ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

Summary

人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 ⁺ CD34 ^-周皮細胞およびCD34 ⁺ CD146 ^-外膜細胞、ヒト心筋から。

Abstract

多能性間葉系幹細胞/間質細胞(MSC)は、従来、その可塑性接着により一次組織消化物から単離されていましたが、解剖学的組織の位置は不明のままでした。私たちのグループや他の研究者による複数の組織における血管周囲細胞による定義された血管周囲およびMSC細胞マーカーの発現の最近の発見は、多能性血管周囲前駆細胞の特定の均質な亜集団を前向きに単離および精製する機会を提供しました。私たちはこれまでに、ヒト骨格筋から微小血管CD146⁺CD34^-周皮細胞および血管CD34⁺CD146^-外来細胞を精製するための蛍光活性化細胞選別(FACS)の使用を実証しました。ここでは、ポジティブおよびネガティブ選択のための細胞表面マーカーの定義されたセットの発現に基づいて、FACSによってヒト心筋からこれら2つの血管周囲細胞サブセットを同時に単離する方法を説明する。したがって、この方法は、基礎研究および/または治療研究で使用するために、多能性心MSC様前駆細胞の2つの特定の亜集団を利用可能にします。

Introduction

心臓は長い有糸分裂後の臓器と考えられてきました。しかし、最近の研究では、成人の心臓¹で制限された心筋細胞のターンオーバーの存在を実証しました。心筋細胞の分化能を持つネイティブ幹/前駆細胞はまた、cardiosphere形成、SCA-1 ^+、c-キット⁺を含め、大人の齧歯動物と人間の心の中に心筋内で同定され、そして最近でてきた、血管周囲の前駆細胞^2,3。これらの細胞は、細胞移植またはインサイチュ増殖の刺激を介して心臓の修復/再生を増強することを目的とした治療のための魅力的な候補を表します。

間葉系幹/間質細胞（MSC）は、MSCの治療適用の^4,5臨床試験は、心血管修復^6、移植片対宿主病⁷のような複数の病理学的条件のために行われているほとんどすべてのヒト組織から単離されています、および肝硬変^8。有益な効果は、へのMSCの能力に起因している：炎症⁹のサイトへの家。異なる細胞型¹⁰に分化。プロ修復分子^11を分泌^します 。そして、宿主免疫応答^12を調節^します 。 MSCの単離は、伝統的に、プラスチック基板への優先的な遵守に依存してきました。しかし、得られ....

Protocol

人間の心臓のサンプルの1処理

1. すべての流体、コンテナ、機器、および専用の操作領域が無菌であることを確認してください。
2. 20％ウシ胎児血清（FBS）、氷上で1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を含む冷却したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）から成る記憶媒体（組織バンクまたは外科チームによって調達）心臓組織試料を置き輸送^3。
3. 記憶媒体からの心臓サンプルを除去し、2％FBSおよび1％P / Sを補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）からなる洗浄媒体で洗浄します。サンプルを取り扱う際は、大型船や心膜を把握し、心筋の破砕最小限にするために、微細な先端鉗子を使用します。
4. ペトリ皿の中で洗浄媒体にサンプルを沈めると^3に記載^{されている}よう^に滅菌アイリスはさみや先の細いピンセットで心膜、心内膜および大血管を削除します。
5. 残りmyocaをカット片面カミソリの刃や鋭いアイリスハサミを用いて約1ミリメートル³の小片にrdium。注：サンプルは即座に処理されている場合は最高の細胞収量が得られることになります。遅延が避けられない場合、新鮮な記憶媒体で処理された心臓組織の保存（> 1 cm ³の組織あたり5ml）で最大72時間、4℃でしかし、おそらく細胞収率の関連する低下と、可能です。

Results

単一細胞は、前方および側方散乱分布に基づいて破片や二重から区別されました。生細胞は、DAPI染料を取るために彼らの失敗によって同定しました。ゲーティング戦略はこのライブ、全心筋細胞解離（ 図1）のアイソタイプ対照用標識に基づいて選択されました。生きた細胞から、CD45 ⁺細胞が最初にCD56 ⁺細胞に続いて、ゲートアウトしました。分数^- CD144 ⁺内皮細胞は、その後CD56から除去しました。周皮細胞およびCD146 ^{- -}この最後の集団、CD146 ⁺ / CD34から/ CD34 ⁺外膜細胞（ 図2）を選択し、続いて回収しました。すぐに細胞採取後、各亜集団（500〜1,000細胞）の少量の試料は、最初のソートに記録されている細胞分布があったことを確認するためにソーターを介して再実行しました。 FACS精製した心筋のperic .......

Discussion

増加する証拠は、損傷後の成人の心臓の限られた再生能力をサポートしています。傷ついた心の中で、このような回生応答を担当するネイティブ前駆細胞の同定および特徴付けは、関連機構とシグナル伝達経路の理解と治療的にこれらの細胞を利用するアプローチの開発の両方のために重要です。

以前のプロトコルでは、ヒト骨格筋²⁵から血管周囲の前駆細胞サブセットの単離を記載しています。しかしながら、心臓組織へのこれらの技術の直接的な適用は、しばしば非常に乏しい細胞収量をもたらします。その結果、我々は人間の心筋生検からの血管周囲の前駆細胞、すなわち、周皮細胞および外膜細胞、の2つの別個の亜集団を豊かにし、両方のサブセットの同時精製を容易にするために、プロトコルへの主要な調整を行いました。 sの両方の細胞集団の単離雨のサンプルだけでなく、貴重な心臓組織生検の使用を最適化するだけでなく、明確な血管周囲細胞サブセットの直接比較を可能にします。

セルの最大収率を得るために、組織サンプルの鮮度は、極めて重要です。周皮細胞および外膜細胞のための最.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbCの反マウスのビーズのキット	の分子調査	A-10344
コラゲナーゼI	Gibco	17100-017	必要として粉を再構成し、ろ過殺菌
コラゲナーゼII	Gibco	17101-015
コラゲナーゼIV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	無菌を保つ
抗ヒト CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	無菌の抗
ヒト CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	無菌
の抗ヒト CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	無菌
の抗ヒト CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	無菌の
EGM2-BulletKit	ロンザ	CC-3162
DMEM、高グルコース、ピルビン酸ナトリウムを含まないGlutaMAX	ThermoFischer Scientific	10566-016
ウシ胎児血清	ThermoFischer Scientific	10500-064	アリコートで凍結し、無菌に保つ
ゼラチン	シグマ Aldrich	G1393	滅菌水で希釈
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	無菌状態を保つ
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	無菌状態を保つ
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	無菌状態を保つ
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	無菌状態を保つ
IgG1k-647	AbD セロテック	MCA1209A647	無菌状態を保つ
マウス血清	Σ Aldrich	M5905	Keep滅菌パラ
フィンフィルム - パラフィルム M	シグマ アルドリッチ	P7793
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15979-063	アリコートで凍結し、無菌の
リン酸塩緩衝生理食塩水 pH 7.4	サーモフィッシャーサイエンティフィ	10010-023	無菌
赤血球溶解バッファー ハイブリマックス	シグマ アルドリッチ	R7757	無菌
トリパンを維持Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		蛍光活性化セルソーター