原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

Summary

私たちは、ミクロ、メソ、マクロスケールで脳の粘弾性力学的特性を特徴づける一連の技術を提示します。

Abstract

機械的な模擬または組織再生研究のためかどうか、脳の性質に触発された材料を設計エンジニアには、脳組織自体がよく、様々な長さと時間スケールで特徴づけされなければなりません。多くの生物学的組織のように、脳組織は、複雑な階層構造を示します。しかし、大部分の他の組織とは対照的に、脳はPaで数百のオーダーのヤング弾性率をEと、非常に低い機械的剛性のものである。この低剛性は、キーの機械的特性の実験的特性評価に課題を提示することができます。ここでは、異なる長さスケールおよび負荷速度で、例えば、脳組織などの水和、コンプライアントの生物学的材料の弾性および粘弾性特性を測定するように適応されているいくつかの機械的特性評価技術を実証します。マイクロスケールで、我々は原子間力顕微鏡対応のインデントを使用して、クリープコンプライアンスと力緩和実験を行います。 mesosでCALEは、我々は振り子ベースのインストルメント圧子を使用して、衝撃インデント実験を行います。マクロスケールで、我々は周波数に依存するせん断弾性率を定量化するために平行プレートレオメトリーを行っています。また、それぞれの方法に伴う課題や制限について説明します。一緒にこれらの技術は、より良い脳の構造を理解するために、バイオ風の材料を操作するために使用することができます脳組織の徹底的な機械的特性評価を可能にします。

Introduction

生物学的器官を含むほとんどの軟組織石灰化した骨または工学材料と比較して機械的及び構造的に複雑な、低剛性であり、非線形および時間依存の変形を示します。体内の他の組織と比較して、脳組織は^1Paで数百程度の弾性率をEと、格段に準拠しています。脳組織は、異なるとの構造的不均一性を示し、また、機能的に異なるグレーと白質領域を互いにかみ合っ。脳組織の力学を理解することは、傷害の間に脳の応答を模倣する材料と計算モデルの設計に役立つ機械的損傷の予測を容易にし、保護戦略の設計を可能にします。さらに、このような情報は、組織再生のための設計目標を考慮するために使用することができ、より良好な多発性硬化症や自閉症などの疾患と関連している脳組織の構造的変化を理解します。 HERE、我々はメソ、ミクロで、脳組織を含む機械的に準拠した組織の粘弾性特性を特徴づけるために利用可能ないくつかの実験的アプローチ、およびマクロスケールを説明し、実証します。

マイクロスケールで、我々はクリープコンプライアンスを行い、原子間力顕微鏡（AFM）対応のインデントを使用して緩和実験を強制します。典型的に、AFM対応くぼみは、試料^2-4の弾性率（または瞬間剛性）を推定するために使用されます。しかし、同一の器具はまた特性^5-10（タイムまたはレートに依存）マイクロ粘弾性を測定することができます。 図1に示すこれらの....

Protocol

倫理声明：すべての実験プロトコルは、ボストン小児病院の動物研究委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に準拠していました。

1.マウスの脳組織取得の手続（AFM-有効インデントとインパクトのインデント用）

1. マウスを麻酔するためにケタミン/キシラジン混合物を準備します。 5 mlのケタミン（500 mg / mlで）を1 mlのキシラジン（20 mg / mlで）0.9％食塩水7mlのを組み合わせます。
2. マウス（品種：; SYN-Creを、TSC1をPLP-EGFP;年齢：P21;性別：男性または女性）を注入ケタミン/キシラジン液のグラム体重あたり7μlの。
3. マウスが完全に麻酔したら、つま先と尾ピンチへの応答の欠如によって示されるように、大規模な解剖ハサミを使用して、断頭によりマウスを安楽死させます。
4. 小さい解剖ハサミを使用して中央を切り下げることで頭蓋骨を削除します。小脳で開始し、レム曲がったピンセットを用いて頭蓋骨のオベ枚。頭蓋骨を除去した後、小脳から始まる、脳を持ち上げる平坦スパチュラを使用して、脳を抽出し、ペトリ皿に脳を置きます。カミソリの刃を使用して、脳から小脳を削除します。
5. 新鮮な組織に影響押込試験のために、脳全体を使用している場合、それ以外の場合は手順をスライスするために1.6に進み氷上の成体神経組織のためのCO ₂....

Results

図4は 、それぞれ適用された力あるいは押し込み深さ（ 図4A、D）、与えられた、クリープコンプライアンスのための時間応答（ 図4B、E）対代表インデントと力を示し、リラクゼーション実験を強制します。これらのデータおよびシステムの幾何学的形状を使用して、クリープコンプライアンスJの _C（t）と緩和弾性率G _R（t）を強制することは、脳の異なる領域（ 図4C、F）について計算することができます。以前の研究は、脳²³の異なる領域の弾性率の差を示しているが、粘弾性特性は、所与の組織切片内の地域間変動を示していないマウスの脳組織切片のためにこのようにして測定しました。

インパクトのインデントは、空間的および時間的にconcen.......

Discussion

本論文で各技術は、脳組織の機械的性質の異なる側面を測定します。クリープコンプライアンスと応力緩和弾性率は時間に依存する機械的特性の尺度です。貯蔵弾性率および損失弾性率は、速度に依存する機械的特性を表します。インパクトインデントも速度に依存する機械的特性を測定したが、エネルギー散逸のコンテキストインチ組織の機械的特性を特徴づけるとき、両方のAFM対応インデントおよびレオロジーは、通常の方法を使用しています。前述のように時間に依存する材料特性を提供することに加えて、種々の実験パラメータは、細胞および組織の弾性率^4、さらに周波数依存特性^24を測定するために使用することができるので、AFM対応インデントは特に有用です。しかし、実験のデータと設計の正確な解釈は準拠して、水和した組織のために挑戦することができます。レオメトリー対策が適切一括ながら組織、AFM-有効インデントの絆は、細胞の微小環境に関連するマイクロスケールのボリュームを検査します。インパクトのインデントは、材料が焦点衝撃による外傷性脳損傷を研究するような用途において有用である濃厚、動的衝撃荷重の文脈に変形する方法を具体的に定量化する手段を提.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
キシラジン	ロイド ラボラトリー処方		薬
ケタミン	AnaSed 注射剤
ビブラトーム(振動刃ミクロトーム)	ライカ	VT1200
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	成人組織用 CO2非依存神経培地
原子間力顕微鏡、MFP-3D-BIO	アサイラム・リサーチ	-
シャーレ・ヒーター	アサイラム・リサーチ
- AFM プローブ、0.03 N/m、10 &マイクロ;m半径ホウケイ酸球	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	ムール貝由来の生体接着
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5761	代替サプライヤーは、
水酸化ナトリウム、1 N	Sigma-Aldrich	59223C	代替サプライヤーを使用できます
計装インデンター、NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.	-	プローブ先端を機械加工する必要があります(スチールフラットパンチ、1 mm径、4-5 mmの長さ)
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.	-
平行平板レオメーター MCR501	Anton-Parr-PP25
	Anton-Parr-25		mm直径フラット測定プレート
接着剤サンド	ペーパーMcMaster-Carr	4184A48	サプライヤーを使用可能
Loctite4013インスタント接着剤	ヘンケル	20268	代替サプライヤーを使用可能