このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

光合成細菌の増殖を探検する鉄（II）リッチ先カンブリア時代マリン湧昇システムの実験室でのシミュレーション

11.7K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/54251

⸱

2016年7月24日

 ,  ,  , 
1Department of Geosciences, University of Tuebingen, 2Department of Geological and Atmospheric Sciences, Iowa State University

この記事について

サマリー

私たちは、実験室規模の垂直フロースルーの列に先カンブリア時代含鉄海洋湧昇システムをシミュレートしました。目標は、O 2とFe（II）の方法地球化学的プロファイルを理解するシアノバクテリアの農産物O 2として進化しました。結果は、O 2を生成し、光合成によって、鉄（II）酸化にchemoclineの確立を示しています。

要約

いくつかの先カンブリア紀の縞状鉄鉱フォーメーション（BIF）の堆積のための従来の概念は先カンブリア紀海洋の熱水供給源からの第一鉄[鉄（II）]湧昇は、分子酸素によって酸化されたことを前提に進み、[O 2]シアノバクテリアによって生成さ。約2.4億年で前にグレート酸化イベント（GOE）に堆積最古のBIF、（グレイ）前、無酸素条件下での酸素非発生型のphotoferrotrophsによって、鉄（II）の直接酸化によって形成された可能性があります。異なる生物学的なシナリオの下で開発地球化学的および鉱物学的なパターンをテストするための方法として、我々は実験室規模でのリッチ海洋湧昇システム古代の海の代表的な無酸素のFe（II）をシミュレートするために、長さ40cmの垂直フロースルー列を設計しました。シリンダは、地球化学的勾配を安定化させるために多孔質ガラスビーズマトリックスを充填し、そして鉄定量のための液体試料は、水カラムを通して取ることができます。溶存酸素ました外部からオプトードを経由して非侵襲的に検出されました。下からのFe（II）の湧昇流束を関与生物実験、トップとは異なる光勾配、および水柱におけるシアノバクテリアの存在の結果、鉄の形成のためのショー明確な証拠（III）鉱物沈殿物とchemoclineの開発鉄（II）とO 2との間です。この列には、私たちがシミュレートされた海洋先カンブリア時代の条件の下で（と将来photoferrotrophsで）シアノバクテリアを培養したBIFの形成のための仮説をテストすることができます。浅海や湖底堆積物を含む - さらに私たちは列の概念は、様々な化学的および物理環境のシミュレーションを可能にすると仮定しました。

概要

先カンブリア時代（前4.6 0.541へGyの）雰囲気は、おそらく前に約2.4 Gyのでいわゆる「グレート酸化イベント」（GOE）でのステップ変化によって中断さ光合成生成された酸素（O 2）、の漸進的なビルドアップを経験し、再び大気Oなどの新原生代（1から0.541 Gyの前）で2は、現代のレベル1に近づきました。シアノバクテリアは酸素発生型光合成2のできる第一生物の進化の名残です。地球化学的証拠とモデリングの研究は、主に無酸素雰囲気3-5の下に海洋表層における局所酸素オアシスを生成し、シアノバクテリアまたは酸素発生型光合成や酸素発生光栄養生物の可能な生物のアクティブなコミュニティを保有中の浅い沿岸環境の役割をサポートしています。

鉄への先カンブリア時代ポイントを通して海水から縞状鉄鉱フォーメーションの堆積（のBIF）（II）（鉄（II））の主要な地球化学cとしてその堆積中に少なくとも局所的海水のonstituent、、。最大のBIFのいくつかは、大陸棚と斜面をオフ形成、深層水鉱床です。堆積したFeの量は、主に大陸（ すなわち 、風化）ソースとマスバランスの観点から互換性がありません。そのため、鉄の多くは苦鉄質や超苦海底地殻6の熱水変質から供給されている必要があります。鉄の速度の推定値は、沿岸環境の外側は、Fe（II）と一致している堆積湧昇7を介して表面の海に供給されます。 Feが湧昇流に輸送されるようにするために、縮小、移動体の形で存在していなければなりません - 鉄（II）として。 BIFに保存鉄の平均酸化状態は2.4 8であり、一般にBIFはFeが酸素によっておそらく、（II）の酸化された鉄の湧昇ときに形成される鉄（III）として寄託保つと考えられます。したがって、スロープenvironmeに沿ったポテンシャルのFe（II）酸化メカニズムを探索NTS BIFが形成された方法を理解することが重要です。また、海洋堆積物の洗練された地球化学的特徴付けは、Fe（II）は無酸素水柱に存在した含鉄条件は、先カンブリア紀を通じて海洋の持続的な特徴であった、とだけ時間と場所に制限されていない可能性があることを確認しましたここBIF 9を成膜しました。したがって、地球の歴史の少なくとも20億年の間、浅い海でのFe（II）とO 2との間のレドックスインターフェイスは、おそらく平凡でした。

多くの研究は、先カンブリア紀の海のさまざまな機能の化学的および/または生物学的な類似体である現代的なサイトを利用しています。良い例が光合成活性（シアノバクテリアによるものを含む）しながら、鉄（II）が10月13日に検出された太陽に照らされた地表水に安定して存在している含鉄湖です。これらの研究の結果は、無酸素/ FERに有酸素の地球化学と微生物特性への洞察を提供しますruginous chemocline。しかしながら、これらのサイトは、一般的に物理的にほとんど垂直ではなく湧昇システムで発生する化学インターフェースよりも、14を混合して層化され、先カンブリア時間4に最も酸素生成をサポートすると考えられています。

無酸素雰囲気下に海洋酸素オアシスの開発を探索するためのナチュラルアナログ、および太陽に照らされた表面水柱中のFe（II）に富む湧昇システムで、現代の地球では使用できません。したがって、含鉄湧昇ゾーンをシミュレートし、また、シアノバクテリアとphotoferrotrophsの成長をサポートすることができる実験室のシステムが必要とされています。微生物プロセスと理解を促進し、完全に古代の地球上の独特の生物地球化学的プロセスを理解するために、岩のレコードから得られた情報を補完することができる先カンブリア時代海水を表し湧昇水性媒体との相互作用の理解と識別。

そのために、実験室規模の列はその中のFe（II）に富む海水培地（中性pH）はカラムの底部に注入した設計された、と上から送り出さ。照明は上位3 cm単位でシアノバクテリアの成長を支え4センチメートルワイド」透光層」を作成するために、頂部に設けられました。自然環境は、一般的に塩分濃度や温度などの物理化学的勾配、によって層別化及び安定化されています。実験室規模での水カラムを安定化させるために、カラムシリンダが実験中に発生地球化学的パターンの確立を維持するのに役立った多孔質ガラスビーズマトリックスを充填しました。連続的なN 2 / CO 2ガス流はGOE 15の前に海の反射無酸素雰囲気を維持するために、カラムのヘッドスペースをフラッシュするために適用しました。鉄の一定のフラックス（II）が成立した後、シアノバクテリアは、列全体に接種し、そしてそのgrowtましたHは、サンプリングポートを介して除去したサンプルの細胞計数によってモニターしました。酸素は、列シリンダの内壁に酸素感受性オプトード箔を配置することによって、 その場でモニターし、測定は、カラムの外部からの光ファイバを用いて行きました。水性鉄スペシエーションは、深さ分解水平サンプリングポートからサンプルを除去することによって定量し、フェロジン法で分析しました。大気から分離して維持され、古代の水柱の実験室規模のアナログは、達成可能であること - 非生物対照実験と結果は概念実証を示しています。シアノバクテリアが成長し、酸素を生じ、およびFe（II）と酸素との反応を解決しました。海洋シアノバクテリアシネココッカス属を接種しながらここで、設計、準備、組み立て、実行、およびそのような列のサンプリングのための方法論は、カラムの84時間の実行から結果とともに、提示されています。 PCC 7002。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

培養培地の調製

注：培地の調製のために必要な機器、化学品および消耗品に関する情報が表に記載されている1括弧内のイタリック英数字コードは、表2に箇条書きと図1に示す装置を参照してください。

  1. Wu らのプロトコルに従って（「媒体」と呼ぶ）海洋光合成細菌（MP）培地5 Lを準備します。16。無酸素と滅菌1 M HClまたは0.5 MのNaCO 3を使用してpHを6.8に調整します。鉄（II）の供給源としては、次のステップで培地溶液を濾過した後、500μMの最終的な鉄（II）濃度を達成するために1 M無酸素および無菌のFeCl 2 -溶液の3.5ミリリットルを追加します。
  2. 鉄（II）、炭酸およびリン酸塩鉱物を沈殿させるために48時間5℃の媒体液を保管してください。 pHの鉄（II）が加算とFe鉱物沈殿結果変更は、したがって、戻ってpHを6.8に再調整します。 0.22μmのフィルターユニットを通して無酸素（100％N 2）グローブボックス内の培地をフィルタリングします。無菌のブチルゴム栓で濾過グローブボックス内部の滅菌5Lのガラス瓶（E.'1）への培地、およびキャップを分注します。
  3. ストッパーへのガスライン、およびベントとして作用する第二の針に接続された1つの使い捨て針を挿入することにより、N 2 / CO 2（V / V、90/10）で培地ボトルの上部空間をフラッシュします。ヘッドスペースの容積を10回変更することを確認します。例えば、10ミリリットル/秒の一定のガス流と、（フンゲート＆メイシー17を比較）は、少なくとも50秒間、50ミリリットルのヘッドスペース量をフラッシュします。
  4. 今のFe（II）の光酸化を防止するために、暗条件下で室温でアルミホイルや店舗で使用する準備ができて中瓶（E）をカバー。培地調製のための3日間を許可します。

文化の調製

">注意：カラム実験で使用されているシネココッカス属の文化PCC 7002は、単細胞の海洋光合成従属栄養性シアノバクテリア属18として記載されているそれは博士M.アイゼン（植物生化学、デュッセルドルフ、ドイツの大学研究所）によって提供されました。 。現在の研究のためにストック培養物は、追加のFe（II）せずに無酸素MP培地上で増殖させました。

  1. 6ミリグラム/ mlで1ミリリットル/ Lクエン酸第二鉄アンモニウムとWuら 16が、代替塩化第二鉄のプロトコルに従って、100ミリリットルMP培地を準備します。
  2. 無酸素条件下で（グローブボックス、100％N 2）は 、無菌のブチルゴム栓で1 120ミリリットルの滅菌血清ボトル、キャップに培地を分配し、アルミキャップで圧着します。 N 2 / CO 2にヘッドスペースを変更します（V / V、90/10）（フンゲート＆メイシー17を比較）し、ストック培養物の5％で接種します。その後酒樽から25℃、600ルクスの光インキュベーターに文化を保存gsten電球。
  3. シネココッカス属以来。 PCC 7002は、光インキュベータ内の最初の24時間の薄い紙タオルで血清ボトルをカバーし、転送以下、感光性です。文化は6-8日間増殖することを可能にします。光合成活性は培地とFeに適応した細胞中のFe（II）を維持するために、7日後の文化を転送するため、細胞増殖のタイムスケールの静的ではありません鉄（II）とFe（II）の酸化をもたらすであろう（II）。
  4. 光学密度（OD）測定のためのサンプルを取ることによって細胞密度監視：培養物の細胞密度（細胞/ mlが）750nmの19の波長で光分光器で細胞懸濁液の試料の吸光度によって決定することができます。対数期のOD 750と文化の直接顕微鏡細胞数との間に直線関係が絶対的な細胞密度20を決定します。
  5. すぐに10 8細胞/ mlの細胞密度に到達するように、光合成による酸素産生を停止するためにアルミホイルで血清ボトルを包みます。
  6. 液体培地に挿入長い（100ミリメートル）の使い捨て針に取り付けられた0.22μmの滅菌シリンジフィルターを用いて、細胞懸濁液中のO 2を削除します。ヘッドスペースとバブル5分間/ CO 2、N 2（フンゲート＆メイシー17を比較）と文化をフラッシュします。列に接種するまで暗所でサンプルを保管してください。

実験のセットアップのための項目および個別部品の調製

注意：実験のセットアップに必要な機器についての情報を、数量や仕様を表2に記載されています。  実験のセットアップに使用されるアイテムの一部が予め用意されており、個別に、表2に記載されている単一の大文字（AG）で標識されており、 図1のようにクローズアップを示します同様のプロトコルでカッコインチ斜体英数字コードは、表2に箇条書き機器を参照し、 図1に示されています。

  1. 列にサンプリングポート（D）を製造するためには、タイトフィットブチルゴム栓（A.3）でポートを閉じます。ブチルゴム栓に1ステンレス鋼針（D. '）を挿入します。針の先端は、列の中央にあることを確認します。
    1. ゴムチューブ（D.2）に針を接続し、熱収縮チューブ（D.3）との接続をシール。 小さ ​​なルアーロックチューブコネクタにチューブのもう一方の端を取り付けます（ 'D.5）、熱収縮チューブ（D.3）との接続をシールし、適切なプラスチックキャップ（D.6）とチューブコネクタをカバー。
      注：サンプリングポートの所望の数に依存して、様々なサンプリングポートと一つのメインポートを提供することが必要である - therefoブチルゴム栓に斜めの角度でステンレス鋼針（D.1）を挿入し 、再。
  2. 次の手順に従って、ブチルゴム栓を変更し、カラムに培地および放電ボトルを接続するために：
    1. ブチルゴム栓（E.2）に、2つのステンレス鋼毛細管（E.4 E.3）を挿入します。これらの毛細血管への適切なゴムチューブ（E.6）を接続し、熱収縮チューブ（E.5）との接続をシール。
    2. 長いキャピラリー（E.3）のチューブの他端にチューブコネクタ（E.7）を追加し、また、熱収縮チューブ（E.5）でこのコネクタを固定してください。
    3. 、短いキャピラリー（E.4）に接続されている他の管の自由端にステンレス鋼針（E.11）を接続熱収縮チューブ（E.5）との接続をシールし、のもう一方の端を差し込みより小さいブチルゴム栓にステンレス鋼針（E.10）。
    4. 大ブチルゴム栓（G.2）に2つのステンレス鋼毛細管（G.3）を挿入し、適切なゴムチューブ（G.4; G.5）を添付。媒体排出ボトルキャピラリー（W2）に短いゴム管（G.4）の自由端を接続します。小さ ​​なチューブコネクタ（G.6）で長いチューブ（G.5）の自由端を装備。第2の放電ボトルのための別のブチルゴム栓を準備するためにこれらのステップを繰り返します。
  3. 列の2つのメディア供給ラインを生成するためにブチルゴム栓（F.2）に2つのステンレス鋼針（F.3）を挿入することにより、媒体分配パネル（F）のためのストッパを準備します。それぞれ、各針にゴム管（F.4）を取り付け、ゴムチューブのいずれかに1メジウムビンキャピラリー（C1）を接続します。
  4. 媒体供給ラインの腺（B）を調製するために、 1メディアを接続しますゴムチューブ（B.4）と小さなチューブコネクタ（B.3）への供給毛細管（C2）。別の媒体供給腺のために、この手順を繰り返します。
    1. 媒体排出ラインのための腺を準備する代わりに、より長い媒体排出キャピラリ（W1）を使用し、上記の手順を実行します（ 図1中）（Bを比較）。
      注：入口ラベルを付け、適切なアセンブリを支援するために、テープの異なる色でコンセントに便利です。
  5. ゴムチューブ（C.1）にステンレス製の針（C.2）をロックして、針の先端が他の外の4センチメートルに達していることを確認してください2長いルアーを挿入することにより、ヘッドスペースガス交換パネル（C）用の部品を組み立てチューブの端。ポリマー接着剤（C. 8）でチューブを記入し、少なくとも6時間の組立乾燥させます。
    1. 緩く綿（C.4）を持つ2つのルアーロックのガラスシリンジ（C.3）を記入してください。
    2. 別に2ブチル摩擦を準備BERストッパー（C.5）、ステンレス鋼針（C.7）が挿入されたステンレス鋼針を有するもの（C.6）およびその他。まだ、ガラスシリンジに接続しないでください。
  6. 培地ボトルやガスパック（GP）に沿って、後で使用するために綿（E.9）を充填したガラスシリンジ（E.8）を準備します。
  7. ガスパックのバルブの上にゴムチューブ（gp.1）を接続することにより、10 Lガスパック（GP）のための機器を組み立てます。ゴムチューブの自由端にチューブコネクタ（gp.2）を挿入します。第10 Lガスパックについて、この手順を繰り返します。

柱と機器の4滅菌

注：材料特性に応じて、装置は、次の3つの方法のいずれかにより滅菌されます。

  1. 乾燥オーブン（4.25時間、180℃）でガラス製の器具を滅菌します。
    1. メディアを作成するための機器を滅菌する（参照表1とセクション1.2）を別々に事前インチしたがって、2×5Lのガラス瓶を準備し、アルミホイルで開口し、ボトルネックを覆います。耐熱容器にパック4×5ミリリットル及び5×2ミリリットルのガラスピペットおよびすべての機器をオーブンで滅菌します。
    2. 第二のステップで設定した列のための機器を滅菌します。アルミホイルでとそれに対応するブチルゴム栓が削除されていることを確認してください-ガラスシリンジ（ セクション3で調製し F.1; E.8 C.3）をラップします。
    3. ガラスビーカーにガラスビーズ（A.2）を配置し、アルミホイルでトップをカバーしています。また、アルミホイルで4×大きなチューブコネクタ（B.2）と3ウェイコネクタ（G.7）、透明なガラス板（A.4）をカバーし、すべてのものをオーブンで滅菌します。
  2. オートクレーブ（120°C、10バール、20分）によりオートクレーブ可能なプラスチックや液体を殺菌：
    1. 最初のステップ、STEでNaHCO 3 -buffer溶液と5Lのガラス瓶2ブチルゴム栓、媒体とWiddelフラスコをrilize。
      注：ブチルゴム栓が最初に超純水で3回煮沸することにより調製し、次いでアルミホイルで覆い、水のビットを有するガラスビーカーにオートクレーブ処理されます。湿ったストッパーは、ガラス瓶に挿入するのが容易です。
    2. 第二のステップで設定した実験の列のための機器を滅菌します。上部開口部を包む、オートクレーブ内で滅菌するためのカラムを作製するために、媒体供給口、メディア排出口、及びヘッドスペースはオートクレーブ前アルミ箔でベント。
    3. 適切なプラスチックキャップ（D.'6）でサンプリングポート（D.'5）をカバーし、オートクレーブの前にクランプ（D.4）を取り外してください。
    4. E.2（ブチルゴム栓と培地と放電ボトルに対応する毛細血管を包み、2×G.2 -準備In個のセクション3）、ガラスシリンジ用の小さいストッパー（X C.5 2; E.'10 '; F.'2 - セクション3で調製した）と媒体供給及び排出腺に接続された毛細血管（S2; W1 -アルミホイルにセクション3.4）で調製し、オートクレーブ内のすべての機器を滅菌します。
    5. 滅菌後、さらに4時間60℃のオーブン中で滅菌カラムおよび装置を乾燥させます。
  3. ポンプチューブ（PT）は、オートクレーブではないので、エタノール（EtOH）中溶液（80％エタノール、20％水）でそれらを滅菌します。エタノール溶液を用いて適切なビーカーを記入し、その中にポンプチューブを配置し、チューブが完全にエタノール溶液で満たされていることを保証します。 3時間後に取り出し、予め滅菌アルミ箔（オーブン滅菌）に直接ラップし、室温で2時間乾燥させてください。

柱と機器の5組立

  1. 平らな表面上でのカラム（A）を配置し、実験室スタンドとクランプで安定化させます。無菌条件下で動作することを確認します（ 例えば 、ブンゼンバーナーの40センチメートル内または層流フードの下）。慎重に上部開口部からアルミホイルを除去し、滅菌ガラスビーズ（A.2）に記入。
    1. それは列と接触する領域に内面にポリマー接着剤（A.5）を適用することによって密閉する ​​ために列を時計皿（A.4）を準備します。軽くしっかりと一緒に両方の部品を接着するために、列の上部に代わりに時計皿を押してください。インストールが乾燥するために少なくとも6時間を許可します。
      注：容易に実験後時計皿を除去するために、カラムの縁と時計皿の間に無菌の、微細な柔軟なワイヤを配置することが可能です。
  2. 無菌条件下での作業中の列に次の部品を取り付けます：
    1. ゴムチューブ（B.1）と媒体供給及び排出ベントに対応するチューブコネクタ（B.2）を接続します （ 図1の（B）を比較）。
    2. 列に対応するコネクタに（ セクション3.4で調製した）媒体供給用の腺（B.3）のチューブコネクタを接続し、放電（ 図1の（B）を比較）。
    3. ヘッドスペースガス交換パネルを取り付けます（ 図1の（C）を比較- セクション3.5で調製した）ヘッドスペースには、列のベントと対応するステンレス製の針（C.2）とインサートにガラスシリンジ（C.3）を接続適切なブチルゴム栓（C.6; C.7 - セクション3.5.2で調製した）綿充填ガラス注射器に（C.3）。
  3. 放電ボトル用ブチルゴム栓を挿入し（2×G.20; - 2滅菌3リットルのガラスびん（G.1）にセクション3.2）で調製し、 そして、3ウェイコネクタ（G.7）にボトル（G.6）のチューブコネクタを接続します。
  4. ポンプチューブ（PT）と放電ボトルキャピラリー（W2）の自由端に媒体排出腺キャピラリー（W1）の自由端を接続します。第2の媒体排出腺キャピラリと第2の放電ボトルについて、この手順を繰り返します。
  5. ポンプチューブ（PT）と媒体供給腺キャピラリー（S2）の自由端に1メジウムビンキャピラリー（S1）の自由端を接続します。第2の媒体ボトル毛細管と第2の媒体供給腺キャピラリーについて、この手順を繰り返します。
  6. 媒体のガラスシリンジに-対応する毛細血管（ セクション3.3で調製したF.2）でストッパーを挿入することにより培地配電盤を組み立てます配電盤（F.1）。
  7. 培地ボトル用のブチルゴム栓のコネクタにメディア配信パネルを接続します（E.7 - 図1にFを比較）。
  8. ステンレス製の針をロックルアーにヘッドスペースガス交換パネルにN 2 / CO 2ガスラインを接続します（ 図1中の位置（LLF）を参照）、および低圧力でN 2 / CO 2を用いたカラムのインストールおよびキャピラリーシステムをフラッシュ（<10ミリバール）。メジウムビンキャピラリー（E.3）、3ウェイコネクタ（G. 7）、およびサンプリングポート（D.5）の開放端部でガスの流出を維持します。したがって、流出ガスの過圧を通って無菌状態を維持するために、わずかに開いたサンプリングポート（D.6）のキャップを持っていることを確認してください。
    1. 少なくとも20分間、完全なインストールをフラッシュします。
      注：また、outgassiを閉鎖することが可能です適切なゴムチューブと完全なインストールをフラッシュの効率性を高めるために、クランプとヘッドスペースガス交換パネルのngの針（C.6）。
  9. 一方、N 2 / CO 2（V / V、90/10）で10 Lガスバッグ（GP）を満たす、（真空ポンプを使用して）充填し、脱気を10回以下のバッグを確実にするボリューム全体が完全に無酸素であります。最終充填後ガスパックのバルブを閉じていることを確認します。第二のガスパックで、この手順を繰り返しますが、脱気した後、バルブを閉じて（ すなわち 、空のままにします）。
    注：N 2 / CO 2ガス充填パックは、ポンプで起因メディア損失に増加ヘッドスペース量を補償するために培地ボトルに接続されます。 N 2 / CO 2はフラッシュが、空のガスパックは、後にガスが原因で液体の吐出量を増加させることにヘッドスペースをエスケープすることを可能にするために、放電ボトルに接続されます。
  10. 挿入トンコットン（ - セクション3.6で調製したE. 8）を充填した滅菌ガラスシリンジに-彼は（ セクション3.2.3で製造しE.10）ゴム栓ブチル。
  11. 、次の培地ボトル（E.2）のストッパーに実験台に- （ セクション1で調製E）充填して閉じた培地ボトルを置きます そして、次の手順を使用して、培地ボトルに栓を接続するための準備：
    1. ホースクランプに対応するゴムチューブ（E.5）を閉じることによって、キャピラリー（E.3）にN 2 / CO 2ガスの流れを閉じます。
    2. 軽く培地ボトルオフブチルゴム栓を持ち上げて、ボトルネックに曲がって、長い金属針（1ミリメートル×140ミリメートル）で滅菌し、綿-filled注射器をぶら下げすることにより、N 2 / CO 2（50ミリバール）でヘッドスペースをフラッシュ培地瓶の（フンゲート＆メイシー17を比較）。
    3. すばやく培地瓶からブチルゴム栓を除去し、培地瓶（E）に準備されたブチルゴム栓（E.2）を挿入します。
    4. 使い捨ての針に（以前にヘッドスペースをフラッシュするために使用される）注射器の長い金属針を変更します（0.9ミリメートル×45ミリメートル、広く利用可能）N 2 / COを含む培地ボトルの上部空間をフラッシュするために、ストッパーにし、注入2。
    5. 培地瓶の栓に接続-ガスシリンジ（ セクション5.10で組み立てE.8）の開放端にガスのわずかな流出を持っていることを確認してください。少なくとも4分間、培地瓶（E）のヘッドスペースとガラスシリンジ（E.8）をフラッシュ。
  12. 一方、サンプリングポート（D.'5）のプラスチック製のキャップ（D.6）を締め クランプ（D.4）に対応するゴム管（D.2）を閉じます。
    注意：必要に応じて、開きます針の開放端でのガスの流出を維持するために、再びヘッドスペースガス交換パネルのガス放出針（C.6）。
  13. 実験台に、N 2 / CO 2（ セクション5.9で調製した）を充填した10 Lガスパックを配置します。チューブコネクタは、次の培地ボトルに接続されたガラスシリンジ（E.8）の開放端に位置にあることを確認してください。
  14. 少なくとも4分間培地瓶（E）のヘッドスペースをフラッシュした後、洗浄用シリンジのN 2 / CO 2ガスラインを閉じ、すぐにストッパー（E.2）のうち、注射針を引っ張ります。培地ボトルのヘッドスペース内のガスの残りの過圧は、ガラスシリンジ（E.8）を介してリリースされる予定。
    1. 素早くガスパックのバルブを開き、軽く管とガスパックのコネクタをフラッシュするために、/ CO 2、N 2の流出を維持するために、袋に押してください。
    2. すぐに過度の圧力が培地瓶から解放されると、すぐにガラスシリンジ（E.8）の対応するコネクタにガスパック（gp.3）のコネクタを接続します。
  15. 以前に放電ボトルに接続された3ウェイコネクタ（G.7）の空きポートにN 2 / CO 2（セクション5.9で調製した）で10回フラッシュした空の10 Lガスパック（GP）を接続します。ガスパックのバルブを閉じておくようにしてください。
  16. アウトガス針（C.6）からのガスの流出を維持するために、ヘッドスペースガス交換パネルでN 2 / CO 2ガスライン（<0.1ミリバール）（位置LLF 図1のC）の圧力を軽減します。
  17. ポンプ（P）にポンプチューブ（PT）を挿入し、中瓶（E）の対応するゴムチューブ（E.6）からホースクランプを取り外します。
    1. ガスパック（GP）のバルブを開き、放電ボトルは流出媒体でいっぱいにしながら、空気がガスパック中に放出されるように、放電ボトル（G）に接続されています。
  18. 培地でいっぱい（（F）参照）は、ポンプを起動し、メディア配信パネルを監視します。それが反転位置に保持することにより、いっぱいになると、パネル内の残留ガスを除去することを確認します。ガスは、ポンプに接続されている毛細血管を通って放出されます。
  19. それは媒体で満たされた列を監視し、シミュレートするために、10ミリモルのFe（II）/ 2 / Dの垂直束に変換することができ0.45 L /日の適切なポンピング速度にポンプを調整関心対象の化学的フラックス。
  20. 2センチメートルカラムの上端よりも上方に光源（L）をインストールして 、カラムの上部から放射からの光を防止するために、暗いテープおよび/ ​​またはアルミホイルで列の周りの上部10センチをカバーし、カラムの下部を照らします。全体を覆います外部光源からの列の照明を防止するために、暗い織物カバーを使用してインストール。

コラムへの細菌の6接種

注：非生物対照実験のために、このステップはスキップされます。

  1. 細胞培養は、直接カラムの側面に沿って主サンプリングポートのブチルゴム栓を通してカラムに注入されるので、塔本体の中心に到達するために十分な長さの針で6注射器を準備しているようにしてください。
  2. エタノール溶液（80％）を用いたカラム（A.3）で6つの主要なサンプリングポートのブチルゴム栓の外側を滅菌します。
  3. 接種の準備のための培養と血清ボトルを持っている（セクション2で調製）およびEtOH溶液を数滴を燃えることにより、ブチルゴム栓を滅菌します。培養物のアリコートを取る前に、無菌のN 2 / CO 2と注射器をフラッシュします。 O 1ミリリットルを取ります無酸素細胞溶液Fとメインサンプリングポート（A.3）のブチルゴム栓を通してカラムの中心にそれを注入します。
    注：細菌の増殖に応じて、ポンピング速度を調整する（あるいはポンプを停止）する必要があるかもしれない細胞の成長と発展のためのラグフェーズの最初の日の間に洗い流されるの培養を防止します。

7 。サンプリング

注：カラム内部開発化学勾配を横切ってサンプルを収集するためには、ボリュームの損失が発生するように、より深いポートの前上部サンプリングポートからのサンプリングを開始することが必要です。 （ブンゼンバーナー40 cm以内、または層流フードの下で働くことによって、例えば ）無菌状態を維持することを確認します。

  1. 最初のサンプルを接種後24時間を収集します。 SAへの酸素注入を回避するために、2 / CO 2滅菌Nでサンプリングするために使用されるシリンジをフラッシュmplingポート（D）。サンプリングの前に/ CO 2、N 2と注射器を記入してください。
  2. 迅速にプラスチックキャップ（D.6）を除去し、チューブコネクタ（D.5）にサンプリングシリンジを挿入します。シリンジとチューブコネクタとの間に小さな隙間を維持します。シリンジからガスを放出し、N 2 / CO 2でチューブコネクタをフラッシュします。
    1. しっかりとチューブコネクタに注射器を接続します。クランプ（D.4）を取り外し、約1ミリリットルのサンプルを取り始めます。
  3. サンプルを描画した後、シリンジを取り外す前に、クランプ（D.4）を添付。そして、サンプリングシリンジを取り外し、しっかりと対応するプラスチックキャップ（D.6）とチューブコネクタ（D.5）を閉じます。
  4. すぐにすべてのポートからのサンプリングのためのステップ7.1から7.3を繰り返します。
  5. サンプルの次のセットごとに24時間を収集します。
    注：異なる時間ステップで追加のサンプルについては、小さなAMを除去する必要があります試料のount（ 例えば 、0.2〜0.4 ml）を、最初にサンプルの前には、サンプリングチューブ内の残留培地を除去し、カラム内から代表的なサンプルを得るために、取ることができます。

分析の8.方法

  1. 酸素定量化：
    注：フロースルー媒体と列のヘッドスペース内の酸素濃度を非侵襲的に定量し、非破壊光学酸素センサと0.5×0.5 cmの（いわゆるオプトード）の酸素感受性蛍光箔のパッチを使用して、に沿って接着シリコン接着剤（A.6）を用いたカラムの内側のガラス壁。これは、酸素感受性箔パッチは信頼できる測定値を得るために鉄種に鈍感であることを確認しました。
    1. 列で使用されているオプトードのための適切な較正パラメータを用いてコンピュータ・ソフトウェアを校正することを確認します。光学式酸素センサーは、特定のセイが付属して対応するPC制御光ファイバー酸素計を用いて測定するイオン。
    2. 測定を開始し、カラムの透明なガラスの壁の内側に接着されている酸素感受性箔に対して直角に酸素計のポリマー光ファイバを保持するように注意してください。
    3. 列全体で一つ一つのO 2測定点の測定を繰り返します。
  2. 鉄（II）、水性サンプルの全Fe分析：
    1. 鉄（II）が急速に中性pHで空気中の酸素によって酸化されるので、1 M HCl溶液で直ちに水のFe（II）の定量のために液体試料を安定化させます。 1の最終試料体積についてミリリットル0.5ミリリットルの2M HClで0.5ミリリットルの液体試料を混ぜます。
    2. 30分間（1 M HCl中の10％重量/体積）ヒドロキシルアミン塩酸塩と1 M HClを安定化試料のアリコートをインキュベートした後、全Feを定量化します。この試薬は、次いで、フェロジンのアッセイによって定量することができるのFe（II）へのすべてのFe（III）を減少させます 21。
    3. マイクロタイタープレートリーダーを用いてフェロジンアッセイを行います。 562ナノメートルの波長で吸光度を測定します。検出可能な鉄（II）と全Fe濃度についての範囲内で基準を持っていることを確認してください。
      注：液体試料中のFe濃度が標準較正を超える場合は、1 M HClで安定化されたサンプルを希釈することが必要です。
    4. 全FeとFe（II）との差でのFe（III）の濃度を計算します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

対照実験

非生物的対照実験（10日）は一貫して低い酸素濃度を示した（O 2 <-profile湧昇水柱全体でのFe（II）に有意な変動には0.15mg / L）。 10日間の媒体貯蔵および440μMまで500μMから全体的な鉄（II）濃度がわずかに減少中の析出物の形成（おそらく鉄（III）（oxyhydr-）酸化物）は、ゴム製の接続を介して、いくつかの酸素の拡散を示しています22;（ 例えば 、E.6 図 1のgp.1）この実験のために、合理的に達成した最低酸素濃度が≤0.15mg / Lであったと敏感な酸素定量化のためにとの検出限界より上の範囲です。 0.03 mg / Lで。 0.1...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

先カンブリア時代海洋における微生物群集はによって規制、またはそれらの活性の結果と支配的な地球化学的条件のように変更されました。 BIFの起源を解釈する際に、研究者は、一般的に堆積学またはBIFの地球化学、 例えば 、Smithら 23およびJohnsonら 24に基づいて、微生物の存在または活性を推測します。古代の環境への地球化学的類似体を持っている現代の環境では、現代の生物の研究でも、貴重なアプローチ、 例えば、クロウら 11とKoeksoy らである。14。第三のアプローチは、先カンブリア紀の海で行われているプロセスをシミュレーション工学研究室のシステム、 例えば、Krepski らに生物を利用している。25。このタイプのアプローチは、特定の仮説を検証し、現代のシステムに存在する可能性のある化学的または生物学的要因を除去するのに有用であるが、ありま...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

マークノードホフは、配管接続部の設計と実装を支援します。エレン・シュトルーヴェが使用される機器を選択して取得するのに役立ちました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Widdelフラスコ(5 L)Ochs110015labor-ochs.de
ガラス瓶(5 L)RotilaboY682.1carlroth.com
ガラスピペット(5 ml)51714labor-ochs.de
0.22 µm ステリトップフィルターユニット (0.22 &マイクロ;m ポリエーテルスルホン膜)MilliporeX337.1carlroth.com
アルミ箔
滅菌ルアーロックガラスシリンジ、綿C681.1carlroth.com
ルアーロックステンレス鋼針(150 mm、1.0 mm ID)201015 labor-ochs.de
NaClSigma433209sigmaaldrich.com
MgSO4Sigma208094sigmaaldrich.com CaCl
2SigmaC4901sigmaaldrich.com
NH4ClΣA9434sigmaaldrich.com
KH2PO4SigmaP5655sigmaaldrich.com
KBrSigmaP3691sigmaaldrich.com
KClSigmaP9541sigmaaldrich.com
ガラスシリンダーY310.1carlroth.com
グラスウール7377.2carlroth.com
ガラスビーズ (ø 0.55 - 0.7 mm)11079105biospec.com
ブチルゴム栓(1.2cm)271024labor-ochs.de
ペトリ皿、ガラス(8.0cm)cm)T939.1 carlroth.com
ポリマー接着剤OTTOSEAL S68adchem.de
光学式酸素センサー箔(酸素分析用、下記参照)– ご要望に応じて –presens.de
ゴムチューブ(35 mm、7 mm ID)770350labor-ochs.de
ルアーロックチューブコネクタ (3.0 mm、ルアーロックオス = LLM)P343.1carlroth.com
ルアーロックチューブコネクタ (3.0 mm、ルアーロックメス= LLF)P335.1carlroth.com
ゴムチューブ (25 mm、内径 0.72 mm)2600185newageindustries.com
ゴムチューブ (50 mm、7 mm ID)770350labor-ochs.de
ルアーロックステンレス鋼針 (150 mm、1.0 mm ID)201015
labor-ochs.de ルアーロックガラスシリンジ (10 ml)C680.1carlroth.com
ルースコットン –
ブチルゴムストッパー(ø 1.75 cm)271050labor-ochs.de
ステンレス鋼針(40 mm、1.0 mm ID)ステリカン4665120bbraun.de
ルアーロックステンレス鋼針(150mm、1.5mm内径)201520labor-ochs.de
位置:C.7
ポリマー接着剤OTTOSEALS68adchem.de
ステンレス鋼針(120mm、0.7mm)ステリカン4665643bbraun.de
ゴムチューブ(40mm、内径0.74mm)2600185newageindustries.com
熱収縮チューブ(35 mm、3 mm ID 収縮)541458 - 62conrad.de
チューブ クランプSTHC-C-500-4tekproducts.com
ルアー ロック チューブ コネクタ (1.0 mm、LLF)P334.1carlroth.com
ルアー ロック プラスチック キャップ (LLM)CT69.1carlroth.com
ガラス ボトル (5 L)RotilaboY682.1carlroth.com
ブチル ゴム ストッパー (GL45)444704labor-ochs.de
ステンレス鋼キャピラリー(300 mm、0.74 mm ID)56736sigmaaldrich.com
ステンレス鋼キャピラリー(50 mm、0.74 mm ID)56737sigmaaldrich.com
シュリンクチューブ(35 mm、3 mm 内径収縮)541458 - 62conrad.de
ゴムチューブ (100 mm, 0.74 mm 内径)2600185newageindustries.com
ルアーロックチューブコネクター (1.0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
ルアーロックガラスシリンジ (10 ml)C680.1carlroth.com
ルースコットン –
ブチルゴムストッパー(ø 1.75 cm)271050
labor-ochs.de ステンレス鋼針(40 mm、0.8 mm ID)ステリカン4657519bbraun.de
ルアーロックガラスシリンジ(5ml)C679.1carlroth.com
ブチルゴム栓(ø 1.75 mm)271050labor-ochs.de
ゴムチューブ(40 mm、0.74 mm ID)2600185newageindustries.com
ガラス瓶(2 L)RotilaboX716.1carlroth.com
ブチルゴムストッパー(GL45用)444704labor-ochs.de
ステンレス製キャピラリー(内径50mm、内径0.74mm)56736sigmaaldrich.com
ゴムチューブ(内径30mm×0.74mm)2600185newageindustries.com
ゴムチューブ(内径100mm×0.74mm)2600185newageindustries.com
ルアーロックチューブコネクター(1.0mm、LLF)P334.1carlroth.com
ルアーロック3ウェイコネクタ(LLF、2x LLM)6134cadenceinc.com
光源SI-P8V151DB1US
samsung.com 蠕動ポンプIsmatecEW-78017-35coleparmer.com
ポンプチューブ(0.89 mm ID)EW-97628-26coleparmer.com
ステンレス鋼キャピラリー (200 mm、0.74 mm ID)56736sigmaaldrich.com
ステンレス鋼キャピラリー (400 mm、0.74 mm ID)56737sigmaaldrich.com
Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) ガスパック (10 L)30240-Usigmaaldrich.com
ゴムチューブ (30 mm、6 mm ID)770300labor-ochs.de
ルアーロックチューブコネクター (3.0 mm, LLM)P343.1carlroth.com
ルアーロックチューブコネクター (3.0 mm, LLF)P335.1carlroth.com
ガスタイトシリンジ (20 ml)C681.1carlroth.com
ブンゼンバーナー–
酸素定量用光ファイバー酸素計PresensTR-FB-10-01presens.de
真空ポンプ–
酸素オプトード用シリコーン接着剤PresensPS1presens.de
サムスン

参考文献

  1. Lyons, T. W., Reinhard, C. T., Planavsky, N. J. The rise of oxygen in Earth's early ocean and atmosphere. Nature. 506 (7488), 307-315 (2014).
  2. Raymond, J., Blankenship, R. E. The origin of the oxygen-evolving complex. Coord. Chem. Rev. 252 (3-4), 377-383 (2008).
  3. Kendall, B., Reinhard, C. T., Lyons, T., Kaufman, A. J., Poulton, S. W., Anbar, A. D. Pervasive oxygenation along late Archaean ocean margins. Nature Geosci. 3 (9), 647-652 (2010).
  4. Olson, S. L., Kump, L. R., Kasting, J. F. Quantifying the areal extent and dissolved oxygen concentrations of Archean oxygen oases. Chem. Geol. 362 (1), 35-43 (2013).
  5. Satkoski, A. M., Beukes, N. J., Li, W., Beard, B. L., Johnson, C. M. A redox-stratified ocean 3.2 billion years ago. Earth Planet. Sci. Lett. 430 (1), 43-53 (2015).
  6. Holland, H. D. Oceans - Possible Source of Iron in Iron-Formations. Econ. Geol. 68 (7), 1169-1172 (1973).
  7. Holland, H. D., Lazar, B., Mccaffrey, M. Evolution of the Atmosphere and Oceans. Nature. 320 (6057), 27-33 (1986).
  8. Klein, C., Beukes, N. J. Time distribution, stratigraphy, and sedimentologic setting, and geochemistry of Precambrian iron-formations. The Proterozoic Biosphere. Schopf, J. W., Klein, C. , Cambridge University Press. 139-146 (1992).
  9. Poulton, S. W., Canfield, D. E. Ferruginous Conditions: A Dominant Feature of the Ocean through Earth's History. Elements. 7 (2), 107-112 (2011).
  10. Busigny, V., et al. Iron isotopes in an Archean ocean analogue. Geochim. Cosmochim. Acta. 133, 443-462 (2014).
  11. Crowe, S. A., et al. Photoferrotrophs thrive in an Archean Ocean analogue. PNAS. 105 (41), 15938-15943 (2008).
  12. Jones, C., et al. Biogeochemistry of manganese in ferruginous Lake Matano, Indonesia. Biogeosciences. 8 (10), 2977-2991 (2011).
  13. Lliros, M., et al. Pelagic photoferrotrophy and iron cycling in a modern ferruginous basin. Sci. Rep. 5 (13803), (2015).
  14. Koeksoy, E., Halama, M., Konhauser, K. O., Kappler, A. Using modern ferruginous habitats to interpret Precambrian banded iron formation deposition. Int. J. Astrobiol. , 1-13 (2015).
  15. Canfield, D. E. A new model for Proterozoic ocean chemistry. Nature. 396 (6710), 450-453 (1998).
  16. Wu, W. F., et al. Characterization of the physiology and cell-mineral interactions of the marine anoxygenic phototrophic Fe(II) oxidizer Rhodovulum iodosum - implications for Precambrian Fe(II) oxidation. FEMS Microbiol. Ecol. 88 (3), 503-515 (2014).
  17. Hungate, R. E., Macy, J. The Roll-Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes. Bull. Ecol. Res. Comm. 17 (1), 123-126 (1973).
  18. Van Baalen, C. Studies on marine blue-green algae. Bot. mar. 4 (1-2), 129-139 (1962).
  19. Sakamoto, T., Bryant, D. A. Growth at low temperature causes nitrogen limitation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Arch. Microbiol. 169 (1), 10-19 (1998).
  20. Swanner, E. D., Mloszewska, A. M., Cirpka, O. A., Schoenberg, R., Konhauser, K. O., Kappler, A. Modulation of oxygen production in Archaean oceans by episodes of Fe(II) toxicity. Nature Geosci. 8 (2), 126-130 (2015).
  21. Stookey, L. L. Ferrozine - a New Spectrophotometric Reagent for Iron. Anal. Chem. 42 (7), 779-784 (1970).
  22. Fitch, M. W., Koros, W. J., Nolen, R. L., Carnes, J. R. Permeation of Several Gases through Elastomers, with Emphasis on the Deuterium Hydrogen Pair. J. Appl. Polym. Sci. 47 (6), 1033-1046 (1993).
  23. Smith, A. J. B., Beukes, N. J., Gutzmer, J. The Composition and Depositional Environments of Mesoarchean Iron Formations of the West Rand Group of the Witwatersrand Supergroup, South Africa. Econ. Geol. 108 (1), 111-134 (2013).
  24. Johnson, C. M., Beard, B. L., Klein, C., Beukes, N. J., Roden, E. E. Iron isotopes constrain biologic and abiologic processes in banded iron formation genesis. Geochim. Cosmochim. Acta. 72 (1), 151-169 (2008).
  25. Krepski, S. T., Emerson, D., Hredzak-Showalter, P. L., Luther, G. W., Chan, C. S. Morphology of biogenic iron oxides records microbial physiology and environmental conditions: toward interpreting iron microfossils. Geobiology. 11 (5), 457-471 (2013).
  26. Posth, N. R., Konhauser, K. O., Kappler, A. Microbiological processes in banded iron formation deposition. Sedimentology. 60 (7), 1733-1754 (2013).
  27. Maliva, R. G., Knoll, A. H., Simonson, B. M. Secular change in the Precambrian silica cycle: Insights from chert petrology. Geol. Soc. Am. Bull. 117 (7-8), 835-845 (2005).
  28. Kappler, A., Pasquero, C., Konhauser, K. O., Newman, D. K. Deposition of banded iron formations by anoxygenic phototrophic Fe(II)-oxidizing bacteria. Geology. 33 (11), 865-868 (2005).
  29. Krepski, S. T., Hanson, T. E., Chan, C. S. Isolation and characterization of a novel biomineral stalk-forming iron-oxidizing bacterium from a circumneutral groundwater seep. Environ. Microbiol. 14 (7), 1671-1680 (2012).
  30. Czaja, A. D., Johnson, C. M., Beard, B. L., Roden, E. E., Li, W. Q., Moorbath, S. Biological Fe oxidation controlled deposition of banded iron formation in the ca. 3770 Ma Isua Supracrustal Belt (West Greenland). Earth. Planet. Sci. Lett. 363 (1), 192-203 (2013).
  31. Melton, E. D., Schmidt, C., Kappler, A. Microbial iron(II) oxidation in littoral freshwater lake sediment: the potential for competition between phototrophic vs. nitrate-reducing iron(II)-oxidizers. Front. Microbiol. 3 (197), 1-12 (2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

鉄(II)酸化シアノバクテリア増殖縞状鉄鉱層フロースルーカラムガラスビーズマトリックス溶存酸素検出無酸素条件Fe(II)フラックス光勾配
光合成細菌の増殖を探検する鉄（II）リッチ先カンブリア時代マリン湧昇システムの実験室でのシミュレーション
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。