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方法論記事

グラフト反応性免疫を阻害する調節性マクロファージの機能的特徴付け

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DOI：

10.3791/54242

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2017年6月7日

 , 
1Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Immunología de Trasplantes, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III

この記事について

サマリー

マクロファージは、防御免疫およびホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たす造血系のプラスチック細胞である。この報告では、寛容原性条件下で移植臓器に蓄積する移植片浸潤調節マクロファージの表現型および機能的特徴付けのための最適化されたインビトロ技術を記載する。

要約

移植臓器におけるマクロファージの蓄積は、同種移植拒絶1の特徴として長い間認識されてきた1 。免疫原性単球は、移植後早期に同種移植に浸潤し、移植された器官に対する移植片反応性反応を起こし、臓器拒絶反応を開始する2 。最近のデータは、抑制性マクロファージが長期移植の成功を促進し、移植寛容の誘導に必要であることを示唆している4 。これは、マクロファージ機能の単離および解析のための新しいロードマップを必要とする、マクロファージの個体発生、活性化、および機能の多次元概念を示唆している5 。マクロファージの可塑性のために、組織環境に応じてマクロファージを単離し、特徴づけ、異なるシナリオに従ってその機能を定義する方法論を提供することが必要である。ここでは、グラフト浸潤マクロファージの免疫学的特性決定のためのプロトコルであり、我々がCD8 + T増殖を阻害し、インビトロで CD4 + Foxp3 + Treg増殖を促進する能力を機能的に評価するために使用した方法である。

概要

このプロトコルは、心臓同種移植片から単離された組織浸潤マクロファージの機能を、T細胞応答を調節するそれらの能力に従って研究するためのインビトロ技術を記載する。文献に広く記載されているように、フローサイトメトリーと組み合わせた蛍光細胞追跡色素は、インビトロおよびインビボでの特定の細胞型の抑制機能を研究する強力なツールである。我々のプロトコルは、インビトロでリンパ球増殖をモニターするためのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）法に従う。

CFSE標識細胞が分裂すると、その子孫はカルボキシフルオレセイン標識分子の半分の数を獲得する6 。フローサイトメトリーによる細胞蛍光の対応する減少を用いて、T細胞免疫応答を調節するための抑制性マクロファージの能力をモニターして、細胞分裂を評価することができる。 CFSEはフルオレセインベースの色素であるため、それはbr多色フローサイトメトリーに適用できるようにする。過剰なスペクトルの重複および抗体陽性細胞、特にCFSE7のような可視タンパク質色素を認識できないことを避けるために、表現型決定のための蛍光色素の適切な選択もまた重要である。

放射性標識チミジン（TdR） 8を使用するチミジン取り込みアッセイのような、細胞増殖を測定する別の技術よりも蛍光色素を用いることの多くの利点がある。このアッセイは、有糸分裂細胞分裂中に染色体DNAの新しい鎖に組み込まれるトリチウム化チミジン（ 3 H-TdR）を利用する。細胞分裂の程度を決定するために、細胞から回収されたDNA中の放射能を測定するために、シンチレーションベータカウンターが使用されるので、このアッセイに関連する安全性の懸念は放射性同位体の使用である。方法論的には、トリチウム化チミジン尻細胞の数が少なく、染色後に分析が遅れるなど、重要な臨床検査室の制約条件を満たすほど柔軟ではありません。これとは対照的に、CFSE染色は、細胞増殖を防止し、CD69、HLA-DRおよびCD25などの重要な活性化マーカーを妨害することが示されている。したがって、それぞれの方法論の利点と限界を理解することは、特に、異なる細胞タイプを追跡するために複数の色素が使用される多色検査では、正確で再現性のある結果を得るために重要です。

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プロトコル

この研究では、マウスは、米国農務省のガイドラインおよび実験動物のケアおよび使用のための公衆衛生サービスガイドの勧告に従って収容されている。動物使用を含むすべての実験的技術は、Mount Sinai School of MedicineのIACUC（Institutional Animal Care and Utilization Committee）承認プロトコールに従って実施した。

1.メディアの準備

  1. 2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必須アミノ酸、5mMのHEPESおよび0.05mMの2mM EDTAを用いて、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（10,000U / mL）を含む完全RPMI 1640培地を調製する。 - メルカプトエタノール。

2.同種移植および単細胞懸濁液

注：肺動脈および下大静脈の移植および吻合技術は、最初にCorryおよび共同研究者によって記述され、Liu＆Kangs = "xref"> 10,11（ 図1A ）。

  1. 誘導チャンバー内で4-5％イソフルランで移植マウスを麻酔する。頚椎脱臼によってそれを犠牲にする。
  2. 標準的なはさみで正中線の腹部切開を行い、大動脈を局所化するために腹部の内容物を取り除く。
    注：移植された心臓は、レシピエントの腹部大動脈の右側にあります（ 図1B ）。
  3. 微細な鋭い鉗子を使用してグラフトを静かに引き出し、すぐに氷冷RPMI培地に入れる。
    注：手術用ハサミを使用して大動脈から移植片を分離すると、移植片に損傷を与え、一部の組織が被移植者に付着したままになります。
  4. すべての移植片が収集された後、それらを組織処理用の無菌培養フードに移す。ペトリ皿に移植片を置き、滅菌した鈍いマイクロサージェリーハサミを使用して組織を小さな片（1 mm）に刻みます。
  5. 鋭い歯のforcで5mLのコラゲナーゼA（滅菌1×PBS中の0.1mg / mLコラゲナーゼ）を含む50mLチューブに移す。 37℃の浴中で1時間インキュベートする。
  6. コラゲナーゼを中和するために5mLのRPMI培地を添加し、1mLシリンジのプランジャの助けを借りて100μmのストレーナにサンプルを移す。
  7. 4℃で400 xgで5分間サンプルをスピンダウンします。
  8. ペレットを1mLのACK溶解バッファーに再懸濁する。よく混合し、4℃で5分間インキュベートする。
  9. 溶解緩衝液を中和するために1mLのRPMI培地を添加し、4℃で5分間400xgでサンプルを回転させます。
  10. 200μLのRPMI培地に細胞ペレットを再懸濁し、5mLポリプロピレン丸底チューブに移す。
    注：ポリプロピレンチューブの接着性は低く抑えられています。また、細胞を4℃などの低温で維持すると、接着性が低下する。

3.蛍光活性化細胞を用いたグラフト浸潤マクロファージの単離ing

  1. Fc受容体ブロッキングmAb（ラット抗マウスCD16 / 32）を用いて骨髄細胞上の望ましくない特異的結合をブロックする。表面染色の15分前に1サンプルあたり1〜2μLを加える。
  2. 抗マウスCD45 APC / eFluor780（0.6μg/μL）、抗マウスLy6C APC（2μg/μL）、抗マウスCD11b Percp / Cy5.5（RPMI培地中0.6μg/μL最終濃度）抗マウスLy6G Pe / Cy7（2μg/μL）を添加した。チューブをアルミホイルで覆い、蛍光抗体を光から保護し、チューブを4℃の冷蔵庫で45分間インキュベートする。
    注：一重染色補正のために、ネガティブコントロールチューブ（染色なし）と各蛍光色素で単独で標識された細胞を含むチューブを準備する。ゲートのセットアップを助けるために、アイソタイプコントロールは、特にLy6C（IgG2a）およびLy6G（IgG2b）に使用することができる。
  3. RPMI培地で細胞を2回洗浄し、4℃で400 xgで5分間回転させます。トリパンブルーと血球計算機を使用して細胞を数える1×10 6細胞あたり1mLのRPMI培地で希釈する。選別する前に、サンプルを5 mL、70μmセルストレーナチューブキャップに移します。細胞生存マーカーとしてDAPI（1μg/ mL）を添加し、選別に進む。
  4. マクロファージは敏感で脆弱な細胞であるため、ソート条件を20 psiに設定し、100μmのノズルサイズを使用して4方向純度モードを使用してマクロファージを単離します。
  5. 5 mLのポリプロピレンチューブに1 mLのRPMI培地で採取チューブを準備する。
  6. ソーターソフトウェアを使用して新しい実験を開き、ブランクパネルで空白実験を選択して設定を定義します。
  7. 前方散乱（FSC）対（ 対 ）サイド散乱（SSC）を表示し、すべての白血球上のゲートを表示するドットプロットを設定します。この親ゲートから、SSC 対 DAPIとDAPIセルのゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。
    1. この新たにゲートされた人口で、広告を作成するCD11b 対 CD45を示し、二重陽性（CD11b + CD45 + ）マクロファージおよび好中球のゲートを示す。
    2. ここから、Ly6C 対 Ly6Gを表示し、望ましい集団：Ly6C hi Ly6G - 、Ly6C lo Ly6G - 、およびLy6C int Ly6G +を示す最終ドットプロットを作成する（ 図2 ）。
  8. 選別後、純度と細胞生存率（> 90％）を確認し、コレクションチューブを400 xgで5分間4℃で回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を計数し、それらを完全RPMI培地中で所望の濃度（ 例えば、 1×10 6マクロファージ/ mL）で再懸濁する。
  9. 完全RPMI培地100μLの最終容量を有する96ウェル丸底プレート中のウェル当たり50×10 3個のマクロファージをプレートに添加する。 37℃、5％CO 2で 24時間以上放置する。

4. Isolatio蛍光活性化細胞選別を用いたT細胞数の測定

注意：C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jnは、Foxp3（フォークヘッドボックスP3）遺伝子を発現する細胞を単量体赤色蛍光タンパク質（mRFP）で同時標識するX連鎖標的化ノックインマウス株である。

  1. ステップ2.1で前述したように、C57BL / 6およびC57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J（H-2b）マウスを麻酔し、犠牲にする。脾臓およびリンパ節（LN：鼠径部、腰部、腋窩、上腕および頚部）を単離し、それらを氷冷RPMI培地に迅速に入れる。
  2. LNを単離するためには、マウスを仰臥位に置き、中線の皮膚を下から上に切開し、慎重に腹膜を切開し、穏やかに皮膚を広げる。すべての鼠径部、腰部、腋窩、上腕、および頚部のLNが収集されると（ 図1C 、赤色に着色）、腹膜を切断し、腸の左上側の脾臓を単離する。
  3. 100μmのフィルターを使用して脾臓およびLNを分解する50mLのチューブの上に置いた。 1 mLシリンジのプランジャーを使用して、組織を静かに押します。フィルターがきれいになるまで、必要な回数RPMI培地でフィルターをすすいでください。
    注：各マウスのLNと脾臓を同じチューブに一緒にプールすることができます。
  4. 4℃で400 xgで5分間スピンダウンします。
  5. ペレットを2mLのACK溶解バッファーに再懸濁する。よく混合し、4℃で5分間インキュベートする。
  6. 2mLのRPMI培地を加えて溶解バッファーを中和する。 4℃で400 xgで5分間スピンダウンします。
  7. 200μLのRPMI培地に細胞ペレットを再懸濁し、5mLポリスチレン丸底チューブに移す。
  8. 抗マウスCD4 APC（0.6μg/μL）および/または抗マウスCD8 PeCy7（2μg/μL）の染色。チューブをアルミホイルで覆い、蛍光抗体を光から保護し、チューブを4℃の冷蔵庫で45分間インキュベートする。
    注：一重染色補正のために、ネガティブコントロールチューブ（染色なし）を準備し、蛍光色素の各々を単独で標識した細胞を有するチューブ。
  9. RPMI培地で細胞を2回洗浄し、4℃で400 xgで5分間回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を数える。
    注：CFSE色素は、通常50μgのカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル粉末として提供される。最終的なストック溶液が5mMになるように18μLのDMSOをCFSEのバイアルに加え、数ヶ月間-20℃で保存する。
  10. CFSEラベリングのために、ストック溶液からの5μMのCFSEの最終作業濃度で、PBS中のmL当たり10 6細胞までの濃度でCD8染色細胞を再懸濁する。前述の6のように20℃の浴中で5分間インキュベートする。
    注：（重大なステップ）低濃度（≦10 6 / mL）の細胞では、CFSEの毒性効果を緩衝するために、添加されたタンパク質の存在下で細胞を標識することが不可欠である。したがって、PBSは5％FBSを含むことができる。私が遊離アミノ酸はCFSEと競合することにより標識効率を低下させる可能性がある。
  11. 2mLのRPMI培地でCFSEを中和する。 4℃で400 xgで5分間スピンします。 1×10 6 CD8 T細胞あたり1mLのRPMI培地を加える。
  12. 選別する前に、サンプルを70μmセルストレーナーに5 mLチューブキャップで移します。細胞生存マーカーとして50μLの1×DAPI（1μg/ mL）を添加し、ソーティングに進みます。
    注：1xは、他の構成成分に対する試薬の1：1の比率を意味する。
  13. 20psiおよび100μmノズルサイズでソート条件を設定して、二重陽性CD8 + CFSE + T細胞を単離する（ 図3A ）。
  14. 5 mLのポリプロピレンチューブにRPMI培地1 mLを含む採取チューブを準備し、分取に進んでください。
  15. ソーターソフトウェアを使用して新しい実験を開き、ブランクパネルで空白実験を選択して設定を定義します。
  16. CD4 + T細胞の分離のために、破片および樹状細胞などの大きな顆粒細胞を除くリンパ球上のFSC対SSCおよびゲートを果たす。
    1. この親ゲートから、SSC対DAPIとDAPIセルのゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。
    2. この新たにゲートされた集団で、すべてのCD4 +細胞を単離するためにSSC対CD4を示すドットプロットを作成する（ 図3B ）。あるいは、抗CD3 mAbを使用して、純粋なT細胞集団の単離を確実にすることができる。
      注：すべてのCD4 + T細胞（5〜10％）のごく一部はFoxp3 + mRFP +でなければなりません。
  17. 選別後、純度と細胞生存率（> 90％）を確認し、コレクションチューブを400 xgで5分間4℃で回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を数える。 2×10 6個の T細胞あたり1mLの完全RPMI培地を用いて再懸濁する。
  18. 予め選別したマクロファージでT細胞を培養することにより抑制アッセイを設定する。プレート10 x 10 4 CD4 + Tおよび10×10 4個の CD8 + CFSE + T細胞を、完全RPMI培地100μLの最終容量で同じウェルに添加した。 37℃、5％CO 2で96時間インキュベートする。
    注：マクロファージおよびT細胞は1：4の比で使用された。
  19. アジド含有バッファーを除去するために使用する前に、2mLのPBS中でT細胞活性化剤CD3 / CD28磁性ビーズを洗浄することによってT細胞分裂を刺激する。 1ウェルあたり5μLのマウスT細胞活性化因子CD3 / CD28ビーズを添加する。
    注：磁気ビーズは、抗原提示細胞とサイズが類似しており、抗CD3および抗CD28 mAbに結合し、T細胞の活性化および増殖のための簡単な方法を提供する。

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結果

代表的な結果は、上記のプロトコルで説明されているゲーティング戦略を示しています。結果はまた、移植片浸潤マクロファージとの共培養後のT細胞増殖活性の分析を示す。マクロファージサブセットのin vitro抑制能力を図4で分析した。結果は、寛容化されたレシピエントから得られたLy6C lo Ly6G -マクロファージが抑制的であることを示す。この結果はまた、Ly6C int Ly6G +細胞が適度な抑制能力を示すことを示す。 Ly6C lo Ly6G -細胞のみがin vitroで CD4 + Foxp3 + Tregの増殖を促進した 。一緒になって、このデータは、移植片浸潤CD11b + Ly6C lo Ly6G -マクロファージが、単球由来サプレッサ...

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ディスカッション

このプロトコルは、異なるネズミ実験モデルの他の組織にも適用可能な、実験的なネズミ移植モデルの移植片浸潤骨髄細胞サブセットを免疫学的に特性化するために使用した方法を記載している。純粋な細胞サブセットの良好な収率を単離するためには、20psiでの低圧細胞ソーティングが好ましい方法でした。異なる骨髄集団間の抑制能力の決定的な結果を確立するためには、各骨髄サブセットの純度を維持することが重要である。しかし、市販の濃縮キットのような様々な白血球集団の単離のために、他の方法を使用することができる。関心のある細胞集団にかかわらず、最適な表面染色およびフローサイトメトリー結果のために、移植組織から生存可能な単一細胞懸濁液を得ることが必要である。不正確な組織操作は、細胞喪失を引き起こし、したがって、骨髄サブセットの収率が低い可能性がある。収量を増やすには、サンプルuを処理してください冷たいバッファーを歌い、低い細胞接着性を有する容器（ポリプロピレンチューブ）に細胞を維持することである。このプロトコルでは、多くのタイプの組織（ 例えば 、肺、心臓、筋肉、骨、脂肪、肝臓、腎臓、軟骨、乳腺、胎盤、血液）の解離に広く使用されているC.ヒ...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

我々は、フローサイトメトリー、顕微手術、およびシナイ山での研究優秀な生物リポジトリ/病理学のセンターの技術的貢献を認めています。この研究は、COST Action BM1305：細胞致死療法（A FACTT）、Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Instituteの開発基金、Ciencia e Innovacion Minister SAF2013-48834-RおよびSAF2016-80031-Rに焦点を当てて加速するアクションJO

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
10% FBSLife Technologies26140-079
1,000x 2-メルカプトエタノールLife Technologies21985023
100x Pen/StrepLife Technologies15140122
100x L-グルタミンLife Technologies25030081
100x NonEsential アミノ酸Corning25025039
1 M HEPES バッファー コーニング25060CL
100 mM ピルビン酸ナトリウムThermoScientificSH30239.01
ペニシリン/ストレプトアビジンThermoScientific15140122
コラーゲン Aロシュ70381322
DPBS (カルシウム &マグネシウム)コーニング21031CV
70 & マイクロ;m 細胞ストレーナーFisher22363548
ACK 溶解バッファーLife TechnologiesA10492-01
DAPISigma32670-5mg-F
CFSE-FITCInvitrogenC34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28Life Technologies11452D
96 well U底板コーニング353077
抗体:
抗Ly6C-APCeBioscience175932-80
抗Ly6G-Pe/Cy7Biolegend127617
抗CD11b-Percp/Cy5.5eBioscience45011282
抗CD45-APC/Cy7eBioscience47045182
抗CD4-APCeBioscience17004181
抗CD8-P/ Cy7eBioscience25008181
LSRII Flow CytometerBD Bioscience
FACSDiva ソフトウェアBD Bioscience
C57BL/6-FoxP3tm1Flv/J ジャクソン研究所008374
C57BL/6ジャクソン研究所000664
Balb/cジャクソン研究所000651

参考文献

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