この原稿では、細菌の転写を標的とする抗菌剤の転写と阻害活性を機能的に調べるためのプロトコールについて記載します。
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この記事について
サマリー
要約
インビトロ転写アッセイが開発され、広く転写に関与する分子メカニズムを研究するために長年使用します。このプロセスは、マルチサブユニットのDNA依存性RNAポリメラーゼ（RNAP）遺伝子発現時RNAPの活性を調節するように作用する転写因子のシリーズを必要とします。放射性標識された転写物の配列決定ゲル電気泳動は、それに影響を与えることができる方法の転写が進行するとどのようなパラメータの詳細な機構的情報を提供するために使用されます。本稿では、本質的な伸長因子ヌサは、転写一時停止、ならびにRNAPホロ酵素形成の阻害を介して転写開始をターゲットに抗菌剤を同定する方法を調整する方法を研究するためのプロトコルについて説明します。これらの方法は、まだ不明である転写因子の作用機序を調査するための追加の方法、ならびに新規な抗菌アーガンを開発するためのプラットフォームとして使用することができますtsが、抗生物質の研究開発における遊休薬物標的である転写をターゲットに。
概要
転写は、RNAは、特定のDNA鋳型から合成する処理です。真核細胞では三つの異なるRNAPsありますRNAP私はrRNAの前駆体を転写は、RNAP IIは、mRNAおよび特定小核RNAの合成のために責任がある、と5SのrRNAとtRNAの合成は、RNAP IIIによって行われます。細菌では、RNAのすべてのクラスの転写を担当する唯一のRNAPがあります。開始、伸長および終結：転写の3つの段階があります。転写は、細胞の中で最も高度に調節プロセスの一つです。 転写サイクルの各ステージは、遺伝子発現1の調節のためのチェックポイントを表します。開始のため、RNAPはオープンプロモーター複合体を形成するために、プロモーター2と呼ばれる特定の部位に酵素を誘導するように要求される、ホロ酵素を形成するためにシグマ因子に関連付けるました。続いて、転写因子の大きなスイートは、規制Oを担当しています伸びと終了フェーズ時にf RNAP活動。ここで調べた転写因子は、ヌサ高度に保存された必須タンパク質です。これは、rRNAの合成3-5の間に転写停止および終了、ならびに抗終結の調節に関与しています。
インビトロ転写アッセイでは転写6時の複雑な規制の手順を研究するための強力なツールとして開発されてきました。一般的に、プロモーター領域を含むDNAの線状断片は、転写のテ....
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プロトコル
注意：実験は、放射性同位元素32 Pの使用を含む、すべての適切な安全条件が満たされるまで何も作業が行われるべきではありません。一般職員は、安全コースに参加し、前に放射性試薬を用いた実験に教師の練習を受けることが必要です。反応を行う際に個人用保護機器着用してください（熱ルミネッセンス線量計、安全眼鏡、手袋、放射線室の白衣、完全長ズボンを、靴、つま先を閉じました）。
アッセイ材料の作製
- 転写アッセイに必要なタンパク質を取得します。
- ここで説明する実験では、Eを過剰生産と精製11を説明し、または商業的供給源（物質一覧）から得るように研究室で大腸菌 RNAP。
注：両方とも、同様の結果を提供します。天然または親和性標識RNAPの精製の ための他の方法も12,13を使用することができます。シグマ/ヌサ因子をdとして得ることができます前作14,15に傍接しました。
- ここで説明する実験では、Eを過剰生産と精製11を説明し、または商業的供給源（物質一覧）から得るように研究室で大腸菌 RNAP。
- ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水の調製
注：また、RNaseフリー水は、商業的供給源（材料リスト）から得ることができます。- 精製水1Lに1 mlのジエチルピロカーボネート（DEPC）を追加（0.1％v / v）で、一晩混合します。
- 二回オートクレーブDEPC水とヒント。
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結果
転写効率は、異なる時点でバンドの放射線のレベルを測定することによって決定することができます。ヌサ係数有効ポーズの可視化、終了、および実行オフ製品（ 図1A）の機能をテストするために一時停止アッセイ。 （ヌサNTD、アミノ酸残基1-137）ヌサのN末端ドメインの存在下では、RNA生成物の外観は著しくヌサを欠く対照実験と比較して遅れていました。ヌサフラグメントのアミノ酸残基104から137（ヘリックス3）の欠失、または一連のアミノ酸（残基K36、K37、R104、Q108、K111、Q112、Q116、およびR119）のアラニンへの変更は、完全に生じましたヌサ休止活性の喪失。ヘリックス3残基R104およびK111は、ヌサNTD休止活動のためとR104AとヌサNTDは存在しなかった対照（ 図1B）と同様のポーズ半減期値を与えるK111Aの構築物で必須であることが示されました。そのhouldはヘリックス3の欠失またはこれらの2つのアミノ酸残基の改変は、ヌサがRNAP 15への結合に影響を及ぼ.......
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ディスカッション
全ての生物において、転写は厳密に制御プロセスである。 インビトロ転写アッセイ転写因子、小分子および転写阻害剤の効果を試験するためのプラットフォームを提供するために開発されてきました。この方法の論文では、一般的な細菌の転写のためのアッセイを説明しました。彼らはタイムラインに沿ってすべての転写産物の可視化を可能として転写産物の配列決定ゲル電気泳動と組み合わせた転写アッセイは、機構研究のために非常に重要です。結果として、この方法は、反応条件の小さな変化の影響を識別し、作用のもっともらしいメカニズムを明らかにすることが可能です。さらに、それは、作用の未知の機構を有する転写因子の機能に関連して特定の転写アッセイを設計することが可能となります。
本稿ではまた、RNAP holoenの阻害剤の作用機序を確認する方法を説明しましたザイム形成。ここで説明する方法は、時間の経過とともに各RNA転写産物の変化を表示することができ、適切な修正を加えて必要に応じて、転写の各ステップに対する抗菌薬のテストを有効にすることができます。単一ラウンドのアッセイは、競合/非競合特性として阻害剤のメカ.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品は、ニューカッスル大学（CM）からの教員早期キャリア助成金を認めるものです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 転写アッセイ | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| DEPC処理水 | |||
| ジエチルピロカーボネート(DEPC)の調製 | シグマ・アルドリッチ | D5758 | |
| RNaseフリー水 | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA テンプレート調製 | |||
| ウィザード プラス SV Minipreps DNA精製システム | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCRプライマー | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 蛍光分光計 | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | シグマ・アルドリッチ | U1006 | |
| GTP | シグマ・アルドリッチ | G3776 | |
| CTP | シグマ・アルドリッチ | C9274 | |
| 高純度rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | パーキンエルマー | BLU007C001MC | 放射性化合物 |
| RNAラダー調製 | |||
| Novagen Perfect RNA マーカー テンプレート ミックス 0.1–1 kb | ミリポア | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| 塩化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 塩化マグネシウム | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| ゲル調製 | |||
| Sequi-Gen GT 核酸シーケンシングセル | バイオ・ラッド | 165-3804 | |
| シグマコート | シグマ・アルドリッチ | SL2 | |
| 尿素 | シグマ・アルドリッチ | U6504 | |
| トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン | シグマ・アルドリッチ | ||
| ホウ酸154563 | シグマ・アルドリッチ | B7901 | |
| エチレンジアミン四酢酸 | シグマ・アルドリッチ | ED | |
| 40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド | シグマ・アルドリッチ | A9926 | |
| 過硫酸アンモニウム | シグマ・アルドリッチ | A3678 | |
| N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| 転写アッセイ | |||
| 塩化カリウム | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| グリセロール | シグマ・アルドリッチ | G5516 | |
| リファンピシン | シグマ・アルドリッチ | R3501 | |
| ホルムアミド | シグマ・アルドリッチ | F9037 | |
| ブロモフェノールブルー | シグマ・アルドリッチ | B0126 | |
| キシレンシアノール | シグマ・アルドリッチ | X4126 | |
| ヘパリン | シグマ・アルドリッチ | 84020 | |
| RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤 | Promega | N2511 | |
| 転写バッファー | |||
| トリスベース | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 塩化カリウム | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 塩化マグネシウム | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | シグマ・アルドリッチ | DTT-RO | |
| グリセロール | シグマ・アルドリッチ | G5516 | |
| 濾紙 | |||
| Whatman 3MM Chr クロマトグラフィー ペーパー | フィッシャー サイエンティフィ | 05-714-5 | |
| 放射性除染剤 | |||
| デコン 90 | デコン | デコン90 | |
| ゲル治療 | |||
| 台風 Trio+ イメージャー | GE ヘルスケア ライフ サイエンス | 63-0055-89 |
参考文献
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymer....
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再版と許可
