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方法論記事

腓骨神経損傷方法：神経筋接合部を修復信頼性の高い同定するためのアッセイおよびテスト要因

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DOI:

10.3791/54186

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2016年8月11日

 ,  , 
1Carilion Research Institute, Virginia Tech, 2Carilion School of Medicine, Virginia Tech, 3Department of Biological Sciences, Virginia Tech

この記事について

サマリー

私たちは、マウスの筋肉の再神経支配、したがって神経筋接合部の再生を確実に調べるための神経損傷法を開発しました。この技術では、単純で再現性の高い手術で総腓骨神経を損傷します。 その後、長指伸筋を全体に取り付けて評価する筋肉の再神経支配。

要約

神経筋接合部（NMJ）が加齢、損傷および疾患の結果として有害な構造的および機能的変化を受けます。したがって、のNMJの維持及び修復に関与する細胞および分子の変化を把握することが不可欠です。この目的のために、我々は、確実かつ一貫してマウスでのNMJの再生検査する方法を開発しました。それは膝の近くに腓腹筋腱の外側頭の上を通過するように、この神経損傷の方法は、共通の腓骨神経を破砕することを含みます。 70日齢の雌のマウスを使用して、我々は運動軸索がポストクラッシュ7日以内に、前シナプス後の標的を神経再支配し始めることを示しています。彼らは完全に12日までに、以前のシナプス領域を再占拠します。この傷害の方法の信頼性を決定するために、我々は個々の70日齢の雌マウスとの間神経再支配率を比較しました。我々はreinnervatedシナプス後サイトの数は7、9でマウスの間で類似していたことがわかった、と12日後にクラッシュ。かどうかを確認するにはこの傷害アッセイはまた、筋肉の分子の変化を比較するために使用することができ、我々は、筋肉ニコチン性受容体（γ-のAChR）および筋特異的キナーゼ（ムスク）のγサブユニットのレベルを調べました。ガンマのAChRサブユニットとムスクは非常に次の除神経をアップレギュレートし、のNMJの再神経支配次の通常のレベルに戻っているします。我々は、これらの遺伝子と筋肉の神経支配の状態のための転写レベルの間の密接な関係を発見しました。我々は、このメソッドはNMJや他のシナプスを修復に関与する細胞および分子変化の我々の理解を加速すると考えています。

概要

若い成人および健康な動物では、神経筋接合部(NMJ)は、α運動軸索の神経終末であるシナプス前と、ニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)が選択的に凝集する錘外筋線維の特殊な領域であるシナプスとの間の非常に安定した接続です。 シナプス前およびシナプス後の装置のほぼ完全な配置は、適切な神経伝達、α運動ニューロンと筋線維の生存、および運動機能に必要です。 残念ながら、NMJの機能は、老化、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、自己免疫疾患、筋肉や末梢神経の損傷などの疾患によって悪影響を受けます2-5。これらの侮辱は、しばしばシナプス前神経終末の変性をもたらし、筋肉を除神経し、運動能力を著しく変化させます。 そのため、NMJの維持・修復に機能する分子の同定が課題となっています。 末梢神経は標的を再生し、再神経支配するため、末梢神経損傷モデルは、NMJの再生に関連する分子変化を特定するために使用されてきました。

末梢神経損傷モデルは、しばしば特定の神経枝を完全に切断または粉砕することを含みます6. 切開後、神経内膜チューブを改質する必要があり、標的細胞や組織の軸索再生と再神経支配を遅らせます。 このタイプの損傷の重症度は、軸索が元の経路から蛇行し、元のターゲットに到達できなくなる原因にもなります。 これは、神経内膜が連続したままの圧迫によって損傷した神経とは対照的であり、再生する軸索の効率的かつ適切な再成長のための道を提供します。 また、軸索が元の筋繊維パートナーを見つけて再神経支配することも可能にします。損傷モデルに関係なく、軸索が標的を再生および再神経支配するためには、多くの細胞および分子の変化が起こらなければなりません。 損傷後、ターゲットの近位にある神経セグメントは、ウォーラー変性7と呼ばれるプロセスによって分解され、除去されます。このプロセスは、シュワン細胞を非髄鞘細胞に再プログラミングし、非分化化細胞にすることで、再生因子を分泌し、ミエリンを除去し、マクロファージを損傷部位に動員する8。 マクロファージは、ミエリンと軸索の破片のクリアランスを完了し、そうでなければ再生する軸索9の成長を妨げることになる。 並行して、運動ニューロンと感覚ニューロンは、切断された軸索の再生を促進するために必要なメカニズムを活性化します。 再生する軸索が標的に到達すると、成長円錐形から、情報を適切に伝達(運動軸索の場合)または受信(感覚軸索の場合)できる神経終末に変換する必要があります10。 この点で、α運動軸索は、それらの成長円錐が、標的筋線維11上のシナプス後部位にほぼ完全に対抗する完全に機能するシナプス前神経終末に分化する一連のよく調整された変化を経る。

坐骨神経、脛骨神経、副神経は、軸索およびNMJ再生を研究するための主要な選択肢でした12-14。 しかし、これらのモデルを使用して、動物間および異なる条件下でのNMJの再生に関連する細胞および分子の変化を調べる場合、いくつかの欠点があります。 まず、坐骨神経は後肢の筋肉の大部分を供給しており、損傷は動きと感覚の両方を大幅に制限します。 したがって、この方法を使用して、運動を単独で、または他の要因と組み合わせて影響を研究することはできません。 さらに、坐骨神経はかなり厚い構造であるため、すべての軸索を完全に損傷するには大量の圧縮力が必要です。 これにより、より表面的な軸索が完全に切断され、より深い横たわる軸索の神経内管は無傷のままになり、これらの軸索間の再生の速度と忠実度に大きな変動が生じる可能性があります。 この神経の完全な切断は、多くの軸索が同じ筋線維と再接続できないことを考えると、さらに望ましくありません。 問題を複雑にしているのは、坐骨神経は、その末端神経枝の数と起点の両方において、固有の解剖学的変動性を持っていることです。 したがって、同じ部位を損傷することは非常に困難です。 脛骨神経は小さく、傷害を潰しやすいですが、この神経枝の病変部位として機能するランドマークもすぐに利用できるものはありません。

胸鎖乳突筋に供給する副神経枝(脳神経XIの一部)は、NMJの再生を研究するためにも使用されています15。 この神経は、胸鎖乳突筋のNMJが他の筋肉のNMJと比較して生きた動物でより容易に画像化できるため、特に魅力的です。 しかし、坐骨神経や脛骨神経と同様に、同じ場所でこの神経を損傷するために使用できる特定のランドマークはなく、実験コホートの個々の動物間でNMJの再生を比較するためのモデルとしては限られています。 病変部位に一貫性がないと、NMJ再神経支配の速度にばらつきが生じます。 これらの欠点のため、ここで紹介する手順では、再生中のNMJを調べるために、異なる末梢神経枝の損傷を利用します。

総腓骨神経とも呼ばれる総腓骨神経は、動物間および異なる治療間でのNMJの再生を調べるための信頼性の高い神経となる多くの特徴を含んでいます。 総腓骨神経は、膝の腓腹筋の外側頭の腱を走るため、予測可能な解剖学的経過をたどり、交差点は病変の安定したランドマークとして機能します。 神経は、関心のある筋肉の近くにあるが解剖学的に分離されている、小さくて低侵襲の切開部を通じてアクセスされます。 ここで紹介した知見は、70日齢の若年成人女性マウスの腓骨神経を粉砕してから8日後に、再生する運動軸索が長指伸筋(EDL)のNMJを改革し始めることを示しています。 重要なことは、再神経支配のパターンと速度は、同じ年齢と性別の動物間で一貫しているため、NMJの維持と修復に必要な細胞および分子の変化についての理解を大幅に促進する信頼性の高い損傷モデルを提供することです。

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プロトコル

全ての実験は、NIHガイドラインとバージニア工科大学施設内動物管理使用委員会によって承認された動物プロトコルの下で行いました。

外科1.準備動物

  1. 滅菌した1 mlのインスリンシリンジで、皮下鼠径注射ケタミンの混合物（90ミリグラム/ kg）およびキシラジン（10mg / kg）でマウスを麻酔。キャリア溶液は、0.9％生理食塩水、17.4 mg / mlでケタミン、および2.6 mg / mlとキシラジンの混合物が含まれています。有効にする薬を待っている間にケージに戻って動物を置きます。
    注：負荷用量は処置の持続時間のために十分な麻酔を提供しない場合は、負荷用量の追加の25％が注入されてもよいです。
  2. モニターの動物は着実に呼吸数と覚醒レベルの適切なうつ病をチェックするために注射を投稿してください。十分に麻酔をかけたときに何の応答を惹起してはならない後足のピンチで覚醒レベルを確認します。
    注：これは通常3-5かかります25〜30グラムを平均し、若い成体マウス分間。動物は、10分後の注射後も応答する場合、麻酔負荷用量の追加の25％が注入されてもよいです。
  3. 乾燥を防ぐために動物の目にワセリンと軽鉱油眼軟膏を適用します。ケージから動物を取り外し、きれいな、平らな面に置きます。手足の唯一の外側面を露出させ、電気ヘアトリマーを使用して、骨盤に足から所望の後肢を剃ります。
  4. 1分間剃らサイトに化学脱毛剤を適用します。手動の実験室ワイプを使用して髪を削除します。実験室できれいに脱毛エリアをエタノールに浸したワイプ。

2.外科的手順

  1. オートクレーブまたは他の適切なメソッドを介して手術器具を滅菌します。 80％エタノール/ H 2 0と、手術部位や手術用ボードを清掃してください。 proviodineで手術部位を消毒します。手術用ボード上にマウスを置き、手足の拘束と合わせます。キープ膝関節と解剖学的に自然な位置にターゲット後肢がわずかに内部または外部回転させずに拡張しました。
  2. 手術用顕微鏡下で動物とボードを置きます。表面的なランドマークの触診、特に骨膝関節と前脛骨筋と腓腹筋の筋肉の間の尾根を経由して、適切な切開部位へのオリエント。
  3. 把持するための一般的な鉗子を使用しながら、メスやスプリングはさみを使って皮膚を介して約3cmの切開を行います。共通の腓骨神経の基礎となるコースに垂直切開を行います。
  4. 大腿二頭筋と外側広筋の筋肉を露出させ、浅筋膜を通して切開を続けます。接続深い筋膜を切断することにより、これらの筋肉を分離します。 1〜2センチメートルカットが十分でなければなりません。
  5. 上腕二頭筋を撤回共通腓骨神経を明らかにし、機械的なリトラクターを使って尾側筋肉大腿。
  6. そのインターまで近位に神経をトレース腓腹筋の外側頭の腱を持つセクションが発見されました。注：暴露は後退し、皮膚と筋肉の追加の操作が必要な場合があります。この交点は、神経損傷のための安定したランドマークとして使用されます。
  7. 腓腹筋腱の外側縁に平行にヒントを合わせて、細かい鉗子で神経をつかみます。 5秒間安定し、ハード圧力を加えることにより、共通の腓骨神経をつぶします。
  8. 外科手術用スコープを通して目視検査で神経の完全なクラッシュを裏付けます。これは、損傷部位で半透明表示されます。末梢軸索内の蛍光タンパク質を発現するマウスを使用している場合、蛍光が損傷部位から消えます。
  9. 開創器を取り外し、その解剖学的位置に筋肉を再調整。 6-0絹縫合糸で切開部位を閉じます。 1-3単純結節縫合で十分です。クリーンケージ内の加熱パッド上療養マウスを置きます。
  10. 2時間後にオペラのためのすべての動物を監視しますションは、呼吸や麻酔への副作用をチェックします。すぐに手術からの回復次の皮下鼠径部の注射を介してブプレノルフィン0.05から0.10まで10mg / kgの初期用量を投与。 3追加の用量次の48時間にわたって12時間毎に与えます。完全に回復した後、動物のケア施設にマウスを返します。

3.単離と染色伸展のDigitorum長い（EDL）筋肉

  1. イソフルランを使用して動物を生け贄に捧げます。吸収性labwipesを詰めた50ミリリットルチューブに0.5ミリリットルに液体イソフルランを分注します。密封された2500センチメートル3チャンバー内の動物でキャップされていないチューブを置きます。曝露の少なくとも4分で十分です。二国間の眼瞼、つま先のピンチ、およびテールピンチ反射の損失のための試験各動物は灌流を続行する前に、無意識であることを保証します。
  2. 経最初の10mLの0.1M PBSで16匹の動物を灌流し、0.1M PBS（pH7.4）中の4％パラホルムアルデヒドを25ml。ヘパリン（30単位/ 20G動物の体重）の灌流の結果を向上させる、小さな毛細血管床に血液凝固を防ぐために、（10単位/ ml）のPBSを添加してもよいです。
  3. 腹部の周囲の皮膚を通って横方向にカットするはさみを使用して、後肢を覆っている皮膚を取り除きます。ピンセットを用いて、後肢と足を過ぎて皮膚をピールダウン。
  4. 把持鉗子で剥がして後肢の浅筋膜を削除します。末梢軸索内の蛍光タンパク質を発現するマウスを使用している場合は、50mlチューブに4％PFA中で一晩全体のマウスをポスト修正。 PBSで3回洗浄します。
    注：固定したマウスは、4℃でPBS中に保存することができます。ない場合は、このステップをスキップし、定着後の動物せず3.6に進みます。
  5. できるだけ無傷の近位および遠位腱を維持することを確認され、マウス後肢からEDL筋18を解剖。
  6. 少なくとも1時間、緩衝液（0.5％トリトンX-100を、3％BSAおよび5％ヤギ血清を含む1×PBS）でブロッキングEDL筋をインキュベートします。
    7. ニューロフィラメント（千1）を含有する試験管に運動軸索とその神経終末、場所の筋肉を可視化するために。筋肉を1×PBSで3回、10分毎の時間を洗ってください。注：末梢軸索内の蛍光タンパク質（XFP）を発現するマウスを使用している場合、この手順を省略してください。
  7. 完全なNMJの神経支配のための陽性対照として、反対無傷EDLを染色します。陰性対照は、4日後の傷害、NMJが完全に除神経された時点で得られEDLだけでなく、二次抗体のみで染色したEDLを含める必要があります。
  8. 1日のニューロフィラメントおよびシナプトタグミン-2を検出するために、適切な蛍光タグ付けされた二次抗体を用いて筋肉をインキュベートします。筋肉を1×PBSで3回、10分毎の時間を洗ってください。注：このステップは、ステップ3.10と一緒に行うことができます。末梢軸索内の蛍光タンパク質を発現するマウスを使用している場合、この手順を省略してください。
  9. postsyを可視化するために、NMJのnaptic領域は、5μg/ mlの少なくとも2時間、ブロッキング緩衝液中に希釈したアレクサ555共役アルファ - ブンガロトキシンで筋肉をインキュベートします。筋肉を1×PBSで3回、10分毎の時間を洗ってください。
  10. 正に荷電したガラススライド上に全体の筋肉をマウントするには、スライド上のメディアをマウントベースグリセロールの数滴を追加し、カバーガラスで覆い、スライド上に直接筋肉を置きます。筋肉を平らにするスライドに対してカバーガラスを押してください。実験用ワイプを使用してスライドとカバーガラスの周囲から取り付けメディアをオフに浸します。カバースリップとスライドの間のエッジをシールするためにマニキュアを適用します。

4.イメージングとデータ解析

  1. NMJ、画像488、555および633 nmの光を励起し、20X及び40Xの目的で放出された光を捕捉するように装備共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてEDL筋の構造を解析します。
  2. 全体のNMJを視覚化するために、光秒の最大値投影画像を作成しますションは離れてNMJのに最高の可視領域の最下位から伸びる1〜2μmで間隔をあけ。市販のイメージングソフトウェアを使用して、最大強度の投影を作成します。
  3. 1）完全に除神経=シナプス後部位が軸索とAChRs間の軸索と接触し、5％未満の共局在を完全に欠いている：として神経再生の速度を決定するために、のNMJを分類。 2）部分的に神経支配=軸索は、部分的に軸索とAChRs間postsynapse 5〜95％の共局在と重なります。 3）全神経支配=前後シナプス間のほぼ完全な同格、軸索とAChRsの間、95％を超える共局在。撮像面に対して垂直に位置するか、完全に画像で視覚化されていないのNMJを除外します。注：すべてのこれらの実験では、少なくとも3匹の動物および動物あたり50のNMJを調べました。結果は、0.05未満のP値はスチューデントt検定を用いて有意とみなしました。
  4. 演算子を盲目にするには、別々の個人が実行することができます手術および画像解析。治療群の知識がなくても、アナライザは、NMJの得点と客観することができます。代替的に、画像はランダム化原料動物の知識なしに分析のためにオペレータに提示することができます。

5.定量PCR

  1. イソフルランと頸椎脱臼を使用して動物を生け贄に捧げます。皮膚とステップ3.3に応じて足の筋肉を覆う浅筋膜を削除します。 3.4段階に応じて前脛骨とEDL筋肉を解剖。
  2. Flashは、液体窒素に対する1.5mlチューブ全体の前脛骨とEDL筋肉を凍結します。部分的に液体窒素中に沈め予め冷却乳鉢でチューブと場所から組織を削除します。乳鉢と乳棒を用いて微粉末に凍結された筋肉を挽きます。
  3. 市販のRNA抽出試薬に凍結筋肉粉末を溶解し、市販のキットを製造業者のIに従っててRNA抽出およびゲノムDNAの除去を行いますnstructions。
  4. 製造元の説明書に従って市販の逆転写酵素ミ​​ックスを用いて逆転写を行います。
  5. （材料の表を参照）、適切なハウスキーピング遺伝子を用いて、市販のキットを用いて定量PCRを実行します。 （材料の表を参照）、PCRを実施するために、市販の定量的PCRサーマルサイクラーを使用してください。
  6. 58℃に設定し、アニール温度。 Taqポリメラーゼ/ SYBRグリーンミックスの製造業者の仕様書に追加のサイクリングパラメーターを調整します。プライマー特異性についてテストし、プライマーダイマー形成するために95℃まで65℃から0.5℃の増分増加からなるサーマルサイクラープログラムの最終融解曲線ステップを含みます。
  7. コントロール遺伝子として18S RNAを用いて、ΔΔCT法 21から2による相対mRNA発現レベルを決定します。

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結果

共通腓骨神経は、また、総腓骨神経と呼ばれる、それは脚部（ 図1A）の前方側面に腓骨の頭の周りに揺動膝窩、上記の坐骨神経から生じます。そこに浅と深い腓骨神経に分岐し、一緒に（前脛骨筋、長指伸筋とブレビス、および伸筋halluces長い筋）足の背屈筋とつま先を供給し、足のeverters（腓骨筋）。この神経はまた、足の甲と足の下半分の外側面に突出感覚線維を運びます。それは、運動および感覚軸索から成る比較的薄い構造です。この神経枝は、予測可能な解剖学的経過をたどります。それは腓腹筋（ 図1および図2）の外側頭の腱上で実行されるように膝に横方向、神経は主に表面的です。目場所は容易に皮膚および筋膜（ 図1A）への損傷を制限し、小さな切開で到達することができ安定したランドマークとして機能しています。坐骨及び脛骨神経に比較して、この神経の小さい直径は、完全より表面軸索を切断する可能性を減少させる、より少ない力を使用して、すべての軸索を粉砕することができ...

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ディスカッション

この原稿に提示された方法は、神経筋接合部（NMJ）の修復に関与するメカニズムを識別するためのユニークな機会を提供しています。それは膝の近くに腓腹筋腱上を通過するように、この方法は、共通の腓骨神経を破砕することを含みます。私たちは、ピンセットで神経圧迫のわずか5秒後に、完全な変性は、損傷後4日までに指摘されていることを示しています。若い成体マウスでは、アルファモーター軸索は12日までに損傷していないマウスのものと区別できないシナプス前部位の改革で最高潮に達する、損傷後7日目に長指伸筋筋（EDL）の前のシナプス部位を神経再支配し始めます。加えて、我々は選択NMJ関連分子のレベルが密接にNMJの神経支配の状況と相関することを示しています。重要なことは、これらの細胞および分子の変化は、識別するための機会とTESを提供し、同じ性別と年齢（ 図5a-B）の動物間で高度に再現可能ですNMJを修復するように作用するT因子。それは周囲の筋肉や血管系にはほとんど損傷をもたらすだけ小さな切開を必要とする、腓腹筋腱上を通過する外科的手技の面では、共通の腓骨神経枝は非常にアクセス可能です。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、実験に対する知的インプットと原稿へのコメントに対して、バルディーズ研究室のメンバーに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ケタミンVetOne501072
キシラジンロイド株式会社 003437 
ブプレノルフィン ズーファーム1Z-73000-150910 
NairNair
Kim-wipesKimtech34155
電気かみそりBraintree ScientificCLP-64800
80% EtOH/H20
10% プロビオジン
1 ml インスリン シリンジ
スプリングはさみVannas91500-09
No. 15Braintree ScientificSSS 15
#5 ForcepsDumont11252-00
6-0 シルク縫合糸 逆切断針 縫合エクスプレス752B 
げっ歯類の加熱パッドBraintree ScientificAP-R-18.5
Alexa 555 共役α-BTX分子プローブB35451
VectashieldVector LabsH-1000
オリンパス ステレオズーム顕微鏡オリンパス562037192
ツァイス 700 共焦点顕微鏡ツァイス
可変流量蠕動灌流ポンプFisher Scientific13-876-3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820
Bio-Rad iScript RT SupermixBio-Rad1708840
SsoFast Evagreen SupermixBio-Rad1725200
Bio-Rad CFX96Bio-Rad1855196
Puralube Vet 軟膏Puralube1621
Synaptotagmin-2抗体抗体-オンラインABIN401605
ニューロフィラメント抗体抗体-オンラインABIN2475842
メス

参考文献

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