方法論記事

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

DOI：

10.3791/54202

⸱

2016年8月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

この記事について

サマリー

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ヘパリンとプロタミンから製造された自己組織化高分子電解質複合体(PEC)をアルギン酸ビーズ上に堆積させ、骨形成成長因子の放出を閉じ込めて調節しました。この送達戦略により、脊椎固定術の用途でBMP-2の投与量を20倍に減らすことができます。この記事では、PECの利点と製造について説明します。

要約

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再建骨手術中に、成長因子の超生理学的な量は、経験的に成功した骨の融合を促進するために足場上に装填されています。非常に強力な生物剤の大量投与は、急速な酵素分解の結果としての成長因子の不安定性だけでなく、移植部位で成長因子の十分な量をローカライズにおけるキャリアの非効率性に必要とされます。したがって、例えばBMP-2 / NELL-1のような成長因子の安定性を延長戦略、及びそれらの放出を制御するには、実際に有効な投与量を低下させ、従って、将来の骨再生手術の間に、より大きな用量の必要性を減らすことができます。これにより、副作用および成長因子コストを削減します。自己集合のPECは、 インビボでの安定性を高めることにより、ヘパリン結合、さらに増強成長因子の生物活性を介して、BMP-2 / NELL-1送達の良好な制御を提供するために製造されています。ここでは、deliveに役立つPEC製造の単純さを示しています再建骨の手術中に種々の成長因子のRY。

概要

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偽の発生率は、変性脊椎固定術およびリビジョン脊椎手術1の10〜45％と高いことが報告されています。脊椎融合および他の再建骨手術中に偽関節の速度を減少させるために、例えば、BMP-2、NELL-1および血小板由来増殖因子（PDGF）などの骨形成増殖因子はデノボ骨形成を促進するために導入されています。これらのうち、BMP-2は、脊椎固定術2のための一般的な選択です。新骨形成を誘導および促進におけるBMP-2の効力は十分に3を確立してきたが。このような異骨形成、血清腫および血腫形成、炎症反応、神経根炎、椎体の骨溶解、および逆行性射精などの臨床的に有意な合併症が原因で4,5使用超生理学的量に関心事項であり続けます。

したがって、BMP-2の用量を低下させることがでに関連する戦略まま副作用を最小にするために誘惑。また、効率的なキャリアシステムは、現代のコラーゲンスポンジ担体系で観察されたBMP-2の初期バースト放出を抑制し、さらに、この強力なサイトカインの長期化と局所的な送達を促進するために必要とされます。陽イオンおよび陰イオン高分子電解質の交互の層毎の自己集合足場マトリックスまたは移植可能な材料6の表面に高分子電解質複合体を構築するための調整可能な方法として使用することができます。この点では、（すべての生物学的因子の最も負の電荷密度を有するために知られている）、ヘパリンが強く静電及びヘパリン結合ドメインを介して、種々の増殖因子と結合することが認識されています。実際、ヘパリンは半減期を延長し、従って、いくつかの成長因子の生物活性を増強することが示されています。

これに基づいて、私たちのグループは、ヘパリン系高分子電解質複合体（PEC）を製造するために層ごとの自己集合のプロトコルを適合その負荷および固定化7,8の間に骨形成成長因子の生物活性を保持します。アルギン酸マイクロビーズのコアは、二価カチオン、カルシウムまたはストロンチウムイオンと、アルギン酸塩のα-L-グルロン酸（G）残基を架橋することによって作製しました。アルギン酸コアは、生分解性足場の行列です。これは移植後、それは骨の内部成長のための部屋を提供する融合ベッドに再吸収されます。ポリ-L-リジン（PLL）またはプロタミン（この場合は、アルギン酸マイクロビーズキャリアコア）足場マトリックスと負に帯電したヘパリンの両方とインタレースするカチオン性層として使用されます。アニオン性ヘパリン層の機能は、ロードされた成長因子を安定化し、局在化しています。三層PECは、ブタモデル9における成長因子負荷容量を増加させることが示されています。近年、PECキャリアは正常ラット10と脊椎8のブタモデルにおいて少なくとも20倍のBMP-2の有効量を減少させることが示されています。

ntent ">ここでは、我々はモデル骨形成増殖因子としてBMP-2を使用して、脊椎固定術で強化された成長因子の配信および他の再建骨手術のためのPECを製造する方法を報告しています。

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プロトコル

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1.アルギン酸塩溶液の調製

  1. アルギン酸ナトリウム（非照射）または8ミリラジアンの400mgの200 mgの溶解10mlの蒸留水にアルギン酸ナトリウムを照射および非照射アルギン酸照射アルギン酸15分間、1時間振とうします。 4℃で一晩アルギン酸塩溶液を保管してください。アルギン酸マイクロビーズの製造の前に滅菌0.2μmのシリンジフィルターでアルギン酸塩溶液をフィルタリングします。

2.アルギン酸マイクロビーズの作製

  1. 70％エタノールで静電ビーズ発生器とシリンジポンプを消毒し、クラスII生物学的安全キャビネット（ 図1）に配置します。
  2. ビーズ発電機内部の磁気攪拌棒をガラス洗面器を置きます。
  3. 9センチメートル流域上記のビーズ発電機のアーム電極を設定します。
  4. アーム電極のローレットネジ2にビーズ発生器の電極ケーブルを接続し、へのSrCl 2溶液の80ミリリットルを注ぎます流域。
  5. シリンジ及びゴムチューブにロード0.2μmのろ過アルギン酸塩溶液の5ミリリットルを。アーム電極にゴムチューブを接続した後、チューブ内の空気を排出し、ノズルの先端にアルギン酸塩溶液を提供するために2分間5ミリリットル/時でシリンジポンプのスイッチを入れます。シリンジポンプの電源を切ります。
  6. 次に、カプセル化装置のスイッチをオンにした後、シリンジポンプは、マイクロビーズの生成を開始します。 5ミリリットル/時アルギン酸流量とキャプに5.8 kVの電圧を設定します。これらのマイクロビーズは不規則な大きさと形状になる傾向があるように、最初の2分（またはシリンジから送り出さ初期0.5ミリリットルアルギン酸塩溶液）中に生成されたマイクロビーズを捨てます。
  7. 0.2 M塩化ストロンチウム溶液中でその後のマイクロビーズを収集します。アルギン酸塩溶液の事前計画されたボリュームをポンピングした後、シリンジポンプと（その順序で）カプセル化装置の両方の電源をオフにします。マイクロビーズ製造のその後のバッチのためにこれを繰り返します。完了すると、のターンキャプ続いて第1のシリンジポンプ、F。
  8. 架橋を完了し、ゲルを安定化するために4℃で一晩、0.2M塩化ストロンチウム溶液20mlにマイクロビーズを格納します。

アルギン酸マイクロビーズの3サイズの測定

  1. プラスチックピペットを用いてアルギン酸マイクロビーズの0.5ミリリットルを採取し、スライドガラス上に置きます。 10倍の倍率で光学顕微鏡下でのマイクロビーズを表示します。顕微鏡用CCDカメラとマイクロビーズの10画像を撮ります。解像度2048 X 1536でTIFF形式のスケールバー（500ミクロン）の画像を保存します。
  2. ImageJの長さツールを使用して、マイクロビーズのサイズ及びスケールバー（ 図2）を測定します 。画素からのマイクロビーズの長さは、マイクロメートルに変換します。
    1. ラインツールをクリックするとアルギン酸ビーズの真ん中を横切る線を引きます。
    2. メニューバーの「分析」と「測定」を選択しクリックしてください。ポップアップウィンドウが表示されます。
    4. ×500μmのスケールバーのアルギン酸ビーズ/長さの長さを：式を用いて実際の長さにアルギン酸ビーズの直径を変換します。例えば、1.420（ImageJをすることによって測定された直径）/ 2.657（ImageJをすることによって測定スケールバーの長さ）* 500ミクロン= 267ミクロン。
  3. マイクロビーズの各バッチの代表サイズとして（平均±標準偏差）100マイクロビーズの平均サイズを考慮してください。

4.滅菌

  1. 100μmのナイロンストレーナーを使用してマイクロビーズを収集し、蒸留水でビーズを洗浄します。
  2. スパチュラを使用して、2mLのマイクロ遠心チューブに0.1 mlのアルギネート溶液から作られたすべてのマイクロビーズを転送し、乾燥を防ぐために、ガーゼで覆います。
  3. 最後に、液体モードを使用して、オートクレーブによりマイクロビーズを滅菌（115℃、15分）またはmに応じてanufacturerの仕様。乾燥からビーズを防ぐために、チャンバに蒸留水1.5リットルを加えます。

5.プロタミンとヘパリンコーティング

  1. BSL-2フードの内側には、室温で1時間（0.2μmのシリンジフィルターを用いて滅菌）を2mg / mlのプロタミン溶液1ml滅菌マイクロビーズをインキュベートします。
  2. 1時間（ステップ5.1）のためのマイクロビーズをインキュベートした後、マイクロビシンコニン酸（マイクロBCA）テスト（セクション6）のためのプロタミン溶液150μLを集めます。
  3. 蒸留水で2回プロタミン被覆したマイクロビーズを洗ってください。室温で3分間、200×gでベンチトップ遠心機を用いてスピンダウン。遠心分離後、シリンジを用いて水を吸引します。
  4. 高分子電解質複合体（PEC）を作成するために30分間（0.2μmのシリンジフィルターを用いて滅菌）を0.5mg / mlのヘパリン溶液1mlとプロタミンコーティングされたマイクロビーズをインキュベートします。
  5. プロタミンコーティングされたマイクロビーズFをインキュベートした後、または30分（ステップ5.4）、ヘパリンコンテンツ（セクション7）を決定するためにヘパリン溶液の400μLを集めます。
  6. インキュベーション後、蒸留水で2回洗浄してたPECから未結合ヘパリンを洗い流してください。

6.プロタミンコンテンツ

  1. 製造業者の指示に従ってマイクロBCAテストを実行します。簡単に言えば、96ウェルプレートに150μlのプロタミン溶液（前およびマイクロビーズとのインキュベーション後に回収）を追加します。 150μlのマイクロBCAワーキング溶液を追加します。
  2. 較正標準としてアルブミン溶液（0、0.5、1、2、5、10、20、40及び200μgの/ ml）を使用します。
  3. 60℃で60分間混合物をインキュベートします。 562 nmで分光光度計で吸光度を測定します。
  4. 製造者の指示に従って、各未知試料のプロタミン濃度を決定するための標準曲線を使用します。
  5. プロタミンの合計量を差し引くことにより、マイクロビーズのプロタミン含有量を決定（マイクロビーズとのインキュベーション後に）塗布液中に残存するプロタミンの量から（マイクロビーズとのインキュベーション前に）コーティング液。

7.ヘパリンコンテンツ

  1. ブルー4mgのトルイジンと0.01 N塩酸中20mgの塩化ナトリウムを溶解させて使用液の10ミリリットルを準備します。
  2. 30秒3、ボルテックス：2の比率で作業溶液に（ステップ5.5から）のサンプル400μlを添加します。
  3. n-ヘキサン（ワーキング試薬溶液に相当するボリューム）の600μl加え、トルイジンブルーヘパリン複合体を抽出するために、混合物をボルテックス。
  4. 吸引し、相分離後のシリンジで水相200μlの。
  5. 631 nmで分光光度計を使用して水相中に含まれる未抽出トルイジンブルーの量を測定します。
  6. 0-20 / mlのヘパリン標準溶液を準備します。
  7. μgの/メートルでヘパリン濃度対各ヘパリン標準の631 nmの読み取りをプロットリットル。各サンプルのヘパリン濃度を決定するために、標準曲線を使用してください。

レイヤー・バイ・レイヤー構造の8共焦点イメージ

  1. プロタミン、ヘパリンとNELL-1 / BMP-2蛍光アナログCF-405プロタミン（青）、CF 594ヘパリン（赤）を作製し、FITCは、NELL-1 / FITC標識に従って（緑）、BMP-2 +ヘパリン+プロタミンメーカーのラベル付けテクニカルデータシート。
  2. コー​​ト100μgの蛍光アナログ300μlのマイクロビーズ（5.3から5.6で説明したように塗布法）CF-405プロタミン（青）（2 mg / mlで、1時間のインキュベーション）、CF 594ヘパリン（赤）（0.5 mg / mlで、 30分）し、FITCは、標識されたNELL-1 / FITC標識した（緑）、BMP-2（1.5 mg / mlで、一晩）。未結合の蛍光プロタミン、ヘパリンとNELL-1 / BMP-2を除去するために蒸留水で2回マイクロビーズを洗ってください。
  3. 10X倍率で共焦点顕微鏡を使用してレイヤーバイレイヤー構造（ 図3）を確認します。7

前記BMP-2そして、NELL-1取り込みおよびリリース

  1. 負荷PEC100μgの上のBMP-2またはNELL-1溶液の1.5 mg / mlでの13.3μlの。 10時間振盪30 rpmの下に4℃でPECをインキュベートします。
  2. 一定の振とう（30 rpm）しながら37℃でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1ミリリットル中にマイクロビーズを浸し。
  3. 1mlの上清を収集し、1、3、6、10および14日後に1 mlのPBSと交換してください。
  4. 取り込みを評価し、製造業者のプロトコルに従ってELISA法を用いてBMP-2の効率を放出します。取り込みを評価し、製造業者のプロトコルに従ってカルボキノリン-2-カルボキシアルデヒド（CBQCA）タンパク質アッセイ法を用いて、NELL-1の効率をリリース。
  5. 時間（t）での累積放出を決定します。
    当時の時間（t）+前のリリースでの時間（t）=リリースでの累積放出（tは-1）。
  6. 時間に対するBMP-2およびNELL-1の累積放出をプロットします。

10. インビトロ生物活性NELL-1の

注：PECから放出されたNELL-1の生物活性は、ウサギ骨髄幹細胞におけるアルカリホスファターゼ（ALP）の発現を増加させる能力（rBMSC）を測定することによって評価しました。

  1. シード2万24ウェルプレート中のウェルあたりrBMSCsし、それらをウシ胎児血清（FBS）CO 2、37℃で、5％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％の1ミリリットルで一日のために成長することができます。
  2. 24時間後、10 -8モル/ Lのデキサメタゾン、10％FBS、2％ペニシリンストレプトマイシン、50μg/ mlのアスコルビン酸、10ミリモル/ Lのβグリセロリン酸を補充した骨形成培地（DMEM 1mlの培地を交換し、そして）37℃で7日間、5％CO 2のため。
  3. 細胞（これは骨形成培地交換時のPECマイクロビーズの洗い出しを回避）とは別のPECを維持するために300μgのPEC-NELL-1細胞培養インサートの内側とPEC（ステップ8.2から）（TCインサート）を配置します。場所TCはPLも24に挿入します14日間食べました。
  4. 3日に1回、TCインサート外に針を配置することによって吸引骨形成培地の1ミリリットルを、新鮮な骨形成培地1mlと交換してください。
  5. インキュベーションの7および14日後に、キットの製造業者のプロトコルに従って、ALPアッセイキットを用いてALP活性を決定します。
    1. 10分間4℃で0.1％トリトンX-100を含むアッセイ緩​​衝液で溶解細胞。セルスクレーパーを使用して付着した細胞を削り取ります。少なくとも60分間攪拌しながら4℃で細胞懸濁液をインキュベートします。
    2. 10分間4℃で2,500×gで細胞懸濁液を遠心。 ALPアッセイのために上清を収集します。
    3. 96ウェルプレートのウェルにミリリットル200 0 ngの/から連続的に希釈したアルカリホスファターゼ標準溶液50μlを追加します。アルカリホスファターゼ標準の最終的な量は、よく/ 10、5、2.5、1.2、0.6、0.3、0.15、および0 ngのです。
    4. ステップ10.5.2からの上清を追加します（50μL/ウェル）、希釈Bで希釈uffer。
    5. 各ウェルにp個の -nitrophenylリン酸（のpNPP）基質溶液50μlを追加します。穏やかに30秒間プレートを振盪することにより、試薬を混ぜます。暗所で30分間混合物をインキュベートします。プレートリーダーにより405nmの吸光度を測定します。
    6. 検量線を用いてALP活性を計算します。
  6. 製造業者の指示に従ってマイクロBCAタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質含量を決定します。タンパク質含量によりALP活性を割ることによりALP活性を正常化します。

11.細胞生存率

  1. 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）のために24時間37℃でDMEM + 10％FBSを1 mlのPEC-NELL-1 200mgのインキュベートアッセイ。
  2. 96ウェルプレート中の種子（10％FBSを含むDMEM100μl中）ウェルあたり2,000 rBMSCsし、37℃、5％CO 2で1日間インキュベートします。
  3. PEC-NELL-1 / PECエキス100μlのDMEM + 10％FBSを交換し、インキュベート37℃、5％CO 2。
  4. インキュベーションの1日または3日後、5 mg / mlでのMTT溶液10μlを追加し、さらに暗闇の中で4時間、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
  5. ホルマザン結晶を溶解し、各ウエルに100μlのDMSO溶液を加えます。
  6. マイクロプレートリーダーを用いて570 nmの吸光度を決定します。
  7. 相対成長率を計算します。
    figure-protocol-1

12.足場へのパッケージ化とBMP-2＆NELL-1のロード

  1. BSL-2チャンバー内の滅菌スパチュラを用いてリン酸三カルシウム（mPCL-TCP）足場 - 生体吸収性医療グレードのポリカプロラクトンの孔にPECを梱包してください。
  2. PECを詰めmPCL-TCP足場の上に1.5mg / BMP-2またはNELL-1 mlの溶液を加え、4℃で一晩インキュベートします。

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結果

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それは、類似の化学的特性を有し、それは、FDAは、ヘパリンの解毒剤として承認されているとしてのキャリアでは、プロタミン、ポリ-L-リジンの代わりに選択しました。光学顕微鏡の結果は、非照射マイクロビーズが267±14ミクロンの直径を有する球形であることを示しました。 （0.35ミリメートルノズルを5ミリリットル/時間及び5.8 kVでの流量）。照射されたマイクロビーズの大部分は、涙滴形状です。照射されたマイクロビーズのラウンド部分で測定した直径が212±30ミクロン（0.35ミリメートルノズル、4ミリリットル/時＆6 kVでの流量）でした。 （ 図4）。

PECマイクロビーズの共焦点画像は、CF-405ラベルされたプロタミン（青）、CF594標識ヘパリン（赤）とFITC-BMP-2 / FITC-NELL-1（緑）のレイヤーバイレイヤーコーティングを明らかにする。結果は、PECのは、正に帯電したBMP-2と結合し、負ヘ...

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ディスカッション

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このプロトコルは、レイヤーバイレイヤー自己組織化を通じたPECの調製のための方法を提示しています。層ごとの構造は、プロタミン、ヘパリン、BMP-2およびNELL-1および共焦点顕微鏡の蛍光類似体を用いて可視化されます。取り込みおよび放出試験は、PECのヘパリンは骨形成成長因子の取り込み及び放出を媒介することを示します。 PEC法の取り込み効率は次のとおりです。NELL-1：86.7±2.7％、BMP-2：70.5±3.1％。 PECの担体は、カルシウムアパタイト粒子として純粋表面吸着担体（40-80％）11と比較して、NELL-1（20％）の放出のより良好な調節を有します。

リリースを調節することに加えて、ヘパリンは、このような不要な細胞毒性関連の問題12を回避するためにプロタミンなどのポリカチオンの過度の正電荷を中和します。 MTTアッセイおよびアラマーブルーアッセイ7によって決定されるのPECは、細胞毒性の兆候を示しません。 ALPアッセイは、PECキャリアがbioactを維持することができます示していNELL-...

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開示事項

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私たちは、利害関係のありません。

謝辞

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これらの研究は、National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 および NMRC EDG/0022/2008 によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ライフサイエンス アクロディスク 25 mmシリングフィルター(0.2 &マイクロ;m スープルメンブレンPALL PN4612プロタミン、限外ろ過によるヘパリン溶液
24ウェルプレートセルスター 662160
96ウェルプレート ヌクロンデルタ表面サーモフィッシャーサイエンティフィック167008
(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)、MTTシグマ アルドリッチM5655PEC-NELL-1 アセトンの細胞毒性を測定
フィッシャーサイエンティフィックA/0600/17沈殿物 CF-405
標識プロタミン
アラマーブルー Invitrogen,Life TechnologiesDAL 1025PEC-BMP-2
アルカリホスファターゼアッセイ(ALP)アッセイキットAnaspecAS-72146
塩化アンモニウムMerckArt 1145FITC標識の試薬を停止
無水ジメチルスルホキシド(DMSO)Invitrogen, Life TechnologiesD12345蛍光イソチオシアネートI
ジメチルスルホキシド(DMSO)シグマ・アルドリッチディゾルブ  フォルマザン 
オートクレーブヒラヤマHU-110アルギン酸ビーズを蒸気滅菌
β-グリセロリン酸Sigma AldrichG9422
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA7510800骨形成成長因子、透析は、FITCカップリング
カルボキシベンゾイルキノリン-2-カルボキシアルデヒド(CBQCA)サーモフィッシャーサイエンティフィックA-6222NELL-1タンパク質
細胞ストレーナーの定量化 (100 &マイクロ;m)BD Science352360ALPアッセイ用PECを保持
セルスクレーパー 290 mm ブレード幅 20 mmSPL Life Science9003024ウェルプレートから細胞を取り外す
CF 405S, Succinimidyl EsterSigma AldrichSCJ4600013プロタミン標識用青色蛍光色素
CF 594, HydrazideSigma AldrichSCJ4600031ヘパリン標識用深赤色蛍光色素
遠心分離ベックマン・コールターマイクロフュージ 22R
共焦点顕微鏡オリンパス FV1000
デキサメタゾンSigma AldrichD4902骨形成培地
キストラン脱塩カラムPierce (Thermo Scientific)の成分 43230
DMEMギブコ 12320
BMP-2 Quantikine ELISAキットR&DシステムDBP200BMP-2放出を決定する
ウシ胎児血清 FBSHycloneSV30160.03
フルオセインイソチオシアナン酸、異性体 ISigma AldrichF7250NELL-1およびBMP-2標識用緑色蛍光色素
ThinCert細胞培養インサート、
24ウェルプレート用、滅菌		Greiner 662630骨形成媒体を交換するときにPECの洗い流しを防ぎます
Havard Appartus シリンジ ポンプ (11 plus)Havard 装置70-2208
n-ヘキサン (>99%)シグマ アルドリッチ139386
ヘパリンシグマ アルドリッチH3149ヘパリン結合ドメインを持つ骨形成性
成長因子と結合
塩酸 (37%)メルク100317高腐食性
インキュベーターバインダーC8150
MicroBCAタンパク質アッセイキットThermoscientific23235
マイクロプレートリーダーTecanInfinite M200ALPおよびmicroBCAアッセイ用
Nisco細胞カプセル化器Nisco Engineering Incカプセル化ユニット VAR V1
蛍光顕微鏡オリンパスIX71
mPCL-TCPスキャフォールド(細孔径は1.3 mm)OsteoporePCL-TCP 0/90PECをin vivo研究用PECを保持
ニシリン-ストレプトマイシン 10,000 unit/ml, 100 mlHyclone Cell CultureSV30010Antibiotic
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)VivantisPB0344-1L10x Solution, Ultra Pure Grade
Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000Sigma AldrichP2568Polycation
Protamine Sulfate salt, from SalmonSigma AldrichP4020Polycation
ShakerLabnetS2025
スネークスキン透析チューブ 3,500 MWCO 22 mm x 35サーモフィッシャーサイエンティフィック68035透析による未反応のFITCの除去
塩化ナトリウムメルク1.06404.1000
水酸化ナトリウムQrecS5158
重炭酸ナトリウムUS バイオロジカルS4000バッファー
ナトリウムシグマ アルドリッチS7795-500Gバッファー
塩化ストロンチウムヘキサハイドレートシグマ アルドリッチ255521アルギン酸用架橋剤
スパチュラ3dia
5 ml シリンジテルモ140425Rシリンジの直径は流量に影響します
75 cm2 細胞培養フラスコ カンテッドネックコーニング730720
トルイジンブルーシグマ アルドリッチ52040ヘパリンアッセイ
トリプシン 1xHyclone 細胞培養SH30042.01
アルギン酸ナトリウムNovamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)Pronova UPMVGマイクロビーズのコア材料
滅菌の細胞毒性の測定 ・のを妨害する安定剤成分を除去するために必要です 機 デします ペフィート 炭酸

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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