前立腺癌および他の年齢に関連した病状または代謝疾患における生物物理トリガーとして基底膜剛性を研究する方法

サマリー

ここでは、架橋および終末糖化産物（AGEsの）によって誘導された基底膜（BM）の剛性の増加は、病理学的関連性を持っている生物物理学的微小環境をモデル化するためのプロトコルを説明します。

要約

ここでは、加齢に関連する病状および代謝障害（ 例えば、癌、糖尿病、微小血管疾患、網膜症、腎症および神経障害）の間に増加した厚さと基底膜（BM）の剛性に関連する生物物理学的微小環境を研究するために使用可能なプロトコルを記述する。モデルの前提は、メイラード反応を介して、糖化最終産物（AGE）の生成を促進するためのグリコールアルデヒド（GLA）で処理することによって再構成されたBM（RBM）行列の非酵素的架橋です。 AGEの生成、非酵素的架橋を確認するために使用され、GLAで剛性を向上させることができる実験技術の例としては、RBMが概説されて処理されました。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドにより測光分析によるそのAGE含有量および免疫蛍光顕微鏡法、その非酵素的架橋：これらは、決意のネイティブRBM（リン酸緩衝生理食塩水、PBSで処置した）および堅いRBM（GLAで処理された）の調製を含みますレオメトリーを用いてゲル電気泳動（SDS-PAGEの）だけでなく、共焦点顕微鏡、及びその剛性の増加。ここで説明する手順は、罹患したヒト前立腺組織に対して健康で行われる測定と一致して、3.2倍までRBMの剛性（弾性率、E）を増加させるために使用することができます。老化や病気の前立腺に関連した生物物理学的微小環境を再作成するには、3つの前立腺細胞型がネイティブRBMと硬いRBM上に導入された腺：RWPE-1、正常前立腺由来の前立腺上皮細胞（PECの）; BPH-1、良性前立腺肥大症（BPH）の影響を受け前立腺に由来するのPEC。そして、PC3、転移性細胞は、前立腺癌に由来する二次骨腫瘍由来します。複数のパラメータは大きさ、形状および剛性RBM対ネイティブのRWPE-1及びBPH-1によって形成された3D腺腺房の侵襲的特性、平均セル長、遊走速度および3D spherの細胞運動の持続性を含む、測定することができます。同じ条件下で、PC3細胞によって形成されたOID。経路およびタンパク質の細胞内局在を細胞シグナル伝達も評価することができます。

概要

基底膜(BM)は、上皮細胞の層を間質¹から分離することにより、安定した組織境界を維持する特殊な細胞外マトリックス(ECM)のシートです。BM中のコラーゲンIVの隣接する三重らせん間の共有結合架橋は、超ねじれたらせん^の不規則なネットワークを確立することにより、それらの横方向の結合を安定させます2。これらのIV型コラーゲン格子は、ラミニンや他のBM成分との相互作用の足場として機能します¹。BMの構造的配置は、腺上皮³の正常な発達に必要な機械的強度と剛性を提供します。

老化と病気の間に、BMは徐々に厚くなり、硬くなります^3,4。例えば、眼球BMの弾性率(E)は、正常集団では50歳から80歳の間に3倍に増加し、この硬化は糖尿病5のような代謝障害ではさらに悪化^します。BMの構造的および生体力学的変化によりBMの剛性が増大するのは、ECM成分であるIV型コラーゲンとラミニンが、終末糖化産物(AGEs)にさらされた後に非酵素的に架橋されたときに起こります。

ここで説明した方法の目的は、転移性前立腺癌(PCa)への切り替えの文脈で、AGE曝露によるBM硬直が前立腺上皮細胞(PEC)と前立腺腫瘍細胞(PTC)の浸潤性をどのように促進するかを調査するためのモデルを確立することでした。これを行うために、再構成されたrBMゲル⁶中の乳腺上皮細胞(MEC)から3D腺房を生成するために使用されていた以前の方法が、rBMゲルをグリコールアルデヒド(GLA)で前処理する追加のステップを含むように適合された。GLA誘起架橋および前処理されたrBMゲルの硬化を評価するためのいくつかの技術について、測光分析、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)、共焦点顕微鏡法、レオメトリック分析などについて説明します。予め硬化したrBMでの培養用に選択された前立腺細胞型には、以下が含まれる:RWPE-1、正常な前立腺に由来する^PECs7;BPH-1、BPH⁸の影響を受けた前立腺に由来するPEC;PC3、前立腺がん(PCa^{)患者の椎}骨に位置する二次腫瘍に由来する転移性PTC9。

前立腺の病理学の研究を前進させることに加えて、GLAによる治療によるrBMゲルの硬化のためのプロトコルは、BMの硬さが他の加齢関連の病状や代謝障害にどのように寄与するかを調査するために適応させることができます。例えば、このモデルは、適切な細胞タイプの取り込みにより、乳房、結腸、卵巣、膵臓などの臓器のBM硬化によって転移性がんがどのように誘発されるかを調べるために直接適用できます。さらに、このプロトコルは、硬いBMが糖尿病関連の微小血管疾患、網膜症、腎症、神経障害における疾患進行の生体力学的メカニズムをどのように促進するかを調査するために適合させることができます。

プロトコル

GLA処理によって誘導BM剛性の1誘導（非酵素的架橋）

1. バイアルの内容物は、液体（8-16時間）になるまで4℃（低温室または冷蔵庫に氷の上に立って）でインキュベートすることによりBMマトリックスの凍結バイアル（10ml）に解凍します。
   注意：低温室/冷蔵庫を使用しない場合は、氷で全体のボトルをカバーしています。これは、固化からBMの原液を防ぐことができます。
2. 将来の実験のためにと繰り返し凍結融解を避けるために、BM行列の各新たな10ミリリットルバイアルから25×0.4ミリリットルのアリコートを準備します。メーカーによって示される有効期限まで-80℃で保存バイアル。必要なときに、2時間氷上に放置4℃でバイアルを解凍します。
3. 氷の均一な表面を準備します。コー​​ティング手順中に4°Cの温度を維持するために氷の上に8ウェルチャンバースライドガラスを置きます。 4℃でBMマトリックスのバイアルを解凍します。
   注：BM行列の1 0.4 mL瓶のはCOAに十分です全体の1×8ウェルチャンバースライドトン。固化からBMマトリックスを防止するために、処理中に氷に覆われたバイアルを保管してください。
4. はさみを使用して、200μlのピペットチップの分配端をカット。 4℃に平滑末端200μlのピペットチップを冷却し、200μlの容量ピペットエイドにそれを上に置きます。ピペットチップに冷たいBMマトリックス溶液40μlを取り、チルド8ウェルチャンバースライドガラス上のウェルにそれを転送します。
   注：BM溶液40μlを0.8 cm ²の面積をカバーするのに十分です。 BM液の凝固を避けるために、コーティング手順中に冷やしたピペットのヒントを参考にしてください。 BMマトリックス溶液に気泡を導入し、ウェルは均等にエッジで見えるメニスカスを形成せずにコーティングされていることを確認しないでください。
5. 必要なウェルおよびチャンバの数に応じて手順を繰り返し1.4。
6. 塗布後、重合を促進するために30分間37℃で8ウェルチャンバースライドを配置BMの。液体RBMの不要な妨害を避けるために非常に慎重にインキュベーターのドアを閉じます。 RBMゲルの脱水を避けるために、30分間のインキュベーション時間を超えないようにしてください。
   注：得られたゲルは、ネイティブの再構成BM（RBM）です。 37℃のインキュベーション工程を、5％のCO _2を必要_{としません} 。しかし、便宜のために37℃、5％CO _2（加湿付き）に設定し、組織培養インキュベーター中でこの手順を実行します。
7. 0.2 Mリン酸バッファー（pH 7.8）で希釈した50ミリモルのグリコールアルデヒド（GLA）を準備します。 50mLの注射器を使用して、0.22ミクロンのシリンジフィルターに通すことにより溶液を滅菌します。
   1. 50 mMのGLAの最終容量250μlで架橋反応のために、0.5 Mシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは100mMのGLA（2×ストック）の125μlの0.2 Mリン酸緩衝液100μl（pHは7.8から2.5 Mアミノグアニジンの25μlを添加します）。 50mLの注射器を使用して、0.22ミクロンのシリンジフィルターに通してストック溶液を滅菌します。
      注意：ドラフト内で作業中に白衣、手袋、フェイスシールドおよび呼吸器を着用してシアノ水素化ホウ素ナトリウムを処理します。
8. 重合RBMゲルをカバーし、硬いRBMゲルを製造するための半堅いRBMゲルまたは14時間を生成するために6時間、37℃でインキュベートしGLA溶液を250μlのを追加します。
   注：GLAの量は、重合RBMゲルをカバーしなければならないし、それに応じて調整する必要があります追加しました。異なるGLAインキュベーション時間が使用される場合、RBMゲルは（ステップ2.4​​参照）RBM剛性における増加倍率を決定するために分析されるべきです。
   1. 37℃で14時間、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）250μlの中の天然RBMゲルをインキュベートすることによって負の制御を準備します。
   2. 50mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは250mMのアミノグアニジンを添加することによって、架橋反応時のシッフ塩基またはアマドリ付加転位の形成が抑制されている2つの追加のコントロールを準備します。
9. 1 Mグリシンeを準備しますPBSで希釈したthylエステル（GEE）。 50mLの注射器を使用して、0.22ミクロンのシリンジフィルターに通すことにより溶液を滅菌します。
10. 指示されたインキュベーション時間の後、慎重にGLA液が制御ネイティブRBMゲルから制御RBMゲルおよびPBSから阻害剤を含有する、架橋R​​BMゲルからGLA溶液を除去。 RBMゲルのすべてにGEE液の250μLを加え、37℃で1時間インキュベートします。
    注：このステップでは、架橋反応をクエンチ。
11. GLAとGEEのすべての痕跡を除去するために、500μlのPBS中のすべてのRBMゲルを10回洗浄します。彼らの脱水を防ぐために、PBS400μlの中で37℃で一晩RBMゲルをインキュベートします。
    1. AGEの蓄積、非酵素的架橋および粘弾性特性（ステップ2.1から2.4）のためのRBMゲルを分析します。その粘弾性特性の流動度測定分析のためにクローニングリング（ステップ2.4​​）にRBMゲルを準備します。
    2. 細胞培養のために、RBMゲルを500μlの文化で2回すすぐ私細胞を播種する前に、DIAは（ステップ5および6）。ゲル表面に触れるピペットチップなしで静かに洗浄液を実行します。

非酵素的架橋及びRBMの剛性の2定量GLAで処理しました

1. 光分析
   1. GLA処置におけるAGEの蓄積を​​測定し、メイラード反応の程度を決定するための測光分析を用いRBMゲルを制御します。
      1. ステップ1.11の後、8ウェルチャンバースライドにRBMゲルからPBSを除去し、250μlの氷冷蒸留水を追加します。行列が完全に液化されることを確実にするために16から24時間、4℃でインキュベートします。
         注意：この溶液中のRBMペプチドは、自動蛍光特性とのAGEsが含まれています。
      2. 1.5mlチューブに液化BM液を移し、分光光度計（励起波長= 370nmで、発光波長= 440 nm）を用いて溶液の蛍光発光を測定します。
2. 臭化シアンペプチドのSDS-PAGE分析
   1. GLA架橋及びマクロ繊維の形成を誘導したことを確認するために、ポリアクリルアミドゲル上でGLA処理および制御RBMゲルを解決します。
      1. 室温で5分間万×gでステップ2.1.1.2で収集液化BM液を遠心。
      2. アセトニトリルで希釈した臭化シアンの2グラム/ mlを含むストック溶液を準備します。
         注意：白衣、手袋、フェイスシールドや人工呼吸器を装着したまま、必ずドラフト内で臭化シアンを処理します。
      3. 上清を除去し、20 mg / mlと臭化シアン+ 70％v / vギ酸500μlの中でBMゲルペレットを再懸濁し、室温で一晩インキュベートします。
      4. 3.5 kDaの分子量カットオフ透析カセットに再懸濁BMゲルペレットを転送するために1ミリリットル使い捨て注射器を使用してください。
      5. 500二重蒸留水mlおよび磁気撹拌棒を含む500mlガラスビーカー中にカセットを水没。マグネチックスターラー上にこれを置き、臭化シアンとギ酸のすべての痕跡を除去するために4℃（低温室で）で一晩（16時間）透析。
      6. 1.5mlチューブにカセットから透析BMソリューションを転送するために1ミリリットル使い捨て注射器を使用してください。
      7. 12％（v / v）のポリアクリルアミドゲル^10,11上の各BMサンプルの25μlのを分析。 SDS-PAGEに続いて、臭化シアンマトリクスペプチド¹³の電気泳動パターンを可視化するために、ポリアクリルアミドゲル¹²の銀染色を行います。
3. 免疫蛍光顕微鏡分析
   1. 処理されたGLAの免疫蛍光染色を行い、抗AGE /ペントシジンでRBMゲルを制御し、架橋RBMに蓄積されたAGEとコラーゲンIV /ラミニン繊維構造的再編成を可視化するために、共焦点顕微鏡に続く抗コラーゲンIVおよび抗ラミニン抗体は^、13をゲル化します。
      注：常にentiをカバーするのに十分なボリュームを使用ピペットチップでRBM表面に触れることなくインキュベーションおよび洗浄の間にRBMゲルを再度。免疫蛍光法によって3D腺房文化を分析の詳細については文献^6を参照^してくださいと3D腺房の共焦点顕微鏡観察のための基準^14を参照^してください。
      1. 洗浄GLAはPBS +300μlの室温で5分間（PBS、0.1ミリモルのCaCl ₂および0.5mMのMgCl _2を含む）で8ウェルチャンバースライド中で2回処理し、制御RBMゲル。
      2. PBS +は、各RBMゲルをカバーするために、PBS +で希釈したVパラホルムアルデヒド（PFA）/ wの4％の300μLを追加、削除。 RBMのコンポーネントを修正するために室温で30分間インキュベートします。
      3. PFA液w / vの4％を削除します。 75mMのNH ₄ Clで+ 0.5のMgCl ₂溶液を300μlを追加するには、[追加と固定をクエンチする（5回繰り返す）、室温で5分間インキュベートします。
      4. 滅菌水に以下の解決策を行うことで、免疫蛍光バッファ（バッファIF）を準備：130のNaCl、7mMののNa ₂ HPO _4、3.5 mMののNaH₂ PO _4、7.7ミリモルのNaN _3、0.1％w / vのウシ血清アルブミン、0.5％v / vのポリエチレングリコールtert-ブチルオクチルフェニルエーテルおよび0.05％（v / v）のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート。
      5. 20％（v / v）のヤギ血清でバッファIF補完することにより、ブロッキング緩衝液IF準備します。
      6. 急冷溶液を除去し、非特異的な反応を防止するためにRBMゲルにブロッキング緩衝液IFの300μlを添加します。振盪台上で、室温で2時間インキュベートします。
      7. IFブロッキングバッファーを削除し、ブロッキング緩衝液IFに希釈した一次抗体の300μlで4℃で16時間、RBMゲルをインキュベート（1：500マウス抗ペントシジンモノクローナル抗体; 1/250ウサギ抗コラーゲンIV pAbを、1 / 250ウサギ抗ラミニンA / C PAB）。
         注：より長い20時間のインキュベーションを4℃でRBMを液状化することができます。
      8. 一次抗体を除去し、振盪台上で室温でIFバッファの300μlで3回（各10分）を洗浄します。
      9. IFバッファを削除し、ブロッキング緩衝液IFに500：1に希釈した蛍光色素と結合した二次抗体を300μl（ヤギ抗ウサギまたは抗マウスIgG [H + L]）を追加します。振盪台上で、室温で2時間インキュベートします。
      10. 二次抗体を除去し、室温で10分間、IFバッファの300μl中インキュベートします。 IFバッファを削除し、室温でPBS +300μlの中で3×10分を洗います。
      11. （ステップ2.3.1.2と2.3.1.3）上述したように、第二の時間を修正してクエンチしました。
      12. マウントはマウントメディアにRBMゲルを染色し、落​​射蛍光または共焦点顕微鏡を用いて、主要なコンポーネントの密な束の形成を分析します。
          注：免疫蛍光法によって3D腺房文化を分析の詳細は文献^6を参照^してくださいと3D腺房の落射蛍光と共焦点顕微鏡のためのリファレンス^14を参照^してください。
4. レオロジー解析
   1. 処理されたGLAの流動度測定分析を行い、それらのVを測定するために、RBMゲルを制御iscoelasticity（剛性）。
      1. 直径8mmの円形の金型で、厚さ1ミリメートルであるRBMゲルを設定します。これを行うには、24ウェル培養プレートのウェル内部にクローニングリング（直径8mm）を配置し、工程1.3-1.6に記載されるように調製BMマトリックス溶液を追加します。
         注：実験に使用しRBMゲルの正確な要約については、流動度測定分析のために調製RBMゲルは、8ウェルチャンバーで設定RBMゲルと同じ面積と厚さを持っている必要があります。 図3で分析RBMゲルは、厚さ1ミリメートル、直径8ミリメートルでした。
      2. （ステップ1.11から1.8）上記のように14時間、6時間、PBS、GLAおよびGLAとクローニングリングで設定RBMゲルを扱います。
      3. 固定周波数は1Hzの振動および21℃の温度で1〜3％のひずみの範囲にわたって、8ミリメートル平行板鋸歯状の形状を有するレオメーター上で直径8mm RBMゲルの弾性率（E）を測定します。詳細情報についてはECMゲルの流動度測定分析は、参考文献は、参照^13,15,16を参照^してくださいを参照してください。
         注：Eが得られた剪断貯蔵弾性率（G '）から決定され、以下の式E = 2 * Gの使用を介して「*参照^13,15に記載のように（1 + V）は、0.5のポアソン比であります^、16。

3.文化とノーマルPECラインの取り扱い、RWPE-1

1. 成長RWPE-1は5ng / mlの上皮成長因子（EGF）を補充したケラチノサイト無血清培地中の細胞（KSFM）、50μg/ mlのウシ下垂体抽出物（BPE）および50μg/ mlストレプトマイシンと50 U / mlのペニシリン（ KSFM）を完成。
   注：上皮 - 間葉の誘導を避けるために（EMT）様の移行は、血清にRWPE-1細胞が公開されていません。完全KSFMを4℃で貯蔵から除去した後、30分間室温に到達することを可能にし、これはEGFおよびBPEを不活性化するように37℃の水浴中で暖かくありません。
2. 完全を吸引RWPE-1細胞のコンフルエント10cm ²のプレートからのKSFMは、予め加温したPBS 5mlで洗浄し、全ての細胞が溶液で覆われていることを確実に0.05％（v / v）のトリプシンの5ミリリットルを追加します。
   1. 5〜10分間、37℃、5％CO _2（加湿有する）の標準条件に設定し、組織培養インキュベーター中に細胞を置きます。 5分後にトリプシン処理の程度を確認し、静かに細胞を剥離するために培養プレートをタップします。
      注：同時に二つ以上のプレートを処理しないことをお勧めされているので、RWPE-1細胞はトリプシン処理の長い期間を許容しません。クローン選択を避けるために、プレートから全ての細胞を分離することも重要です。
3. すべてRWPE-1細胞が解離したときに、トリプシンをクエンチし、2％v / vのウシ胎児血清（FCS）を含む暖かいPBSを5mlを加えます。ゆっくり遠心管に細胞を転送する前に、細胞凝集物を破壊するために上下にピペットと。
4. x 125から150で解離した細胞を遠心25℃で5分間gを、上清を廃棄し、単一細胞の懸濁液が得られるまで完全KSFM 5ml中の細胞ペレットを再懸濁します。
5. 転送1新しいチューブに再懸濁した細胞のミリリットルと1で細胞を増殖させるために、完全KSFMの9ミリリットルを追加します。その後の実験的な使用のための5通路希釈。腺房を設定するための血球計数器を用いて細胞の残りの部分をカウント（5.1節を参照してください）​​。
   注意：文化の後に長期間以来、10以上の継代のためにしないでください文化RWPE-1細胞は、彼らが正しいアーキテクチャとの房を形成しません。
6. 培養培地にEGFおよびBPEはアクティブなまま確保するために48時間ごとに変更します。
   注：48時間を超えて延びる任意の治療のために、この培地交換を含めます。

4.文化とBPH細胞株の取り扱い、BPH-1

1. RPMI中で培養BPH-1細胞は1640培地は、50 U / mlのペニシリンおよび50μg/ mlストレプトマイシン、5％v / vのFCSで補完します。ウォーム培養培地、PBSおよび使用前に37°Cまでのw / vのトリプシン0.53 M EDTA溶液0.25％。
   注：細胞はまた、2.5％v / vのFCS ⁸を培地で培養することができます。
2. BPH-1細胞のコンフルエントな10cm ²のプレートから培地を吸引し、トリプシン反応を停止することができる血清を含む培養培地の全ての痕跡を除去するためにPBS 3mlで細胞を2回洗浄します。
3. PBSを吸引し、細胞をカバーするために、トリプシン-EDTA溶液3mlを加えます。 5分間37℃、5％CO _2（加湿付き）に設定したインキュベーターでプレートを置きます。細胞は丸いですが、皿に付着したままときに、トリプシン-EDTA溶液を除去します。 5mlのPBSで細胞を洗浄。
4. PBSを除去した後、培地を5 mlを加え、穏やかにピペッティングアップ及びダウン単一細胞の懸濁液を生成します。 15ミリリットルチューブに細胞を移します。
5. 完全培地を8 mlの新たな遠心管に細胞懸濁液を2mlを取り、BPH-1細胞をプレートONTその後の実験的使用のための5の通路希釈：1でのOA 10cm ²の培養プレート。腺房を設定するための血球計数器を用いて細胞の残りの部分をカウント（5.2節を参照してください）​​。
   注意：古いBPH-1細胞は、適切なアーキテクチャを備えた腺房を形成しないように、通路数の記録を保管してください。継代数10以上が望まれていません。
6. 培地ごとに72時間を変更します。

ネイティブとスティッフRBMに前立腺腺腺房5. 3D文化

1. RWPE-1細胞は、腺房を形成するために使用されている場合、完全KSFM300μlのステップ3.5で調製した希釈5,000細胞はBM溶液の2％v / vで補充しました。
2. BPH-1細胞は、腺房を形成するために使用されている場合、BM溶液の2％v / vで補充したRPMI1640培地300μlのステップ4.5で調製した2,500の細胞を希釈します。
   注：BPH-1細胞は、CULの6日後に腺房の同様の分布を得るために使用されるBPH-1細胞のように少ない数RWPE-1細胞よりも大きいですチャー。
3. ゆっくり37℃、5％CO ₂で設定したインキュベーター中で培養液を置き、慎重にネイティブとAGE-補剛RBM上に細胞を播種すると（加湿で）ウェル中の各細胞が分裂その成長腺房の均一な分布を確実にするために1 acinaを生成します。
4. 2日毎に、細胞は、増殖因子が正常acinaのために必要とされていることを確実にするために、2％（v / v）のBM溶液を含有する新鮮な培地で培地を交換し 恒常性。
5. 明視野顕微鏡^13を使用して増殖する培養物中の腺房形態を監視します。
   注：培養3日後、個々の細胞が> 3細胞のクラスターを形成し、〜50μmの直径を持つ1週間の前立腺腺房が観察された後になります。
6. 細胞-マトリックス接着、細胞-細胞接着、apico -基底極性および侵襲性¹³のマーカーに特異的な抗体を用いて免疫蛍光を行うために2.3に記載のプロトコルに従ってください。
   1. 5分間DAPIでインキュベートすることにより細胞核を染色し、PBS +で2×5分間洗浄するために4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で取り付けメディアを使用するか（2.3.12後に）余分なステップを含みます。

ネイティブとスティッフRBM 6. 3D文化前立腺の腫瘍細胞集合体

1. 50μg/ mlのストレプトマイシン、10％v / vのFCS及び50U / mlペニシリンを含有するRPMI 1640培地中で培養PC3細胞。使用前に37℃に、培養培地、PBS及び0.25％W / Vトリプシン0.53 M EDTA溶液を温めます。
2. PC3細胞のコンフルエントな10cm ²の培養皿から培地を吸引し、細胞をトリプシン化反応を停止することができるFCSのすべての痕跡を除去するためにPBSを3mlで2回洗浄します。
3. PBSを吸引し、細胞をカバーし、1分間インキュベートし、トリプシン-EDTA溶液3mlを加えます。
4. 細胞は丸くなるが、慎重にトリプシン-EDTA溶液を吸引し、PBSの3ミリリットルを洗浄、皿に付着したままときトリプシンの痕跡をすべて削除します。
5. PBSを除去した後、培地を5 mlを加え、穏やかにピペッティングアップ及びダウン単一細胞の懸濁液を生成します。 15ミリリットルチューブに細胞を移します。
6. 新しい遠心管にPC3細胞懸濁液の1ミリリットルを取り、培養培地の9ミリリットルを追加します。その後の実験的な使用のために10cm ²の培養皿（1:10希釈）上に細胞をプレー。血球計数器を使用して、残りの細胞を数えます。
7. 培養の勾配ゲルの形成を可能にするために、BM溶液の2％v / vで補充したRPMI1640培地300μlのステップ6.6で調製した2,500 PC3細胞を希釈します。
8. 静かにネイティブとAGE-補剛RBM上に細胞を播種すると、慎重に十分に成長しているスフェロイドの均一な分布を確実にするために37°Cと（加湿付き）、5％CO ₂に設定したインキュベーターに文化を置きます。
9. 培地ごとに72時間を変更します。
10. 堅い（AGE-リッチ）RBMの効果を研究するために、温度/ CO ₂制御と加湿チャンバー^17を用いて明視野ビデオタイムラプス顕微鏡を用いて前立腺腫瘍細胞の遊走、画像PC3細胞上。
    注：PC3細胞は、ネイティブRBM上のストランドに成長し、内腔と腺房を形成しないが、ネイティブRBMに超える72時間を増殖させた場合、彼らは3Dスフェロイドを形成することになります。
11. データ収集に続いて、手動でPC3細胞を追跡し、その移動速度、形状（伸び率）と移行^17-19の永続性を計算します。
    注：細胞軌道の持続性=比D / T、D =開始からの細胞軌道の端までの距離、T =全長。

結果

スティッフRBM上の3D前立腺腺房培養

文化の中で6日後、のPECが正常な前立腺組織由来（RWPE-1）（ 図1A）およびBPH組織（BPH-1）上皮の均一な球状体に編成されている（ 図1B）は、ネイティブ（PBS処理）RBM上のフォーム腺房細胞。これらの腺房はまた、頂端ツー基底極性と可視管腔スペース^13,20と高度に組織化されたPECの特徴を有しています。

剛性化（AGE-リッチ）RBM（GLAで処理された）上で正常前立腺組織（RWPE-1）（ 図1A）由来のPECとBPH組織（BPH-1）（ 図1B）によって形成された腺房が中断アーキテクチャ（シフトを持っています回転楕円体からの多角形に形状や細胞AGE-豊富なRBM）（ 図1A）に房からの移行/突出インチこれら腺房も小さくまたは存在しない管腔空間¹³とその頂端ツー基底極性を失った非常に無秩序のPECを特徴とします。

図1：ネイティブおよびスティッフ再構成基底膜（RBM）に3D腺腺房として成長した前立腺上皮細胞 （A）RWPE-1細胞の明視野画像は、PBS（ネイティブ）またはで処理されたRBMゲル上で6日に12時間まで増殖させ14時間（;堅いAGE-リッチ）のための50mMのグリコールアルデヒド; =50μmのスケールバー。パネルAに記載のように増殖させた（B）BPH-1細胞。スケールバー=50μmの。データは3つの独立した実験の代表である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表1：ネイティブ、セミスティッフとスティッフ再構成基底膜（RBM）上に成長した前立腺上皮RWPE-1房の特性 RWPE-1房がRBM上で成長させた14時間（ネイティブ）のために、PBSで前処理し、グリコールアルデヒド（GLA。 ）6時間（半堅い）または14時間（硬い）のためにGLA。腺房形状については、割合（％）は、円形の標準偏差（SD）を±、半多角形、および多角形の腺房（50腺房条件ごとに定量）5つの独立した実験から計算しました。相対的な腺房の大きさは、3つの独立した実験からの（ネイティブRBM = 100％）を算出しました。侵襲性のために、一つ以上の突出した細胞とSDの腺房±％は、3つの独立した実験から計算しました。倍数変化は、天然の状態の対応する値によって、半剛性または剛性の条件下で得られた平均値で割ることによって計算されます。 P値は、スチューデントのt検定（α= 0.05）を用いて計算しました。

ontent「FO：キープtogether.withinページ= "1"> AGE依存増加RBM剛性はPC3前立腺腫瘍細胞の遊走を促進します

PC3細胞はAGE-リッチ（硬い）上に成長させたのに対し、ネイティブRBM上に成長したPC3細胞は互いに（ 図2A）から独立して、連続的な細胞-細胞接触を維持することによって、RBMの動きを移行します。培養PC3細胞における72時間がネイティブに巣（スフェロイド）を形成した後、スフェロイドからないと独立して（ 図2B）を移行硬い（AGE-リッチ）RBM上のPC3細胞に対し、RBMを（PBS処理します）。堅い（AGE-リッチ）RBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2C）上に成長させたPC3細胞よりも細長いです。硬いRBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2D）上に成長させたPC3細胞よりも速く移行します。硬いRBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2E）上に成長させたPC3細胞と比較して、持続性の減少を表示します。

図2：ネイティブおよびスティッフ再構成基底膜（RBM）に前立腺腫瘍細胞の移動 （A）14時間PBS（ネイティブ）または50ミリモルのグリコールアルデヒドで処理されたRBMゲル上で増殖させたPC3細胞の明視野画像（AGE-豊富な、堅いです） 。細胞は、明視野顕微鏡（10倍対物レンズ）を使用して画像化し、12時間時間あたり1画像の取得率は軌道を生成するために、細胞追跡が続きます。示されている画像は、0、3、6、9、及び12時間後の時点に相当します。単一細胞の軌跡は12時間の時点について示されています。スケールバー=100μmです。 （B）PC3細胞を、72時間、天然または硬いRBM上で培養し、パネル（A）に記載されるように画像化しました。スケールバー=100μmです。詳細は、2倍の倍率で選択した領域を示しています。 （C）平均±SDセル長さ（μm）;ネイティブRBMと硬いRBMとの間に有意な差（p = 1.2×10 ^-23）。 （ （E）平均値±SD持続。ネイティブRBMと硬いRBMた（p = 0.0007）との間に有意差。 CE> 10細胞を分析したパネルの場合、データは3つの独立した実験の代表である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

純粋なRBMゲル⁶でのMECから3D腺腺房の世代のためのプロトコルは、私はRBM行列にコラーゲンを4mg / mlのタイプの添加により、以前の研究で変更されました。コラーゲンの添加は175±37 1589年に±380パスカルから増加RBMゲルの弾性率が得られました。剛性のこの9.1倍の増加がのMEC ²¹の成長、生存、遊走および分化を変調しました。 - （ - ） - RBMゲルに添加されたI型コラーゲンの非酵素的架橋を促進するためにリボースプロトコルがDでの処理工程を含むことにより再び変更されました。剛性の結果として得られる15倍の増加は、それらの侵襲的挙動^22を促進するためのMECの発癌性形質転換と協同することが見出されました。 RBMゲルにI型コラーゲンを追加する実験的アプローチは、間質との間の物理的な障壁後のヒトの組織に発生したコラーゲン繊維とのMECの直接的な相互作用を容易にし、そして、BMが提供する上皮は、タンパク質分解を受けます。純粋なRBMゲルGLAで前処理でのPECから3D腺腺房を生成することにより、現在のプロトコルは、BM剛性自体がその侵襲性の挙動（ 図3）をトリガする方法を研究する道を開きます。このプロトコルで誘導されたBM剛性のレベルは生理的関連性を持っています。 6時間および14時間、50 mMのGLAとのインキュベーションは、それぞれPBS（ 表1）で処理されたRBMゲルで122±55パスカルに比べて175±90および322±160に純粋なRBMゲルの弾性率を増加させました。 RBM剛性のこの1.7から3.2倍の増加が、正常な前立腺またはBPH組織^23-26と比較して、悪性で観察された剛性の2.5〜3.4倍の増加を再現します。最近の刊行物¹³で概説したようにPEC腺房におけるAGEとRBM剛性の蓄積によって誘導される形態学的変化は、ARからの統計学的に有意なシフトを定量化することができます多角形状にounded、管腔/総腺房面積、およびAGE-豊富なRBM（ 図3）にacinaから移行突出した細胞を減少させました。免疫ブロッティングも硬いRBM（ 図3）対正常に成長したPECに（E-カドヘリン¹³の例えば損失）と収縮挙動（ 例えば 、リン酸化ミオシン軽鎖-2、pMLC2 ^13）EMTのマーカーを評価するために使用することができます。さらに、免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡を用いて評価BM（ 例えばラミニン、コラーゲンIVおよびAGE蓄積^13）を視覚化するために適用することができ、細胞の頂端対基底極性（ 例えば 、頂端EEA1の局在：早期エンドソーム抗原1;及びGM130：130 kDaのシス-ゴルジマーカー^13）および接着分子の細胞パターン（ 例えば E-カドヘリンの局在化、細胞-細胞接合部^13）（ 図3）。

図3：ここで紹介するさまざまなプロトコルの概要図は（硬いRBMを分析する方法、硬いRBM上に細胞を播種するためにどのように、グリコールアルデヒド（メイラード反応）で再構成基底膜（RBM）を準備し、補強する方法を示していますメイラード反応の程度）とAGEリッチRBMにより誘導される細胞および分子の変化を分析するために使用され得る手順。 AGE、糖化最終産物; BM、基底膜; DAPI、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール; EEA1、早期エンドソーム抗原1。 GAPDH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。 GLA、グリコールアルデヒド; GEE、グリシンエチルエステル; GM130、130 kDaのシスゴルジマーカー; P-MLC2（Thr18 / Ser19）、ミオシン軽鎖-2部位でリン酸化は18とセリン19トレオニン; RBM、再構成基底膜; SDS-PAGE、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。 RWPE1腺房スケールバーのため= 10ミクロン; PC3腫瘍細胞のためのスフェロイドのスケールバー=100μmです。この図は、基準¹³から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

- （ - ） - リボースRBMの架橋剤として選択され、Dは場合トラブルシューティング手順が必要となります。 - （ - ） - 72時間リボース、以前にRBM /コラーゲンゲル²²について記載したように、RBMゲルの脱水及び収縮をもたらしプロトコルの開発中には、1 MのDでの処置がことがわかりました。 Dの低濃度の評価 - （ - ） - リボース及び短い処理時間がこの制限を克服するのを助けることができます。

RBM剛性の高いレベルが望まれる場合、プロトコルの将来のアプリケーションの潜在的な制限が発生する可能性があります。より長いインキュベーション時間およびGLAのより高い濃度がRBMゲル剛性の高いレベルを誘導するために使用されている場合には、する必要があります以前に^13を説明したように、これらの処理条件は、細胞の生存および増殖に影響を与えるかどうかを評価します。また、血清とRWPE-1細胞のインキュベーションは避けるべき血清または血清含有材料への表現型EMT様移行および露出を誘導することに留意すべきです。実験は短い性RNA（siRNA）オリゴヌクレオチド、干渉のトランスフェクションを含む場合、例えば、手順は、低血清トランスフェクション培地に細胞を切り替えることなく、KSFM中で増殖させたRWP​​E-1細胞を使用して最適化されるべきです。この欠点は、一時的なsiRNAを使用してモデルに近づくときに達成遺伝子サイレンシングのレベルを損なう可能性があります。いくつかのタンパク質標的に対しては、調整可能な遺伝子サイレンシングおよびタンパク質レベルにおける所望の減少を誘導可能なshRNAベクターを使用することが賢明でしょう。間質細胞または腫瘍細胞関連リシルオキシダーゼ^（LOX）17による酵素架橋を組み込む適応はまた、将来のモデルに組み込むことができます。

jove_contentは ">このプロトコルは、プロ侵襲のPECにAGE-依存BM剛性によってトリガメカニズム（RWPE-1、BPH-1）および浸潤性のPTC（PC3）における抗転移目標の評価の今後の研究を促進します。BPHことを考えます代謝障害²⁷であると考えられ、このプロトコルはまた、代謝性疾患および前立腺癌のリスクを増加させたとの間のリンクの私達の理解向上に向けての道を開く。AGEsのへの曝露によって誘導さBMの剛性が他の癌における侵襲性のトリガーとすることができることを考えます種類は、それが他の臓器（ 例えば 、乳癌、結腸、卵巣、膵臓）から正常上皮細胞と腫瘍細胞を組み込んで同様のモデルを設定するためのプロトコルを使用する対象としています。

一緒にタイミングとプロトコル内の重要なステップは、 図4に要約されている。最初のステップの間に、そのPOLを防止するために解凍しながら4℃でRBMのストック溶液を維持するために不可欠ですymerization。彼らは4℃に冷却されるまで、ピペットチップは、RMストック溶液の中に置くべきではありません。次のステップのために、それらはRBM液を塗布する前に、チャンバースライドを4℃に平衡化していることを確認することも重要です。できるだけ早くRBM溶液の温度が4℃を超えて上昇されるように、ゲルを形成する不可逆的な重合を受けます。必須のRBMは、それがあっても、細胞培養及び顕微鏡分析に適した表面を形成することを保証するために、重合段階中に妨害されません。メイラード反応（シアノ水素化ホウ素ナトリウムとamingoguanidine）の阻害剤の有無にかかわらずGLAとのインキュベーションの期間は、RBMゲルはどうなるか硬いかを決定します。堅い条件が必要とされるかどうかは（ 表1）半堅い条件が必要な場合GLAで6時間のインキュベーションを使用することをお勧めし、14時間のインキュベーションされます。 GLAの代替インキュベーション時間または濃度が異なるレベルならば使用することができます剛性が望まれます。この場合、RBMゲルのレオロジー解析は必須の工程として組み込まれる必要があります。 GEEとのインキュベーションおよびPBSでのその後の洗浄工程によりメイラード反応をクエンチする工程に続いて、RBMゲルはすぐに使用することができ、または前の細胞培養のためのそれらの使用を最大48時間、4℃で保存しました。細胞培養物を設定したら、2日ごとに（任意の処理を含む）培地を変更することが重要です。調査対象のパラメータに応じて3-12日間の3D細胞培養を維持することをお勧めします。 3D PECについては、6日後、および3D PTCスフェロイド分析のための培養液を分析することをお勧めします腺房は、最初のインスタンスでの培養の3日後にお勧めします。

図4：重要なステップとタイミングとプロトコルの簡単な概要示さフロワット図が示された重要なステップとタイミングでグリコールアルデヒド（メイラード反応）で再構成基底膜（RBM）を準備し、補強する方法を示しています。プロトコルが停止することができ、及びRBMゲルが格納ポイントも示されています。 RBM、再構成基底膜; GLA、グリコールアルデヒド; GEE、グリシンエチルエステル; ON、一晩。 PBS、リン酸緩衝生理食塩水。 RT、室温が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
I - 単層培養用材料
BPH-1	CaP細胞株データベース	PCaCL-132	連絡先: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
完全なケラチノサイト無血清培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17005-0753	温まらないでください。C使用前の
子牛胎児血清	First Link UK Ltd	02-00-850	-20 & ordm;アリコートPC3
のC	アメリカンタイプカルチャーコレクション	CRL-1435
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15070-063
リン酸緩衝生理食塩水(ダルベッコA)錠剤	キソイド	BR0014G
RPMI1640培地	Sigma-Aldrich	R5886	37 & ordmで暖かい。使用前のCウォーターバス
RWPE-1	アメリカンタイプカルチャーコレクション	CRL-11609
トリプシン-EDTA溶液	シグマ-アルドリッチ	T4049
名前	会社	カタログ番号	コメント
II - 3D培養用材料
アセトニトリル	Sigma-Aldrich	271004
アミノグアニジン塩酸塩	Sigma-Aldrich	396494	目、呼吸器系、皮膚に刺激を与える
チャンバースライド、8ウェル	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
培養マトリックス再構成基底膜(rBM)還元成長因子抽出物	AMS Biotechnology	3445-005-01	-80 & ordm の地下膜 (BM) の保管。アリコート中のC
臭化シアン	Sigma-Aldrich	C91492	皮膚接触および吸入による毒性
ギ酸	Sigma-Aldrich	695076
グリシンエチルエステル塩酸塩 (GEE)	Sigma-Aldrich	50060	目への刺激
グリコールアルデヒド二量体 (GLA)	Sigma-Aldrich	G6805
シアノボロヒドリドナトリウム	Sigma-Aldrich	71435	非常に可燃性。接触皮膚および吸入による毒性
シリンジフィルター 0.22ミクロン	アップルトンウッズ	BC680
名前	会社	カタログ番号	コメント
III - メイラード反応を定量化する材料
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	感光性 -20 ºアリコート中のC
クローニングシリンダー	Sigma-Aldrich	C1059
ヤギ抗マウス IgG (H+L) Alexa Fluor 488 コンジュゲート	ThemoFisher Scientific	A-11001	感光性
ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L) Alexa Fluor 488 コンジュゲート	ThemoFisher Scientific	A-11034	感光性
ヤギ血清	Abcam	ab7481	-20 & ordm;アリコート
Vectashield封入剤のC	Vector Laboratories	H-1000
マウス 抗ペントシジン クローン PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
パラホルムアルデヒド (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	-20 & ordm;アリコート中のC
ウサギ抗ヒトコラーゲンIVポリクローナル抗体	Acris Antibodies	R1041	ストアは-20 & ordm;アリコートのC
ウサギの抗ラミニンA / C pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	-20 ºで保存。アリコート中のC
ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル(Triton-X100)	Sigma-Aldrich	T9284
ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(Tween-20)	Sigma-Aldrich	P1379
透析カセット Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333<
strong>Name	Company	カタログ番号	コメント
IV - 機器
ARG2制御回転レオメーター	T.A. Instruments
Axiovert S100(倍率20倍)顕微鏡	Zeiss
Axio S100顕微鏡用CO2制御加湿インキュベーションチャンバー	ソレント サイエンティフィック
共焦点軸軸 200M (40倍、倍率63倍) 顕微鏡	ツァイス
オリンパス LH50A 位相差を使用したデジタルカメラ付き顕微鏡	オリンパス
PHERAstar Plus プレートリーダー分光光度計	BMG Labtech
名前	企業	カタログ番号	コメント
V - Software
Image J 1.47v	National Institute of Health,米国
MetaXpress	分子デバイス