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Summary

この流接着アッセイは、T細胞、上皮細胞間相互作用の単純な、耐衝撃性モデルを提供します。シリンジポンプは、剪断応力を生成するために使用し、共焦点顕微鏡は、定量化のための画像を捕捉します。これらの研究の目的は、効果的に流れ条件を使用して、T細胞接着を定量化することです。

Abstract

全体的に、T細胞の接着は、免疫学的シナプスの形成における抗原提示細胞（APC）と炎症との相互作用の部位への細胞漸増の明確なプロセスに貢献し、機能の重要なコンポーネントです。 T細胞の接着のこれら二つのコンテキストは、T細胞 – 血管相互作用が循環自体によって生じるせん断応力によりチャレンジされている間の相互作用は、静的と考えることができるT細胞APCが異なります。 2つの細胞パートナーが互いに静的な相対的であるという点で、T細胞APCの相互作用は、静的に分類されます。通常、この相互作用は、リンパ節内で発生します。 T細胞は、血管壁と相互作用するように、細胞が停止し、生成された剪断応力に耐えなければならない^。1,2-これらの違いは、より優れた二つの別個の調節プロセスとして流動条件下での静的接着性及び密着性を理解する必要性を強調しています。 T細胞の接着の調節は、最も簡潔に詐欺のように記述することができます細胞表面上に発現される分子をインテグリン、それによって相互作用する細胞の表面に発現接着分子リガンドとインテグリンとの相互作用を調節する親和性状態をトローリング。インテグリン親和性状態の規制の我々の現在の理解は、in vitroモデル系において 、多くの場合、単純化から来ています。ここで説明したフロー条件を使用して接着のアッセイは、刺激に続くリアルタイムでT細胞、上皮細胞間相互作用の可視化と正確な定量を可能にします。フローアッセイの下の密着性が阻害または刺激性物質で処理した後のT細胞内のシグナル伝達接着の研究にも適用することができます。さらに、このアッセイは、任意の接着白血球集団および任意のインテグリン接着分子対にT細胞シグナル伝達を超えて拡張することができます。

Introduction

Tリンパ球の接着は、T細胞輸送および抗原提示において重要な役割を果たし^3、健康な免疫系に異なるプロセスの数を媒介します。免疫監視またはアクティブな免疫応答の間の接着のために、これらの二つの大きな役割が重要であるかどうか^。4 T細胞-内皮細胞相互作用の生理学的なシグナル伝達イベントは、T細胞抗原提示細胞（APC）の相互作用とは区別されるため、別個の方法を必要と最高の関与するシグナル伝達カスケードを理解するための研究。リンパ球の血管外遊出中の血管壁へのT細胞の強固な接着を迅速かつ動的なインテグリン活性化を必要とします。内皮に沿って、アクティブ状態のインテグリンおよび接着分子間の緊密な相互作用は、T細胞は、細胞の通過に許容エリアの探索に表面に沿ってクロールすることができ、血液の流れに耐性の密着性につながる^。5 T細胞の双方向のクロール-directionally ALONGA血管壁は、T細胞の異なる接着フロントエンドと、偏接着に頼るである。 ^図6は、最も重要なことは、強固な接着および遊出は、血流を循環させることにより生成される剪断力に対する抵抗を必要とします。

リンパ球の接着を研究するための実験を​​設計する場合、注意が興味のある特定の刺激に支払われるべきです。インテグリン活性化は、T細胞の接着のすべての形態の共通の重要な要素であるが、活性化のカスケードは、個々の受容体および共受容体の下流で一意である可能性があります。同様に、インテグリンおよび接着分子のペアは、特殊な微小環境で、特定の部分集団に機能します。このようにして、これらのペアは非常に異なって調節され得ます。ここで紹介するモデルは、せん断応力条件下で行わインテグリン活性化をもたらすシグナル伝達カスケードの研究のための理想的です^。7これらの相互作用が十分に静的adhesiで理解することはできませんシステム上の衝撃によるこれらの力は、T細胞の挙動に直接有することが示されている^。8のシステムは、T細胞およびヒトICAM-1（CHO-ICAM細胞）を発現するように操作されたCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞をここにすることができる提示けれども簡単に異なる白血球集団または接着分子を研究するために改変することができます。

このアッセイは、白血球の血管外遊出の強固な接着段階のためのモデルを提供し、剪断応力を用いて、T細胞の接着およびインテグリンの活性化を定量化する方法を提供します。 CHO-ICAM細胞の使用を介して、生細胞中のそのリガンドに対するLFA-1の親和性は、目的の種々の刺激に応答してリアルタイムで調べることができます。この手法は、簡単に大きく、他のモデルと比較して、血流および剪断応力をモデル化するために必要な設備を簡素化、シリンジポンプと組み合わせた市販のマイクロ流チャンバを得る必要があります^。9このアッセイの別の主要な利点は、特定のシグナリングでありますカスケードおよび個々のインテグリンの結果として生じる活性化状態は、きれいに、目的のヒトの接着分子を発現する操作されたCHO細胞を使用することによって研究することができます。さらに、生細胞イメージングで定量的データの組み合わせは、この方法の重要な利点です。静的なT細胞の接着のアッセイ数がうまくT細胞APCの相互作用をモデル化することが記載されているが全体として、これらのモデルは、T細胞、上皮細胞接着の動的なプロセスを取り込むには不十分です。接着アッセイを選択する際にこのような理由から、問題の刺激を考慮しなければなりません。

Protocol

1.めっきCHO-ICAM細胞注：このステップの目標は、コンフルエントな単層を生成することを目標に一晩成長のためのフローチャンバーにCHO-ICAMの細胞をプレーすることです。 37℃で10mlの％ウシ胎児血清（FBS）を補充したRPMI培地および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（CHO-ICAM完全培地）中で10cmの組織培養処理された培養皿にCHO-ICAM細胞を維持する5％ CO 2。 細胞を収集するには、1ミリリットルの0.5％トリプシン-EDTAを追加し、穏やかに振盪しながら1分間室温でインキュベートします。メディアの4mlでトリプシンを中和します。 血球計を用いてCHO-ICAM細胞をカウントし、室あたり0.75×10 5個の細胞を計算します。注：この実験では：2.25×10 5個の細胞が3室をシードするために必要とされます。 遠心分離機0.75×10 500×gで5分間室あたり5 CHO-ICAM細胞、室温およびCHOの室あたり30μlの細胞ペレットを再懸濁-ICAM完全培養培地。 注：この実験では90μlを3室をシードするために必要とされます。 ゆっくりとフローチャンバーの1リザーバ内にセルを追加。細胞は、5％CO 2で37℃インキュベーターで5分間沈降することを可能にします。 各チャンバの2つのリザーバを横切って完全培養培地200μlのを追加します。システムが平衡するように、細胞の移動を避けるためには、2つの間の代替の追加。 5％CO 2で一晩37℃のインキュベーター内部の細胞をインキュベートします。 T細胞の調製注：このアッセイは、初代ヒトT細胞またはT細胞株を用いて行うことができます。血液からのT細胞の単離のプロトコールは、以前に記載されている。10、一次ヒトT細胞を使用する場合、最良の結果のために新鮮に単離された細胞を使用します。 T細胞株を使用する場合、セルのソースによって指定された培養プロトコルに従います。蛍光microscoの細胞を検出するためにT細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識されているPE。 血球計を使用したT細胞をカウントし、室あたり2×10 6個の細胞を計算します。注記：この実験では、6×10 6細胞を、3室のために必要とされるであろう。 遠心分離機2×10 500×gで5分間の室あたり6 T細胞を、室温で、1％グルコースまたは2％FBSを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中の細胞を再懸濁します。 1でCFSEを追加：1,000希釈（5 mMのに行われた株式）。光から覆い、室温で8分間インキュベート 5分、RTのために500×gでスピン。 RPMI培地血清を欠くの条件あたり240μlの再懸濁細胞ペレット（第4章「注意」を参照してください）​​。この実験では、プレーンなRPMIの720μlの細胞ペレットを再懸濁します。各チャンバ、チューブあたり240μlのために標識空の1.5ミリリットルチューブに細胞を分割します。使用するまで37℃のヒートブロック中で細胞を保管してください。 3.番目のセットアップ電子入力/出力ホースとシリンジポンプ 37°Cまでの顕微鏡ライブイメージング室を温めます。 入力ホースを準備します。 水と500ミリリットルのガラス瓶を記入し、蓋に2穴を作ります。 「中」とホールのラベルを付け、「アウト。」 これは、 入力メディアの加熱水浴として機能します。 蓋の穴を通って水浴中にホースの入力を実行します。 "アウト"穴から来るシリンジに接続するホースの側が穴"で"と入力リザーバに接続する側を通って来ていることを確認してください。 システムから空気を除去し、水60mlでホース入力を洗い流します。 プライムRPMI培地は、血清を欠くとホースの入力は 37℃に温めました。 60ミリリットル注射器を記入し、ホースが完全にプライミングされた、任意の気泡を欠くするまでメディアを押し通します。 注：lengtに応じて、チューブの時間は異なりますプライムに必要なボリュームを使用していました。 （ここでは3）の実験でチャンバーの数により分（5分）の数で流れ（ここでは0.3 ml /分）の速度を乗算することにより、実験に必要なメディアの量を計算します。この実験では、4.5ミリリットルのメディアを使用しています。注：私たちは、プライミングした後、注射器に残っている（ここでは9.5ミリリットル合計）5ミリリットルに余分な容積を有するお勧めします。 37℃を維持するために、顕微鏡のライブイメージングのエンクロージャに全体を入力セットアップを置きます。筐体の外にホースとシリンジを実行して、シリンジポンプにシリンジをロードします。 出力ホースを準備します。 出力廃棄物として使用するために250ミリリットルボトルの蓋に穴を作ります。 穴を通ってボトルへ出力チューブを実行します。大まかにすべての方法を閉じていない、ふたを固定します。 マイルのライブイメージングのエンクロージャに出力設定を置きますcroscope。 所望の剪断応力（ダイン/ cm 2で）を生成するために必要な流量（ml /分）を計算します。せん断応力はせん断​​応力レベルを決定する際に、したがって考慮細胞研究するタイプやトリートメントを含む全体的なモデルを取る、別の血管の区画で変化します。 注：これらの実験は、密接に小静脈設定を模倣する0.4ダイン/ cm 2で行われます。 せん断応力を計算する際に考慮室の寸法を取ります。フローチャンバーのために（メーカー11によって提供される）次の式を使用し（材料の表を参照してください）ここで使用される：T =η* 176.1 *øここで、T =せん断応力、η=動的粘度、O =流量。注：37℃でRPMI媒体の動的粘度は、0.007です。 細胞のフローチェンバースと刺激の4読み込んでいます注：接着を開始するために、T細胞が刺激されなければなりません。以下の実験では、細胞が刺激されていないままにするか、またはSDF-1α12またはホルボールミリステートアセテート（PMA;陽性対照）で刺激されている13。 T細胞へのケモカインの適切なプレゼンテーションのために、CHO-ICAM細胞は、細胞表面上での提示を可能にする、（シリアル回洗浄した）SDF-1αと共にプレインキュベートされています。 PMAは、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール（DAG）に構造的に類似しているホルボールエステルです。ここでは、陽性対照として使用します。 T細胞は、直前フローチャンバーにロードし、PMAで処理されます。 顕微鏡でのフローチャンバースライドを配置し、20Xの対物レンズを用いてCHO-ICAMの単層上で焦点面を設定します。 37℃のヒートブロック内の他のすべての条件をCFSEで染色したT細胞を保管してください。その条件のためのアッセイの直前に、次のようにCHO-ICAMまたはT細胞を準備します。 刺激されていない状態（チャンバ1）の場合、1チューブ/フローCHを保ちます未処理の琥珀は、刺激のための陰性対照として機能します。 PMA刺激（チャンバ2）については、陽性対照として役立つようにPMA（10ng / ml）でT細胞の管を刺激します。フローチャンバーにロードする直前に扱います。 SDF-1α刺激、（チャンバ3）の場合は、上部の貯水池（ 出力リザーバー ）から一度に3回を70μLを除去した後、自衛隊の70μLを加えることによって、SDF-1α（100ng / mlの）第3フローチャンバーを刺激します-1α（100ng / mlの）下池（ 入力リザーバ ）へ。 5分間インキュベートします。 1室の出力リザーバーから3回を削除し、一度に70μLを捨てます。 3回入力リザーバに前処理された70μlの（該当する場合）のT細胞懸濁液を追加します。細胞は、チャンバ（「中」）の入口から移動できるように5分待ってから、チャンバーの近位出口（「アウト」）に達します。 この間、画像5CFSE染色T細胞のためのフィールド。チャンバーの中央（ 図1）全体に分散されたフィールドを選択してください。励起レーザ波長：以下の励起/発光条件使用488nmでの、放射捕集フィルタ：500から540 nmの。これらの画像は、プレフロー細胞数となります。 フローチャンバーの貯水池に同時に入力と出力のチューブを取り付けます。 注意：チャンバー内に気泡を導入し、チャンバ内の全体的な平衡を維持しないように同時にチューブを取り付けることが重要です。 CFSE染色T細胞を可視化しながら、0.3ミリリットル/分（0.4ダイン/ cm 2）とで流れを開始します。フローは、特に第一のチャンバと、開始すると、したがって、T細胞の移動の開始タイミングで5分間の開始、多くの場合、流れを開始し、T細胞ローリングを観察する間に遅延が存在します。 5分後にフローを終了し、CFSEチャネル内の画像5フィールド。ランダムのthro分散フィールドを選択します。フローチャンバーの中心ughout（ 図1）。これらの画像は、後流の細胞数となります。 5.接着細胞の割合の判定注：取得された画像中の細胞の数の決意を自動化ソフトウェアを使用して客観的に行われます。我々の研究のために我々は、そのようなImageJの（バージョン1.48V）などのソフトウェアVolocity（バージョン6.2.1）が、他のソフトウェアを使用するにも適用可能です。 各条件のためのフィールドプリフロー当たりの細胞数を決定します。 5フィールドの平均は「プレフロー平均細胞数」である。7 各条件についてフィールドポストフロー当たりの細胞数を決定します。 5フィールドの平均は「ポストフローの平均細胞数」である。7 以下の式を使用して接着細胞の割合を計算する： 接着細胞のパーセンテージ=（ポストフロー平均細胞数）/（プレフロー平均細胞数）×100％。

Representative Results

代表的な結果は、Jurkat細胞および初代ヒトCD3 + T細胞を用いたフロー接着アッセイで示され、示されているように、SDF-1αで刺激しました。すべて示される実験における負の対照は、刺激されていない細胞です。非刺激細胞の閾値基礎パーセント接着は、5との間にある – 10％。特に、この範囲を超える塩基の密着性が問題と実験を示し、T細胞の開始集団は非特?…

Discussion

正常T細胞の接着を分析するために、刺激は、インビトロの方法を選択する際に考慮しなければならない研究に含まれます。 LFA-1の活性化および結合ICAM-1につながる信号を研究するためのいくつかのアッセイがありますが、すべてのメソッドには互換性がありません。静的接着アッセイ^10は、T細胞、APCの相互作用を研究するのに最適な、その代わりに、ここで詳述せん断応力法?…

Materials

T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950