方法論記事

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

DOI：

10.3791/54201

⸱

2016年9月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、ミクロ、メソ、マクロスケールで脳の粘弾性力学的特性を特徴づける一連の技術を提示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

機械的な模擬または組織再生研究のためかどうか、脳の性質に触発された材料を設計エンジニアには、脳組織自体がよく、様々な長さと時間スケールで特徴づけされなければなりません。多くの生物学的組織のように、脳組織は、複雑な階層構造を示します。しかし、大部分の他の組織とは対照的に、脳はPaで数百のオーダーのヤング弾性率をEと、非常に低い機械的剛性のものである。この低剛性は、キーの機械的特性の実験的特性評価に課題を提示することができます。ここでは、異なる長さスケールおよび負荷速度で、例えば、脳組織などの水和、コンプライアントの生物学的材料の弾性および粘弾性特性を測定するように適応されているいくつかの機械的特性評価技術を実証します。マイクロスケールで、我々は原子間力顕微鏡対応のインデントを使用して、クリープコンプライアンスと力緩和実験を行います。 mesosでCALEは、我々は振り子ベースのインストルメント圧子を使用して、衝撃インデント実験を行います。マクロスケールで、我々は周波数に依存するせん断弾性率を定量化するために平行プレートレオメトリーを行っています。また、それぞれの方法に伴う課題や制限について説明します。一緒にこれらの技術は、より良い脳の構造を理解するために、バイオ風の材料を操作するために使用することができます脳組織の徹底的な機械的特性評価を可能にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物学的器官を含むほとんどの軟組織石灰化した骨または工学材料と比較して機械的及び構造的に複雑な、低剛性であり、非線形および時間依存の変形を示します。体内の他の組織と比較して、脳組織は1Paで数百程度の弾性率をEと、格段に準拠しています。脳組織は、異なるとの構造的不均一性を示し、また、機能的に異なるグレーと白質領域を互いにかみ合っ。脳組織の力学を理解することは、傷害の間に脳の応答を模倣する材料と計算モデルの設計に役立つ機械的損傷の予測を容易にし、保護戦略の設計を可能にします。さらに、このような情報は、組織再生のための設計目標を考慮するために使用することができ、より良好な多発性硬化症や自閉症などの疾患と関連している脳組織の構造的変化を理解します。 HERE、我々はメソ、ミクロで、脳組織を含む機械的に準拠した組織の粘弾性特性を特徴づけるために利用可能ないくつかの実験的アプローチ、およびマクロスケールを説明し、実証します。

マイクロスケールで、我々はクリープコンプライアンスを行い、原子間力顕微鏡（AFM）対応のインデントを使用して緩和実験を強制します。典型的に、AFM対応くぼみは、試料2-4の弾性率（または瞬間剛性）を推定するために使用されます。しかし、同一の器具はまた特性5-10（タイムまたはレートに依存）マイクロ粘弾性を測定することができます。 図1に示すこれらの実験の原理は、時間の経過とともに、脳組織内にプローブを片持ちAFMをインデント力や押し込み深さの特定の大きさを維持し、それぞれ押し込み深さと力の対応する変化を測定することです。これらのデータを用いて、クリープCOMPを算出することができますそれぞれliance J Cと緩和弾性率G R、。

メソスケールで、我々は振り子ベースのインストルメントナノインデンターを使用して、組織構造と水和レベルを維持する流体に浸漬条件における衝撃インデントの実験を行いました。実験は、 図2に示されている。振り子が組織と接触するように揺動するように、振動振り子が組織内に静止するまでの変位を時間の関数として記録されているプローブ。プローブの結果として生じる減衰高調波振動運動から、我々は、組織11,12の（エネルギー散逸率に関する）の最大侵入深さx MAX、エネルギー散逸能力K、及び散逸品質係数Qを算出することができます。

マクロスケールで、我々は、周波数依存のせん断弾性率を定量化するために、平行平板レオメーターを使用しました。組織の貯蔵弾性率G '及び損失弾性率G "を 、と呼ばれるレオメトリーのこのタイプでは、高調波角度歪みを適用する（剪断歪みに対応する）既知の振幅と周波数で及びreactionalトルクを測定（及びせん断応力に対応します） 図3に示すように、測定されたトルクの結果として得られる振幅と位相遅れおよびシステムの幾何学的な変数から、我々は興味13,14の印加周波数で"G '及びGを計算することができます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

倫理声明：すべての実験プロトコルは、ボストン小児病院の動物研究委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に準拠していました。

1.マウスの脳組織取得の手続（AFM-有効インデントとインパクトのインデント用）

  1. マウスを麻酔するためにケタミン/キシラジン混合物を準備します。 5 mlのケタミン（500 mg / mlで）を1 mlのキシラジン（20 mg / mlで）0.9％食塩水7mlのを組み合わせます。
  2. マウス（品種：; SYN-Creを、TSC1をPLP-EGFP;年齢：P21;性別：男性または女性）を注入ケタミン/キシラジン液のグラム体重あたり7μlの。
  3. マウスが完全に麻酔したら、つま先と尾ピンチへの応答の欠如によって示されるように、大規模な解剖ハサミを使用して、断頭によりマウスを安楽死させます。
  4. 小さい解剖ハサミを使用して中央を切り下げることで頭蓋骨を削除します。小脳で開始し、レム曲がったピンセットを用いて頭蓋骨のオベ枚。頭蓋骨を除去した後、小脳から始まる、脳を持ち上げる平坦スパチュラを使用して、脳を抽出し、ペトリ皿に脳を置きます。カミソリの刃を使用して、脳から小脳を削除します。
  5. 新鮮な組織に影響押込試験のために、脳全体を使用している場合、それ以外の場合は手順をスライスするために1.6に進み氷上の成体神経組織のためのCO 2非依存性栄養培地を用いて丸底チューブに脳を転送し、セクション4に進みます。
  6. 0.7ミリメートル/秒の速度、70ヘルツの振動周波数、および350ミクロンのスライス厚にビブラトーム設定を調整します。氷でビブラトーム皿を囲みます。ビブラプレート上に瞬間接着剤のDABを置き、冠状スライスを切ることができるように、脳が最初の背側を切断するように配向して、脳をマウントします。
  7. ただ脳を沈めるために十分なダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）でビブラトーム皿を埋めます。レイズブレードがちょうどDPBS中に浸されるようにビブラトーム上の一品。
  8. 押して、350ミクロン厚の冠状脳切片をスライス開始し始めます。
  9. 、組織への損傷を避けるためビブラトームDPBS浴から、氷上で成体神経組織のためのCO 2非依存性栄養培地で丸底チューブに脳スライスを転送し、48時間以内に新鮮な組織上で測定を実行するために絵筆を使用しました。 AFM-有効インデント実験を開始するには、セクション3に進んでください。

2.ブタの脳組織取得の手続（レオロジー用）

  1. 地元の肉屋から犠牲の〜1時間以内に矢状にスライスされたブタの半分の脳を取得します。成体神経組織のためのCO 2非依存性栄養培地中で半分の脳を配置し、氷上で保存します。
  2. 成体神経組織のためのCO 2非依存性の栄養培地中で〜5ミリメートル厚の冠状脳切片と店舗を作るためにカミソリの刃またはメスを使用してください。ことを確認し、スライスsurfaceはできるだけ平坦です。セクショニング中にカミソリ/メスで慎重に横方向の動きを使用してください。
  3. 氷上の成体神経組織のためのCO 2非依存性の栄養培地中でストアブタの脳組織および48時間以内の新鮮な組織上のレオメーター測定（第5節）を行います。

3.原子間力顕微鏡対応のインデント

  1. 製造元の指示に従って、イガイ由来の生体接着性と60ミリメートル直径のペトリ（P60）の料理を準備します。
    1. 8.0の最適pHを有する滅菌水に0.1 M炭酸水素ナトリウムからなる中性緩衝液のストックを準備します。フィルター滅菌（0.2ミクロン）、4℃で炭酸水素ナトリウム緩衝液とストア。
    2. 層流フード中で、重炭酸ナトリウム緩衝液中の6.25％のイガイ由来の生体接着3.125％のNaOHの溶液を混合します。
    3. ゾルを広めるために60ミリメートル直径のペトリ（P60）ディッシュと利用ピペットチップ上に3.1.2からの生体接着剤溶液のピペット100μlの3〜5センチメートル直径の円形にution。
    4. （30分〜）の乾燥ソリューション層流フードで明らかになったP60ディッシュのままにしてみましょう。洗浄皿をPBSと滅菌水で2倍と1倍。 1ヶ月まで4℃で密封されたビニール袋での層流フードとストア内の食器の空気が乾燥してみましょう。
  2. AFMにおけるAFMとセットアップ脳試料を調整します。
    注：メーカーごとにAFMキャリブレーション手順に従ってください。
    1. 慎重にプローブホルダに0.03 N / mおよび20μmの直径ホウケイ酸ビーズの公称ばね定数とAFMプローブをロードします。
    2. 熱調整方法15,16を用いたAFMカンチレバーのバネ定数と逆光てこ感度（InvOLS）を調整します。
      注：AFMプローブのばね定数が計算されると、それは、繰り返し使用に一定のままであるべきです。しかし、カンチレバーInvOLSは、レーザがカンチレバーに再編されるたびに再較正する必要があります。また、キャリブレーションポリスチレン等のカンチレバー、より硬めの大きさの基板いくつかの順序に対して実行する必要があります。
    3. 37°Cまでのステージに取り付けられたヒーターと温度設定をオンにします。
    4. セクション3.1で調製したP60皿に脳スライスをマウントします。
      1. ゆっくりイガイ由来の生体接着でコーティングされたP60皿に丸底フラスコから350μmの厚さの脳切片、ならびにCO 2非依存培地を注ぎます。
      2. 優しくP60皿を傾けることによって、皿の中央に脳スライスを配置します。必要であれば、ゆっくりと皿の中央に脳切片をそれ自体の上に折り畳まれたまたはより良い位置している脳スライスを展開するには、手動ピペッターから培地をピペット。
      3. 慎重に（真空を使用しない）P1000ピペッターを使用して余分なメディアを取り出します。
      4. P60皿にカバーを置き、脳切片を20分間付着させます。
    5. AFMヘッドを取り外し、P60に搭載された脳切片を配置AFMステージ上皿、およびCO 2非依存培地予め加温し〜2ミリリットルを追加します。
    6. 慎重にそれは脳切片を周囲の媒体に低下した場合に表面張力によって破壊から保護するためにAFMプローブにメディアのドロップを追加します。
    7. ステージ上にAFMヘッドの位置を変え、それがメディアに浸漬されるまで頭を下げ始めます。
    8. トップビューのCCDカメラを使用して、カンチレバーにレーザーを再配置します。
      注：カンチレバー上のレーザの位置合わせは、空気と媒質の屈折率の差に若干変更されています。
    9. カンチレバーが暖かい液体に沈めさに調整するために5分待ってから、0 Vの自由たわみにミラーの位置合わせをリセット
    10. 製造元の指示16に係るAFMプローブの熱スペクトルを実行します。メディアにAFMプローブのInvOLSを再計算する第1の熱ピークのフィットを使用してください。
    11. 光学顕微鏡を用いて、試料ステージを移動させるようにAFMプローブ下の関心の脳領域。
      注：それは周囲灰白質よりも不透明であるとして脳梁は暗く表示されます。皮質は脳梁に優れています。
    12. 0 Vの自由たわみにミラーの位置合わせをリセット
    13. AFMソフトウェアの合計とたわみメーターで、AFMヘッドに係合するように、「エンゲージ」をクリックします。
    14. カンチレバーと試料との間の接触が行われるまで、AFMヘッドに位置ダイヤルを使用して、頭を下げます。
  3. 以前4,17,18記載されているように（オプション）必要に応じて、試料の弾性率を測定します。
  4. クリープコンプライアンスの実験を行います。
    1. ソフトウェアの機能エディタで加えられた力の関数を構築します。強制機能は、5 nNのセットポイントに0.1秒ランプで構成され、0のNN加えられた力にランプダウン1秒に続いて、20秒のためにそれを保持します。
      1. インデントマスターP上anelは、インデンテーション法の下で、圧子モードの「ロード」を選択します。ユニットの「N」。圧子関数のと「関数エディタ」。
      2. 機能エディタでは、セグメントPARMSパネルに、0 nNので始まり、加えられた力の機能セグメントを作成し、0.1秒の時間で、5 nNので終了。 " - >挿入」をクリックしてください。
      3. 次のセグメントについては、20秒に5 nNの、5 NNに終わり、時間に開始設定。 " - >挿入します。」をクリックします
      4. 最後のセグメントについては、1秒に5 nNの、0 NNに終わり、時間に開始設定。 「ドロー」と機能エディタウィンドウを閉じる]をクリックします。
    2. マスターパネルのフォース]タブで、「トリガ後の圧子のランプ」をチェックし、0.1 Vのトリガーポイントに到達した後にトリガするために加えられた力の機能を設定します
    3. クリープコンプライアンスのために構築され、加えられた力の関数をトリガする、マスターパネルの力タブの下部にある「シングル・フォース」をクリックしてください。
    4. 後に単一の力インデントが終了し、ヘッドを-従事直し、再ゼロフリーのたわみを、それがサンプルと接触しないように、AFMヘッドを上げて。
    5. 関心の新たな領域を見つけ、接触を作るためにAFMヘッドを下げるために試料ステージの位置を変更します。注：試料ステージが移動したときAFMヘッドが試料表面から後退しなければなりません。これを怠ると、繊細なAFMカンチレバーに損傷を与えることができます。
    6. 反復ステップ3.4.3-3.4.5データの所望の量が収集されるまで。
  5. 力緩和実験を行います。
    1. ソフトウェアの機能エディタで適用するインデント機能を構築します。インデント機能が3μmのセットポイントに0.1秒ランプで構成され、0ミクロンの押し込み深さまで下降1秒に続いて、20秒のためにそれを保持します。
      1. インデントマスターパネルでは、インデンテーション法の下で、圧子モードの「インデント」を選択します。単位は「メートル」。そして、 ";圧子の機能の機能エディタ」。
      2. 機能エディタでは、セグメントPARMSパネルに、0.1秒の時間で、3ミクロンで終了、0ミクロンから始まり、加えられた力の機能セグメントを作成します。 " - >挿入」をクリックしてください。
      3. 次のセグメントについては、3以上3μm以下、最後に起動して設定し、20秒までの時間。 " - >挿入します。」をクリックします
      4. 最後のセグメントについては、0以上3μm以下、最後に起動して設定され、1秒までの時間。 「ドロー」と機能エディタウィンドウを閉じる]をクリックします。
    2. マスターパネルのフォース]タブで、「トリガ後の圧子のランプ」をチェックし、0.1 Vのトリガーポイントに到達した後にトリガするために加えられた力の機能を設定します
    3. 力の緩和のために構築・適用するインデント機能をトリガする、マスターパネルの力タブの下部にある「シングル・フォース」をクリックしてください。
    4. 単一の力インデントが終了された後になるように、AFMヘッドを上げますサンプルおよび再度従事ヘッドおよび再ゼロたわみとの接触のうち。
    5. 関心の新たな領域を特定するために、ステージの位置を変えて、接触を作るために頭を下げます。
    6. データの所望の量が収集されるまで繰り返して、5.3から5.5を繰り返します。
  6. 実験とクリーンアップを締結。
    1. 実験を終了した後、AFMヘッドを上げ、サンプルから削除します。
    2. 慎重にカンチレバーに触れることなく、過剰な液体を除去するために、ラボの組織を使用してください。
    3. 慎重に少量のエタノールを使用したAFMカンチレバーホルダーを清掃してください。エタノールへのカンチレバーホルダにデリケートな電子機器を置かないでください。貯蔵容器内のAFMカンチレバーと場所を削除してください。
    4. 適切なバイオセーフティプロトコルに従うことによって、脳組織試料を処分。
  7. LeeとRadok、1960によって誘導された解決策によれば、MATLABは、クリープコンプライアンスを計算し、圧子の幾何学的形状を使用して、緩和弾性率を強制的に使用して、 19。
    1. 力Fと押し込み深さを計算しますfigure-protocol-1カンチレバーの位置zのデータ、偏向D、およびバネ定数k cから

      figure-protocol-2そしてfigure-protocol-3 。
    2. Linら 20に記載されたアルゴリズムを使用して押込み曲線に沿って接触点の位置を確認します。
    3. データ分析のための目的のウィンドウを定義します。関心のウィンドウ（ 図1C、Dに示すように、すなわち 、リージョン3）（力の緩和のため）（クリープコンプライアンスのための）力あるいは押し込み深さのいずれかが設定値に維持される領域です。
    4. クリープコンプライアンス実験のために、実験的なクリープコンプライアンス係数を計算し、J cの（トン）、ステップ負荷に応じて、nは1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>：
      figure-protocol-4 、
      H（t）は Heavysideステップ関数であり、そしてRは、球形プローブの半径です。
    5. 力緩和実験のために、ステップ押込み深さに応じて、実験的な力緩和弾性率、G R（t）を計算しますfigure-protocol-5 ：
      figure-protocol-6 。

4.インパクトインデント

  1. インストルメントナノインデンターを校正し、製造元の指示に従って、水和脳組織に動的衝撃実験を可能にするために、デフォルトの設定を調整します。
    1. ピンセットを使用して、振り子の上にスライドさせて球状プローブをマウントします。
    2. 翻訳にねじ込まれているサンプルポスト、上に溶融石英サンプルを接着ステージ。
    3. キャリブレーション]メニューに移動し、選択 "液体セルを。」溶融石英サンプルと接触するためにソフトウェアの指示に従ってください。
    4. 圧子の種類は、「ノーマル」を選択し、圧子の負荷のために0.05 MNのデフォルト値を使用します。通常の圧子構成のためのキャリブレーションを実行するには、「続行」をクリックします。
    5. 少なくとも5ミリメートルバック試料ステージを移動します。プローブは、液晶セル内に下降することを可能にするレバーアームを、マウントし、圧子の種類については、「液晶セル」を選択して、新しい構成で液晶セルのキャリブレーションを繰り返します。液体セル校正係数を得るために、「続行」をクリックします。
    6. 実験メニューに移動し、選択することにより、液晶セルのソフトウェアオプションを有効にし、「特別なオプションを。 "最新の校正値を使用します。
    7. これはHIGをテストする際に必要となる大きな測定可能な最大深さ、につながるように、キャパシタプレートの間隔を増やしますHLY準拠材料。
      1. システムメニューの下で、それぞれ0.5 MN /秒、0.1 MN /秒、および3 Vにオフセット振り子テスト負荷率、ゼロ負荷率、およびスタンバイランプを変更するには「非保護の設定」および「マシンパラメータ」を選択します。
      2. レンチで、少しずつ時計回りに間隔コンデンサプレートを制御する3つのナットを回します。
      3. 各完全な時計回りのターンの後、メンテナンスメニューの「ブリッジボックスの調整」を選択し、離れて振り子からのカウンターバランスウエイトを移動する必要があります良い振り子試験を、取得します。
      4. 手順を繰り返します4.1.7.2-4.1.7.3おおよその深さ校正7万NM / V以上の値を読み込むまで。
    8. 電源を経由してオンとオフを切り替えることができます振り子の下部に新たなリミットストップを置きます。振り子運動の潜在的な障害物を除去し、高いを可能にするために、振り子の後ろに座って、元の限界停止を撤回衝突速度と同様に準拠したサンプルへの侵入深さが高いです。
    9. キャビネットが熱平衡に到達させる（約1時間かかります）。
    10. キャビネットが平衡する一方で、システムメニューに戻り、「非保護設定」を選択し、「マシンのパラメータを。」 1ミクロン/秒に深さ校正（DCAL）接触速度を設定し、3ミクロン/秒に一次インデントの接触速度、および1ミクロン/秒の超低負荷接触速度。
    11. キャリブレーションメニューでは、この新しい構成では、標準的な深さのキャリブレーションを行います。
    12. ソレノイド用の電源をオンにして、実験メニューに移動し、選択し、「インパクト」と10 Vに設定された「インパルス変位を調整します。」振り子のスイング距離を較正するためにソフトウェア命令（自動プロンプトに）従ってください。
  2. 液晶セル内のマウスの脳組織をマウントします。
    1. STEから全脳を採取した後、P 1.5は、氷の上の成体神経組織のメディアのためのCO 2非依存性栄養培地中で、すぐにそれを格納します。
    2. インパクトのインデントの設定が完全に完了したら、慎重にCO 2非依存培地と共にペトリ皿に脳を転送します。いずれかの側の平らな面を持つ6ミリメートルの厚さの切片に脳をスライス。
    3. シアノアクリレート接着剤の薄層でアルミニウム試料ポストにスライスした組織を接着します。
    4. サンプルポストに第2のOリングを介して液晶セルをスライドさせ、完全に組織を浸漬するCO 2非依存培地5mlで液体セルを埋めます。このサンプル・ポストは、その後慎重にインストルメントナノインデンター内部並進ステージ上に搭載されています。
  3. 脳組織の衝撃応答を測定します。
    1. 必要であれば、球状プローブを除去し、レバーアームを取り外すことなく、目的のプローブと交換してください。
    2. システムメニューの下で、非が保護」を選択します設定」および「マシンのパラメータ。 "/秒5μmの一次衝突接触速度を変更します。
    3. レバーアームの先端が適切にバスの上に位置されるまで遠く振り子（+ x方向）からのサンプルの低浴（-z方向）とすると、-x方向に移動します。チップが完全に浴に、試料の前に浸漬されるまで、+ z方向に移動します。
    4. サンプルステージ制御ウィンドウを使用して、慎重に接触し、その後、約30μmにより試料表面から離れてステージをバックアップ。
    5. 実験メニューで、衝撃実験を設定するには、「インパクト」をクリックします。スイング距離校正に基づいて生じた衝突速度に直接関係する特定の衝撃荷重を選択してください。スケジュールされた実験を実行します。
    6. 振り子が戻ってスイングすると、試料表面を測定面に移動し続けると、下限停止スイッチをオフにします。
    7. 振り子がFORWスイングするように観察しますサンプルに影響を与えるARD。時間の関数としてのプローブの変位は、ソフトウェアによって記録されます。
    8. XYZステージウィンドウが表示されたら、背面の限界停止スイッチをオンにします。
    9. 繰り返しますが、必要な数の異なる負荷と場所をテストするために、3.4から3.8を繰り返します。
  4. 最大侵入深さx MAX、エネルギー散逸能力K、及び散逸品質係数Qを決定するために、カスタマイズされたMATLABスクリプトを使用して、振り子の時間応答対取得した変位を分析する。11
    1. Analysisメニューに移動し、テキストフ​​ァイルにデータをエクスポートします。
    2. 時間の関数としての速度を得るために、変位プロファイルの時間微分を取ります。接触点x O1としてゼロ変位を設定します。
      注：インパクトの速度vは連絡する直前の最大速度であり、X maxはでプローブの変形に対応しています。速度が最初にゼロに減少する。X O 2、X rに相当する、次のサイクルにおける変形試料との接触を再開するために必要な位置です。反発速度V outは、変位x rにおける速度です。
    3. 最初の衝撃サイクル中に回収され、散逸サンプルエネルギーの和によって正規化サンプルによって消費されるエネルギーとしてK（無単位）を定義します。 （このような回転剛性や減衰係数など）振り子21の固有の特性に基づいて、Kを計算し 、X O1、 最大 で、x rを X、V IN、及びv アウト 。
      注：詳細については、1がKalcioglu ら、2011年の仕事を協議することができます。
    4. 変位が減衰高調波振動運動として記述することができるので、DISの最大値まで指数関数的減衰関数をフィット対時間曲線配置。
    5. Eの要因によって減少し発振振幅に必要なサイクル数を乗じたπとしてQ（単位なし）を算出します。高いQ値は、より低いエネルギー散逸率を意味します。

5.レオロジー

  1. アップを設定し、製造業者の指示に従ってレオメーターを校正。
    1. デバイス/コントロールパネルを開いて、レオメーターを初期化します。コントロールパネル]タブで、「初期化」をクリックします。
    2. 25ミリメートル径の測定プレート（PP25）と熱システムをマウントします。
    3. （オプション）、レオメータープレートと組織との間のスリップを軽減トップレオメータープレートの形状に合わせた接着剤紙やすりスライスを切り出し、上部と底板に紙やすりを接着します。
    4. コントロールパネルの「ゼロギャップを設定する」をクリックするだけで、トップと底板との間の接触を作ります。
    5. ゼロCLIによる通常の力変換器「垂直力をリセットします。 "弄ぶ天使
    6. 「測定システム」をクリックし、コントロールパネルのサービス]タブを開いて、「慣性テスト」をクリックすることで、慣性試験を行​​います。新旧の慣性を記録します。メーカーによって記載されている慣性は、プローブの許容限度内であることを確認します。
  2. レオメーターにロードしたサンプル。
    1. 組織を採取し、〜5ミリメートルの厚さに豚の脳の冠状セグメントをスライスした後、CO 2非依存培地中の氷の上に保管します。
    2. 二つのプレートの間に脳を置きます。滑りを防止するために、サンプルの上下面から大きな水滴を削除しますが、サンプルを乾燥させません。
    3. プレートは、組織の表面と完全に接触しており、測定された垂直力は5〜10分の緩和期間の後に0.01ミネソタ一貫した状態になるまでゆっくりと測定プレートを下げます。
      1. コントロールパネルで、私は順次低い高さを入力します。nは測定位置ボックスとゆっくりと測定プレートを下げるために、「測定位置」をクリックします。
      2. プレートが完全に組織の表面に接触するまで、組織との接触のミリメートル以内に0.1ミリメートル単位で測定プレートを低下します。測定-通常の力は5〜10分の緩和期間の後に0.01 mNとで一貫していることを確認してください。
      3. 初期測定された垂直力を記録します。反復測定は、同一の圧縮応力/歪みで取られるべきです。
    4. サンプルプレートの直径を超えた場合、プラスチックの刃で試料をトリミング。組織を水和するために、試料のエッジ上のメディアの少量（〜1〜2ミリリットル）をピペット。
    5. （オプション）サーマルフードを下げます。コントロールパネルで、37℃に温度を設定し、「設定」をクリックします。
  3. 材料の線形粘弾性範囲（ すなわち、せん断を確立するために、振幅スイープを実行します関心（ 例えば、1ラジアン/秒）の周波数でのG 'およびG' 'が一定であるで株）。
    1. 「ファイル/新しい」を選択します。ゲルタブで「振幅スイープ：LVE-範囲」を選択してください。ウィンドウを選択し、クリックして「測定1：振幅スイープ "発振ボックスをダブルクリックします。最初と最後の歪みを入力します（ 例えば、105から0.01）、周波数（ 例えば、1ラジアン/秒）とディケードあたりのポイント数（ 例えば、6点/ 12月）。 「OK」を選択し、スタートをクリックします。」
    2. 線形弾性範囲の一貫性を確保するために、繰り返し試験で数のスライスについて、この手順を繰り返します。サンプルの軸方向の圧縮は、サンプル間で一定のままであるべきです。
  4. 組織の線形粘弾性範囲（ 例えば、1％の歪み）22であり、関心の周波数範囲（ 例えば 、0.1から100ラジアン/秒）で歪みで組織の周波数掃引を行っています。
    1. クリック 「ファイル/新しい」とゲルタブの下には、「周波数掃引」を選択します。周波数スイープ：ウィンドウ/計測1]をクリックします。発振ボックスをダブルクリックします。周波数範囲（ 例えば 、0.1から100ラジアン/秒）、歪み（ 例えば 、1％の歪み）とディケードあたりのポイント数を入力します（ 例えば 、6点/ 12月）。 「OK」を選択し、周波数掃引を開始するために、「開始」をクリックします。
  5. 重複または三連で繰り返し周波数スイープ（ステップ5.4）。
  6. G 'およびG "周波数の関数（周波数掃引）やせん断ひずみ（振幅スイープ）注：。G'およびG ''は 、サンプルの（最大値から計算され、自動的にレオメーターによって計算され、エクスポートされたデータを確認します）reactionalトルク振幅T '0、回転変位角（または偏向角） figure-protocol-7 、及び位相遅れ印加された振動ひずみに対するサンプルの応答（ 図 3）の式1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>、：
    figure-protocol-8
    figure-protocol-9
    R hは 、試料の半径と高さです。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図4は 、それぞれ適用された力あるいは押し込み深さ（ 図4A、D）、与えられた、クリープコンプライアンスのための時間応答（ 図4B、E）対代表インデントと力を示し、リラクゼーション実験を強制します。これらのデータおよびシステムの幾何学的形状を使用して、クリープコンプライアンスJの C（t）と緩和弾性率G R（t）を強制することは、脳の異なる領域（ 図4C、F）について計算することができます。以前の研究は、脳23の異なる領域の弾性率の差を示しているが、粘弾性特性は、所与の組織切片内の地域間変動を示していないマウスの脳組織切片のためにこのようにして測定しました。

インパクトのインデントは、空間的および時間的にconcen...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本論文で各技術は、脳組織の機械的性質の異なる側面を測定します。クリープコンプライアンスと応力緩和弾性率は時間に依存する機械的特性の尺度です。貯蔵弾性率および損失弾性率は、速度に依存する機械的特性を表します。インパクトインデントも速度に依存する機械的特性を測定したが、エネルギー散逸のコンテキストインチ組織の機械的特性を特徴づけるとき、両方のAFM対応インデントおよびレオロジーは、通常の方法を使用しています。前述のように時間に依存する材料特性を提供することに加えて、種々の実験パラメータは、細胞および組織の弾性率4、さらに周波数依存特性24を測定するために使用することができるので、AFM対応インデントは特に有用です。しかし、実験のデータと設計の正確な解釈は準拠して、水和した組織のために挑戦することができます。レオメトリー対策が適切一括ながら組織、AFM-有効インデントの絆は、細胞の微小環境に関連するマイクロスケールのボリュームを検査します。インパクトのインデントは、材料が焦点衝撃による外傷性脳損傷を研究するような用途において有用である濃厚、動的衝撃荷重の文脈に変形する方法を具体的に定量化する手段を提...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、全米多発性硬化症協会とサイモンズ社会脳センターによるこの仕事の支援に感謝します。BQは、米国国防科学工学大学院フェローシッププログラムからの支援を認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
キシラジンロイド ラボラトリー処方薬
ケタミンAnaSed 注射剤
ビブラトーム(振動刃ミクロトーム)ライカVT1200
Hibernate-A MediumGibcoA1247501成人組織用 CO2非依存神経培地
原子間力顕微鏡、MFP-3D-BIOアサイラム・リサーチ-
シャーレ・ヒーターアサイラム・リサーチ
- AFM プローブ、0.03 N/m、10 &マイクロ;m半径ホウケイ酸球NovascanPT.
Cell-TakCorning354240ムール貝由来の生体接着
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS5761代替サプライヤーは、
水酸化ナトリウム、1 NSigma-Aldrich59223C代替サプライヤーを使用できます
計装インデンター、NanoTest VantageMicro Materials Ltd.-プローブ先端を機械加工する必要があります(スチールフラットパンチ、1 mm径、4-5 mmの長さ)
NanoTest Liquid CellMicro Materials Ltd.-
平行平板レオメーター MCR501Anton-Parr-PP25
 Anton-Parr-25mm直径フラット測定プレート
接着剤サンドペーパーMcMaster-Carr4184A48サプライヤーを使用可能
Loctite4013インスタント接着剤ヘンケル20268代替サプライヤーを使用可能
GS剤 代替

参考文献

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