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方法論記事

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル

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DOI：

10.3791/54205

⸱

2016年7月28日

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, 2Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 3Techna Institute, University Health Network

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、生体内で大腿骨骨髄内の細胞の動きを追跡するために使用できる新しいマウス大腿骨窓室モデルについて説明しています。生体内多光子蛍光顕微鏡は、大腿骨骨髄の3つの成分(血管系、コラーゲンマトリックス、好中球)を経時的にイメージングするために使用されます。

要約

骨髄は、さまざまな造血細胞と非造血細胞を含む複雑な器官です。これらの細胞は、造血、免疫調節、腫瘍調節など、多くの生物学的プロセスに関与しています。組織学や血球数など、骨髄における細胞の作用を理解するために一般的に使用される方法は、in vivoで複数の細胞成分の動的な作用を捉えるのではなく、静的な情報を提供します。標準的な方法を補完するために、マウスの骨髄の細胞と構造の連続的なin vivoイメージングを可能にするために、ウィンドウチャンバー(WC)ベースのモデルが開発されました。このプロトコルは、大腿骨骨髄への長期的な光学的アクセスを容易にするために、大腿骨にWCを設置するための外科的手順を説明しています。特に、その実験的有用性を実証するために、このWCアプローチを使用して、大腿骨の血管ネットワーク内の好中球を画像化および追跡し、骨髄内の免疫細胞の輸送と制御を視覚化および定量化する新しい方法を提供しました。この方法は、造血、幹細胞移植、がんなどの病的状態における免疫応答など、マウスの骨髄におけるさまざまな生物学的プロセスの研究に応用できます。

概要

骨髄は造血及び免疫調節に関与する重要な器官です。これは、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）を含む造血成分、および間葉細胞1を生じる非造血前駆細胞を含む間質成分から成ります。造血活性の三分の二は、骨髄細胞2の世代に捧げられています。 1-2×10 11細胞は、正常な成人2日ごとに生成して、特に、好中球の大多数は、骨髄で産生されます。好中球は、微生物感染に対する防御の第一線であり、ストレスが末梢 ​​好中球1,3を補完するために彼らの動員をトリガするまで、主に骨髄に予約されています。それらの抗菌効果に加えて、最近の研究では、形質転換成長によってプロ及び抗腫瘍形成表現型の両方を有する、癌生物学における好中球の重要な役割を示唆しています腫瘍微小環境4,5におけるシグナル伝達因子β（TGF-β）。また、研究では、循環中の好中球は、細胞毒性、抗転移効果8を発揮しながら、原発腫瘍に蓄積する好中球は、T細胞6,7の細胞傷害性機能を抑制することにより、プロ腫瘍形成および転移性効果を発揮することを実証しました。このように、骨髄中の造血細胞の研究、特に好中球は、免疫および腫瘍調節におけるそれらの役割を解明するために重要です。

組織病 ​​理学および完全な末梢血球数を日常骨髄9細胞および構造変化を評価するために使用されます。しかしながら、これらの方法は、異なる細胞集団または組織の微細構造の静的な情報を提供します。長手方向のインビボイメージングは、複数の細胞、血管および間質成分の動力学ならびに細胞からCを評価するための標準的な方法と組み合わせて使用することができます縦の方法でエル相互作用。顕微鏡の分解能10で生きている動物の画像化として定義される生体顕微鏡（IVM）は、必要な実験動物の数を減少させる、同じ試料中の経時動的な細胞プロセスを評価するために特に有用です。 IVMは、多くの場合、数週間から数ヶ月の期間にわたって画像化の対象の臓器にアクセスするために慢性的に移植窓室（WC）と組み合わされます。頭蓋と背皮脂WCのモデルが戻って1990年代半ばにさかのぼる使用の最も長い歴史を持っています。より最近では、このような乳房脂肪パッドおよび様々な腹部の器官のものなどの他の臓器特異的WCモデル11を開発されてきました。

生体内で骨髄を撮像するための典型的なアプローチは、薄くなった骨が最小限の外科的介入12-14と単一細胞の直接可視化を可能にしたマウスの頭蓋冠、の主に関与露出を持っています。しかし、頭蓋冠の骨髄は、bの場合があり電子HSPCs 15の維持・発展を減少示し頭蓋冠でHSPCsと低酸素細胞の低い数、によって示されるように、そのような長い骨のような他の骨、のとは異なります。したがって、長骨内の細胞成分を評価するための代替的なアプローチが研究されてきました。これらは、大腿骨の髄16と背側皮下脂肪WC 17で分割大腿骨の異所性移植の直接のエクスポージャーが含まれます。しかし、前者はより長い期間にわたって、セルラー構造的および機能的変化の追跡を許可しない端末の手順であり、後者の可能性が高いが原因背側皮下脂肪WC内部の異所性サイトへの大腿骨の移植に正常な骨髄機能を妨げます。時間をかけて大腿骨髄の同所シリアルイメージングを可能にするもう一つの方法は、大腿骨にWCを使用することです。一つ前のレポートでは、使用して大腿骨髄中の微小循環の長期的なイメージングを実証しましたマウス18で大腿骨WC。さらに、著者らは、骨髄転移をモニタリングにおけるその有用性を示す、大腿骨における腫瘍細胞の可視化を示しました。しかし、このWCの設計は、それによって作り、その大きなサイズ（1.2センチ直径）と大規模なマウスのみに適した比較的小さな撮影領域（直径4mm）、（26〜34グラム、生後3-6ヶ月）によって制限されていました日常的な使用のための非現実的なアプローチ。

したがって、小さい全体のサイズと大きい内側の撮像領域を持つ新しいWCは、本研究の目的のために設計されました。この研究の目的は、大腿骨の髄内に種々の細胞型を撮像するための方法を提供することでした。大腿骨WCモデルは、社内で開発された3D血管網内の好中球を可視化し、追跡するために使用されました。このモデルを用いて、骨髄のIVMは、40日間に渡って連続的に行うことができます。このアプローチは、免疫調節A、造血のプロセスを解明するための様々な分野に適用することができますND腫瘍発生。

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プロトコル

注：すべての動物の作業は、大学健康ネットワーク施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの＃2615で行いました。

マウスの1外科の準備

  1. 手術に先立ち、オートクレーブにより、すべての手術器具や窓室（WC）を滅菌します。 2日前、手術とアモキシシリンの50 mg / kg体重で飲料水を補います。腹腔内に4時間、手術前にブプレノルフィンの0.1 mg / kg体重でマウスを注入します。
  2. 80ミリグラム/ kgのケタミンおよび13 mgの/ kgのキシラジン（注を含む350〜400μlの生理食塩水の腹腔内注射による無胸腺ヌードマウスを麻酔：これは施設内動物実験委員会によって承認された、と私たちは悪影響の経験がありませんでした）。足の反射をテストすることによって、適切な麻酔を確認してください。手順中の呼吸パターン、粘膜の色と足の反射のために観察し続けます。
  3. 外科的な広報を行います手術中に無菌状態を維持するための安全キャビネットの下ocedures。手術中の体温を維持するために、外科用ドレープで覆われた電気加熱パッドの上にマウスを置きます。実体顕微鏡下ですべての外科的処置を実行します。
  4. 手術中に湿った目を保つために眼軟膏を適用します。必要に応じて、外科手術の際に繰り返します。連続して7.5％ポビドンヨード、70％のイソプロピルアルコールおよび10％ポビドンヨードで拭いて、マウスの動作領域を殺菌し、この手順を2回繰り返します。
  5. 側面から大腿骨に接近し、ブレード（＃15）とメスを用いて10ミリメートル縦皮膚切開を行います。筋肉の機能を確保するために鉗子や止血剤を使用して、鈍的切開により屈筋と伸筋の間の大腿骨を公開します。
  6. 骨の下でU字型の棒を挿入し、WC（ 図1）をインストールします。 2つのナットを使用してウィンドウでバーを固定し、ためにナットを締めCEPS。歯科用セメントと骨とWCとの間の空間を満たします。
  7. 骨髄腔への光アクセスを得るために、マイクロドリルで6×2ミリメートル2領域での皮質骨を削ります。
    注：この手順を実行しながら、慎重に顕微鏡下皮質骨の菲薄化を検査します。骨の無傷の、ほぼ透明骨膜層を残します。
  8. ウィンドウ上に8ミリメートルのカバーガラスを配置し、所定の位置にそれを維持するためにスナップリングでカバーガラスを固定します。
  9. 手術後のその機能を維持するために鉗子を使用して戻って元の場所への屈筋と伸筋の筋組織を再調整します。 5-0縫合糸と針ホルダを使用して、真皮を縫合。
  10. それは意識があると自由に移動できるようになるまで、回復のためのマウスを監視します。回収されたときに、新しいケージに動物を入れてください。
  11. 回復後、（セクション2を参照）と同じ日または次の日に動物の画像取得を行います。 physiを監視します毎日マウスのCAL条件。
    注：このような四肢、ハンチング、急速または浅い呼吸、後肢の腫脹、自傷、蜂巣および重度の皮膚炎に体重負荷のような物理的な条件を、監視します。
  12. 3日間のブプレノルフィン/ kg体重を0.1mgの腹腔内注射を与え、術後疼痛及び炎症の治療のための手術後5日間、メロキシカム1mg / kg体重。 5日間アモキシシリンを補充した水を提供し続けます。
  13. 実験的なエンドポイントで、二次的方法（ 例えば 、頚椎脱臼）、続いてCO 2ナルコーシスにより動物を安楽死させます。

複合多光子共焦点顕微鏡を用いて2画像取得

  1. 撮影に先立ち、80ミリグラム/ kgのケタミンおよび13 mgの/ kgのキシラジンを含む350〜400μlの生理食塩水の腹腔内注射によってマウスを麻酔。利用可能な場合あるいは、吸入可能麻酔薬を使用しています。眼軟膏を適用します。
  2. および好中球（アロフィコシアニン（APC） - 抗Ly6G抗体4μgの）（2 MDAフルオレセイン（FITC） - デキストランの0.65 mg）をラベリング血管系のための血管内色素の混合物を注入します。
  3. 青から赤に励起波長を提供して705から980 nmのから二光子励起のために及ぶ多光子レーザー、ならびに単一光子レーザーを装備した直立組み合わせた多光子共焦点顕微鏡を使用してください。
  4. 顕微鏡（ 図1B）上にカスタムメイドの撮影台を設定します。ワニ口クリップでWCの2つの端部をクランプすることにより、ステージ上でマウスを固定します。
    注：WCを保持するための2つのワニ口クリップ、撮像中にマウスの生理的温度（37℃）を維持するために加熱要素：ステージの重要な構成要素です。
  5. 二光子レーザーおよび共焦点システムの電源を入れ、「スタートシステム」をクリックすることで、画像取得ソフトウェアを起動します。 4つのタブ付きウィンドウ（見つけて、収集、処理、および保守）が開きます。
  6. イメージングチャンネルを設定します。取得タブの下に「スマートセットアップ」をクリックして、イメージングのために使用される染料を選択：FITC（488 nm励起、493から588 nmの発光）とAPC（633 nm励起および638から743 nmの発光を）。 「最良の信号」を選択し、「適用」をクリックします。
  7. 第二高調波発生（SHG）撮像チャネルを手動で追加します。買収タブの「レーザー」ウィンドウの下に二光子レーザーをオンにします。 Channelsウィンドウの下で、トラックを追加するには、「+」記号をクリックしてください。
  8. SHGトラックを設定します。上下の矢印を使用してChannelsウィンドウの下に840 nmの波長を変更し、スライダバーを使用して「光パス」ウィンドウの下に415から425 nmで検出範囲を選択します。
  9. 探しタブの下に「接眼レンズオンライン」をクリックします。関心のある領域を表示し、トンを回して手動でピントを調整するためにFITC用のフィルタ設定の下でFITCをクリックします彼は顕微鏡の側につまみを集中します。関心領域が配置されているときに、見つけタブの下に「接眼レンズオフライン」をクリックします。
  10. 取得]タブをクリックします。 Channelsウィンドウの下にFITCトラックを選択して、5倍の対物レンズを用いてFITCデキストランの画像をプレビューするには、「ライブ」をクリックしてください。必要に応じてフォーカスを調整し、プレビューを停止するには、取得]タブの下で「停止」をクリックします。
  11. 手動でレンズの上にホイールを動かすことによって、20X水目標に向けます。 20Xの対物レンズを用いてFITCデキストランのために再度画像を表示し、最適な信号とコントラストを達成するために、チャンネル・ウィンドウの下にマスターゲインとピンホールを調整します。 Channelsウィンドウの下にAPCとSHGのトラックを選択することで、他のチャンネルについて、この手順を繰り返します。
  12. 撮像パラメータを選択します。そのウィンドウを開くには、「取得モード」をクリックします。高品質の画像を得るために、フレーム1,024×1024ピクセルにサイズ、および4Xの平均化を設定します。
  13. 2Dスナップショットを取得します。チャンネルが勝つの下にすべてのチャンネルを選択しますダウとは、買収のタブの下に「スナップ」をクリックしてください。画像の品質を確認し、必要に応じて撮影パラメータを変更します。
  14. 2Dタイムラプス画像を取得します。
    1. 時系列ウィンドウを開くために取得タブで「時系列」をオフに確認してください。間隔の下で0を入力し、時間間隔なしで連続40画像を撮影するためのスキャンの合計数は40。
      注：40スキャンは7.5秒/フレームの走査速度及び600μmの×600ミクロンの画像サイズで約5分の長期時系列を生成します。間隔顕微鏡、画像取得の設定、カメラのフレームレートに応じて、スキャンの数を調整します。固定されたインターバル時間（> 0秒）は、異なる時点で取得されたタイムラプス画像を比較するために使用することができます。長いタイムラプスイメージングの期間は、実験条件における好中球の予想平均速度（または関心のある他の細胞）に応じて必要となる場合があります。
  15. 3D画像を取得します。
    1. Z-Stack]ウィンドウを開くために取得タブで「Z-スタック」をオフに確認してください。 FITCデキストランのための「ライブ」プレビューモードを開始します。サンプルの上に焦点を当て、「最初の設定」をクリックし、サンプルのもう一方の端に焦点を当ててクリックZスタックウィンドウに「最後のセット」。
    2. Zスタックウィンドウの下には10μmであると間隔を設定します。前のステップで選択した最初と最後の光学スライスに応じて、これは90から180ミクロンの全体的な光学的厚さで、10月20日のスライスを生成します。
      注：zスタック間隔は、光学スライスの厚さを決定するピンホールの大きさに依存します。光学スライスの厚さよりも小さくなるように間隔を設定します。
    3. 画像の収集を開始するために取得]タブの下の「実験を開始」をクリックします。
  16. 3Dタイムラプス画像を取得します。
    1. 時系列を開くために取得タブで「時系列」をオフにチェックし、「Z-スタック」Zスタック窓。
    2. ステップ2.14と2.15で説明したように時系列およびZ-スタック取得パラメータを設定します。画像の収集を開始するために取得]タブの下の「実験を開始」をクリックします。
  17. それが安定して無意識であることを確認するために撮像中にマウスを監視します。マウスは、撮影時の不安定および/または意識がある場合は、ステージからマウスを削除し、腹腔内に麻酔液の追加の100-150μLを注入し、撮影を続けます。
    注意：不安定性の徴候は、取得した画像にアーチファクトをシフトとして見ることができるマウスの速い呼吸と動きを、含まれています。
  18. 画像取得後、ステージからマウスを取ると、ケージに戻します。暖かいそれを維持し、それは意識があるまで、マウスを監視するために加熱ランプを使用してください。

3.画像解析と定量化

  1. 3次元時系列データを分析するために画像解析ソフトウェアを使用。ソフトウェアを開いて、「アリーナ」ビューと呼ばれるオープン画面へドラッグして画像を追加します。それを開くには、画像ファイルをダブルクリックします。画像は「サーパス」ビューの下で開かれます。
  2. 2D / 3D画像を作成します。
    1. 右上にある "詳細"バーから、「画面の調整」ウィンドウを開くには、「編集/表示するディスプレイの調整」をクリックします。各チャネルのしきい値を調整することにより、蛍光表示を最適化し、画像を保存するスナップショットを取ります。
  3. タイムラプス画像を使用してオブジェクトのトラックを生成します。
    1. ビューを「サーパス」で分析する画像を開きます。 「サーパス」アイコンの下に見つかったオレンジ色のドットの画像とアイコンをクリックします。これは、新しい「スポット」ウィンドウを開きます。
    2. 「（時間以上）のトラックスポット」をオフにチェックして、次のステップに進むために青色の矢印をクリックしてください。 「ソースチャンネル」の下で追跡するためのオブジェクトを含むチャンネルを選択して、推定されたオブジェクトDIAMETを設定数値を入力して「推定XY直径」の下えー。次のステップに進むために青色の矢印をクリックしてください。
      注：好中球の追跡のために、好中球に対するAPCの蛍光を含むチャンネルを選択して、好中球の既知のサイズに基づいて、12ミクロンへのオブジェクトの直径を設定します。
    3. ウィンドウで、検索し、下矢印をクリックして「品質」フィルタを選択します。ソフトウェアで定義されたスポットを観察し、スポットを含めるか除外するかを手動でしきい値を調整します。しきい値が定義されると、「トラッキング」のステップに行くために青色の矢印をクリックしてください。
    4. アルゴリズムの下で、下矢印をクリックして「自己回帰モーションアルゴリズム」を見つけ、選択します。 「最大ギャップサイズ」の「最大距離」のための10ミクロンおよび3のタイプは、パラメータの下で見つかりました。オフチェック追跡を開始し、次のステップに行くために青色の矢印をクリックし、「すべての検出されたオブジェクトとのギャップを埋めます」。
      注：「自己回帰運動アルゴリズムは「F使用されていますまたはそれは、前の動きから予測位置に基づいて、トラックを生成するので、動きを指示したオブジェクト。 「最大距離」と「最大ギャップサイズは、「予想される寸法と速度追跡されているオブジェクトのと同様に、タイムラプス画像の全体の持続時間に応じて調整することができます。
    5. フィルタの種類]で、「トラック時間」フィルタを選択します。追跡を終了するには、緑色の矢印をクリックし、生成されたトラックを確認してください。必要に応じて手動でトラックをソートする前のステップに戻ります。
  4. 生成されたタイムラプス画像ドリフトの場合、翻訳ドリフトの正しいです。
    1. 鉛筆の画像でアイコンをクリックしてください。これは、「編集トラック」ウィンドウが開き、編集タブです。タイムラプス画像を調べて、すべての画像に移動すべきではないの参照場所を見つけます。
    2. 画面の左上隅で、「ポインタ」ウィンドウを見つけるとCuをアクティブにする」を選択し、「オフチェックスポットを選択するためのrsor。参照スポットをクリックします。
    3. 「編集トラック」ウィンドウに「正しいドリフト」をクリックしてください。 「トランスレーショナドリフト」をオフに確認してください。ソフトウェアは自動的に画像の補正後のシリーズを生成します。
  5. タイムラプス画像内のオブジェクトのトラックによって定義された携帯の動きを測定します。
    1. 「編集トラック」ウィンドウの下に、「トラック」をオフにチェックし、細胞の動きを表すトラックを選択。選択したトラックは、時系列画像の黄色で強調表示されます。
    2. 「統計」ウィンドウ（統計]タブ）を開くために、グラフの画像とアイコンをクリックしてください。
    3. 「選択」の下では、トラックの速度が選択されたトラックのために意味を生成するには、下矢印をクリックして「トラックスピード平均」を選択します。別のトラックを選択し、トラックの速度は関心のあるすべてのセルの平均を測定するためのステップを繰り返します。

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結果

マウス大腿骨髄が正常に個々の好中球および血管ネットワークの可視化を可能にするためにWCを使用してアクセスします。1は、WCの楽器を示し、内部の光学アクセスを得るために、大腿骨と皮質骨の菲薄化の露出を伴う外科手術を、説明図骨。手術はマウスで忍容性が良好です。それらは苦痛の無い報告書では、このような5日後に手術のためのWCに後肢の腫脹、非重量は手足にベアリング、自傷、蜂巣や皮膚炎、ならびに損傷などの有害な物理的反応、について評価しました。特に、ウィンドウは介入後の細胞と構造変化の長期的な評価を可能にする、最大40日間IVMのために光学的に透明なままです。

骨髄内の血管系は、FITCデキストランのような血管内の色素によって可視化することができます（ 図2）。コントラスト色素の注入に依存するため、取得された画像は、十分な血流が存在する機能的血管構造を表します。...

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ディスカッション

リアルタイムは、骨髄中の動的な細胞プロセスの連続撮影は、そうでなければ、このような組織学および総血球数などの従来の技術を用いて得ることが挑戦されている情報を提供します。ここで説明した大腿骨WCモデルは、時間の経過とともに、骨髄中の細胞と構造変化を調査するためのユニークな機会を提供しています。大腿骨WCモデルは、以前に報告されているが、本発明の新規な設計は、成体マウスでの使用のための多くの互換性のあるビュー小さい全体WCサイズの大きな撮像視野を提供します。大腿骨WCモデルは、免疫および/またはトランスジェニックレポーターマウスなどのマウス系統の様々な使用することができます。

全体の時間とイメージングの品質を決定手術中の重要なステップがあります。大腿骨を露出させた場合、屈筋と伸筋の間の筋肉の唯一の鈍的切開が行われます。これらの筋肉の除去は、マウスとMUSの減少、移動度をもたらし得ますtが回避されます。また、皮質骨の粉砕を慎重に行わなければなりません。大腿血管網の構造的完全性を維持しながら、約50μmの粉砕は光学イメージングに適しています。骨の周りの歯科用セメントの適用は、外科的に露出面...

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開示事項

著者には、競合する金融利害関係を持っていません。

謝辞

著者らは、WCと撮影台を製造するためのプリンセスマーガレットがんセンターマシンショップから顕微鏡の支援のために大学健康ネットワークで高度な光学顕微鏡施設（www.aomf.caを）感謝したい、と氏はジェイソン・エリスでしょう。また、原稿編集のために博士アイリスKulbatskiに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NRCNU-F 無声性ヌードマウスTaconicNcr ヌード8-10週齢、雌
生理食塩水バクスターJB1302P
ケタミン塩酸塩Bioniche Animal Health Canada, Inc. DIN 01989529
キシラジンバイエル ヘルスケア, バイエル インクDIN 02169592
外科用ドレーププロキシマDYNJP2405
電気加熱パッドライフ ブランド57800827375
実体顕微鏡ライカライカ M60
眼軟膏 (涙液)ノバルティス T296/2
7.5% ベタジンPurdue Frederick Co67618-151-16
70% イソプロピル アルコールGreenFieldP010IP7P
10% ベタジンPurdue Frederick Co67618-150-05
メス ハンドルFine Science Tools10003-12
メス ブレード (#15)VWR89176-368
春はさみ湾曲ファインサイエンスツール15023-10
ベビーミックスヘモスタットファインサイエンスツール13013-14
ファインハサミファインサイエンスツール14094-11
エクストラファイングレーフ鉗子ファインサイエンスツール11151-10
ハルステッド-モスキート止血ファインサイエンスツール13008-12
マイクロドリルハーバード Apparaus72-6065
マイクロドリル バリファイン サイエンス ツール19007-14
大腿骨窓室PMCC マシンショップ カスタム デザイン9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (外径から内径まで)、2.16 mm (2 つの穴の半径)、13.9 mm (2 つの穴の間の距離)、0.7 mm (厚さ)
U 字型バーPMCC マシン ショップカスタム デザイン13.8 mm (長さ), 1.6 mm (幅), 3.7 mm (高さ)
カバーガラス (8 mm)Warner Instruments HBIO 64-0701 CS-8R
リテーニング リング (8 mm)ACKLANDS GRAINGERUNSPSC #
ナット (六角形ステンレス鋼)Fastenal70701
歯科用セメント3MRelyX U200
縫合糸 (5-0 モノソフ ブラック)CovioienSN-5698
Halsey ニードル ホルダーファイン サイエンス ツール12501-13
ブプレノルフィン(テムゲシック)レキットベンキーザーDIN 0281251
メロキシカム(メタカム)ベーリンガーインゲルハイムDIN 02240463
アモキシシリン(クラマボックス)ファイザーDIN 02027879
FITC-デキストランシグマ-アルドリッチFD2000S
APC-アンチマウスLy-6G(Gr-1) eBioscience17-9668
2光子顕微鏡 LSM 710Carl ZeissZeiss LSM 710 NLO
イメージングステージPMCC マシンショップカスタムデザイン15.9 cm (長さ)、11 cm (幅)、0.9 cm (高さ)
Imaris ソフトウェアBitplaneImaris 8.0プロトコルのセクション3に記載されている画像解析ソフトウェア 
Zen 2012ZeissZen 2012議定書のセクション2に記載されている画像取得ソフトウェア 
31163202

参考文献

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