherryをウイルス博士ベンGerovacとリサ・ノヴァクに示す実験に使用したDNA調製のために博士リサキュンチに感謝しますイメージング施設から、マイアミ大学眼科学科。
この研究は、NIH、CF財団博士マティアスSalatheへのフライトアテンダント医学研究所からの助成金が主催されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| HEK293T/17細胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | Sigma | 12306C | を10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン(100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | |
| Calphos | Clontech | 631312 | 2 M カルシウム溶液、2x HEPES 緩衝液 (HBS)、滅菌 H2O |
| ポリチレングリコール 8000 | VWR scientific | 101108-210 | ストック 40% |
| アムホテリシン B | シグマ | A9528 | を 1x |
| トリプシン | Sigma | T4799 | |
| 大豆トリプシン阻害剤 | Σ | T9128 | |
| トランズウェルで使用するトランスフェクション キット12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | 希釈 1:10 in 蒸留水 |
| 臭化ヘキサジメトリン | Sigma | H9268 | ストック 2 mg/ml |
| ピューロマイシン (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo で使用Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | レンチウイルス発現ベクター |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | 包装DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | 包装DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | 包装DNA |
参考文献
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene thera....
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