高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

サマリー

マイクロRNAは、重要な調節的役割を果たし、様々なヒト疾患のための新規治療標的として浮上しています。 miRNAが、高密度リポタンパク質に運ばれることが示されています。私たちは、急速にヒト血漿からのmiRNA解析に適した精製されたHDLを分離するために簡略化された方法を開発しました。

要約

小さなノンコーディングRNA(miRNA)は、メタボリックシンドロームを含むさまざまなヒトの病気に関与しています。それらは、それぞれ診断および予後のバイオマーカーとして利用されるか、または薬物開発の標的として役立つ可能性があります。最近、miRNAはリポタンパク質、特に高密度リポタンパク質(HDL)に運ばれ、レシピエント細胞に送達されて取り込みが行われることが示されています。このことから、miRNAは、遺伝子発現の制御や細胞間コミュニケーション、臓器間のクロストークなど、細胞や臓器の機能に重要かつ極めて重要な役割を果たしている可能性が浮かび上がってきます。精製されたHDLからmiRNAを単離する現在の方法は、小さなサンプルを大規模に利用する場合には実用的ではありません。これは主に、リポタンパク質の単離に使用される時間と手間のかかる方法によるものです。私たちは、miRNA分析に適した精製HDLを血漿サンプルから迅速に分離するための簡易的なアプローチを開発しました。この方法は、健康と疾患におけるmiRNAの役割に関する調査を促進し、特に、HDLに起因するコレステロール逆輸送以外のさまざまな生物学的機能に関する新たな洞察を提供するはずです。また、HDLに存在するmiRNA種は、さまざまな疾患の診断のための臨床バイオマーカーの貴重な情報を提供することができます。

概要

MicroRNAは、高度に保存されており、特定の標的メッセンジャーRNAを分解または抑制することにより、さまざまな生物学的プロセスの調節における主要なプレーヤーと考えられている内因性の非コード微小RNA^種です1。miRNAは細胞内で作用するため、組織由来のバイオマーカーとして研究され、これらのmiRNAの組織特異的な機能の発見につながっています。しかし、miRNAは、タンパク質と関連しているか、細胞外RNaseによる分解からmiRNAを効果的に保護できるエクソソーム/マイクロベシクルにも細胞外に見られます²。より最近の研究では、HDLの保護効果は、コレステロール排出を促進する能力ではなく、特に循環miRNAキャリアとしての非コレステロール貨物と密接に関連している可能性があることが示されています3^、4。これらのmiRNAは、脂質代謝を調節するだけでなく、HDL-miRNA複合体の抗炎症作用、抗酸化作用、抗血栓作用にも関連している可能性があります^5、6。

HDL粒子に含まれるmiRNAの役割をさらに探求するためには、分離された高度に精製されたHDLからのmiRNA抽出のためのシンプルで簡単なプロトコルを確立する必要があります。HDLを単離するための多数の方法が説明されています。これらの方法は非常に時間がかかるか、サンプルのプーリング、単離されたリポタンパク質の脱塩のための広範な透析を必要とする可能性のある大量の血漿を必要とするか、それぞれmiRNAの供給源としてのエキソソームを完全には除去しません³。ここでは、少量の血液サンプルを大規模に使用して、高度に精製されたHDLからmiRNAを分離できるシンプルで迅速な方法について説明します。この方法は、循環するmiRNAの役割、特にさまざまな細胞や臓器間のコミュニケーションを促進するHDLの役割に関する研究を促進するための良い参考になると考えています。

プロトコル

血液試料の1コレクション

1. 肘前窩の著名な静脈の標準的な静脈穿刺によって、（他の抗凝固剤に比べていくつかの利点を持っている）、抗凝固剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する10ミリリットルのプラスチックチューブに末梢静脈血サンプルを断食収集します。
2. 遠心卓上遠心機で4℃で20分間、1,600×gでの血液サンプルは、赤血球及びRNAの少量の遊離血漿を得ました。
3. 順次、それぞれ残りの細胞破片を除去するためにWBCおよび血小板その後さらに15分を除去するために10分間、スイングバケットローター3,000 G（4℃）、上清を集めます。
4. 製造指示に従って、室温で濃度計を用いてプラズマの密度を測定します。
   注：0.9％食塩水（D = 1.023グラム/ ml）の濃度の調整は、エキソソームの除去後で前の密度勾配超遠心分離に必要とされ得ます。

プラズマから2.エキソソームの取り外し

1. HDLと同様の密度を持つ循環エキソソームを削除し、miRNAの³の量的重要な供給源を表します。
   1. 4℃で30分間インキュベートした1ミリリットルプラズマに252μlのエキソソーム沈殿溶液を添加することによってこれを行います。エキソソームをペレット化し、4℃で1500グラムで30分間、混合物を遠心分離。
   2. HDL、密度勾配超遠心分離によるさらなる処理のためにポリカーボネート厚肉超遠心管に得られた上清の転送1 mlで単離する（下記参照）。

3.密度勾配超遠心分離（図1）。

1. HDLを区切るために、それぞれ、448811のx Gと8℃で動作し、固定角ローターで床の超遠心機を用いて3段階のプロセスを使用します。
2. 各単離するための3つの異なる密度のソリューションを順次、新鮮なを準備します。
   1. オートクレーブし、蒸留水1000mlに、0.1グラムEDTA2Naと1ミリリットルの1NのNaOH：11.4グラムのNaCl（0.195モルのNaCl）を溶解することにより溶液A（VLDLの単離、D = 1.006グラム/ミリリットル）を準備します。その後、オートクレーブし、蒸留水の追加の3ミリリットルを追加します。
   2. 100ミリリットルの溶液A（塩化ナトリウム0.195モル、NaBrを2.44モル）に25.2グラムのNaBrを追加することによって、溶液B（LDLの単離、D = 1.182グラム/ミリリットル）を準備します。
   3. A液（塩化ナトリウム0.195モル、NaBrを7.7モル）の100mlで78.8グラムのNaBrを混合して溶液C（HDLの単離、D = 1.470グラム/ミリリットル）を準備します。濃度計を用いて、室温で適切な密度を確認してください。さらに使用するまで4℃ですべてのソリューションをしてください。

VLDLの4.絶縁

1. 血漿の1ミリリットル（平均密度= 1.023グラム/ミリリットル）6.5ミリリットルポリカーボネート厚肉超遠心管で脂肪レッド7Bのヌクレアーゼフリーの200μLを混ぜます。
2. 次いで注意深く混合物の上に溶液Aを5ml層。必要に応じて、溶液AをTの上に付加的な脂肪レッド7Bを追加O各チューブの重量のバランスをとります。 、（減速 - 7） - 2時間（5加速度）のための遠心分離機。
   注：遠心分離中に、リポタンパク質は、それらの平衡密度領域でのバンドとして蓄積されます。
3. ランの終わりに2層を観察します。 4℃でのトップ層とストアを表すVLDL画分の1.5ミリリットルを削除します。
4. 最後に、LDLを含むチューブの底部からピペット転送4 mlで使用し、HDL、LDLの単離のための新たポリカーボネートチューブにアルブミンと脂肪酸画分。

LDLの5分離

1. それぞれ、LDLとHDL画分（セクション4）を含むチューブに溶液B及び100μlのヌクレアーゼ無脂肪レッド7Bの2ミリリットルを混ぜます。
2. その後、3時間（加速9、減速7）のために遠心分離。その後、最上層を表すLDL画分の1.5ミリリットルを除去し、-80℃で4°Cまたは店でおきます。最後に、HDLを含むチューブの底から4ミリリットルを転送新しいポリカーボネートチューブに分画。

HDLの6の単離

1. それぞれ、HDL画分を含むチューブにソリューションC、100μlのヌクレアーゼ無脂肪レッド7Bと98％のβメルカプトエタノール15μlのの2ミリリットルを混ぜます。
2. 3時間（加速9、減速7）のための遠心分離機。その後、最上層を表すHDL画分の2ミリリットルを除去し、-80℃で4℃で維持するか、ストアのいずれか。

7.脱塩およびリポタンパク質画分の濃縮

1. その後のアガロースゲル電気泳動およびPCRとの干渉を回避するために、製造業者の説明書によって記載されるように適切な分子量カットオフ（LDL / HDLためVLDLおよび10K管用3Kチューブ）で遠心分離フィルター装置を用いた密度勾配超遠心分離の間に加え、過剰な塩を除去します。
   1. 簡単に言えば、2.5ミリリットルを添加した後、冷PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMのKCL、8 mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4; pH7.4）にcentrifuGE全体VLDL画分を集め、中密度勾配超遠心分離に4℃でスイングバケットローターを用いて60分間。
   2. 30分ごとに10ミリリットルの氷冷PBSで2回LDL画分を脱塩。次に、HDL画分を脱塩するために二回13ミリリットルの氷冷PBSを使用してください。高いPBSの体積を、アガロースゲル電気泳動で移動度を向上させる必要があります。遠心分離後、リポタンパク質を含有する溶質を除去し、4℃で保持するか、-80℃で保存しました。

8.アガロースゲル電気泳動

1. 次のように製造業者の使用説明書の軽微な変更でキットを使用するリポタンパク質のアガロースゲル電気泳動をPerfrom。
   注：この手順はちょうど濃厚リポタンパクサンプルの品質と純度を評価することです。
   1. 簡潔には、密度勾配超遠心分離を用いて脱塩リポタンパク質画分の6μLを取得し、プレキャストリポタンパク質ゲル上にロードします。人間lipopを使用してくださいサイズ参考としてVLDL、LDLとHDLの基準をrotein。担当準備緩衝液を用いて60分間、100Vで、室温で電気泳動を行います。
   2. 10分間ゲルを乾燥した後、脂肪レッド7BでRTで10分間染色します。メタノール - 水75:25（v / v）の混合物中でゲル脱色し、5分間再度乾燥させます。

9. RNA抽出および精製

1. 血清/血漿中のmiRNAの単離及び精製キットを用いて精製したヒトHDLによりmiRNAの単離をPerfrom。
   1. 簡単に言えば、ボルテックスで混合し、次いで核タンパク質複合体とのRNaseの不活性化の完全な解離を確実にするために、室温で5分間インキュベートし、精製されたHDLの200μlに、RNA溶解試薬の1ミリリットルを追加します。
   2. （; 1.6×10 ⁸コピー/μlのCEL-のmiR-39）の混合物に続いて合成線虫Caenorhabditis elegansのマイクロRNAの3.5μLをスパイク。その後、製造者の指示に従ってRNA抽出を行います。
2. purificatiを実行します製造元の指示に従って溶出スピンカラムを用いて抽出-miRNAの上。 spectrophorometerで精製したHDLからのmiRNAの濃度を測定します。
   注：スピンカラムからのmiRNAの溶出は、RNaseフリー水を16μLを採用しました。

10.逆転写（RT-PCR）

1. HDLからmiRNAの100 ngのを分離する合成miRNA（CEL-のmiR-39）、逆転写キットを用い、製造業者の指示に従って20μlの反応容量中で逆転写でスパイク。
2. テンプレートのmiRNA（NTC）がなく、逆転写酵素ミ​​ックス（NRT）することなく、適切なコントロールを実行します。

11.リアルタイムPCR（QRT-PCR）

1. cDNAの2希釈、10μlのPCRミックス、2μlのユニバーサルプライマー、miRNAのプライマー2μlのと4μlのRNaseフリー水：1の2μlので全量20μlにリアルタイムPCRをPerfrom。
2. Reactiを実行します。15秒、55℃30秒間および30 s.ec 70℃での伸長相は三連で全ての反応をPerfrom 94℃の45サイクル、続いて15分間95℃で、96ウェルプレート中に。
3. 次に、製造者の指示に従って、合成ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した後^、2-ΔΔCt法を用いて、miRNAのCalcuate相対量。

結果

エキソソームを除去した後に高密度リポタンパク質の単離
高度に精製されたHDLからのmiRNAを得るために、miRNA汚染⁷のソースを表すエキソソームを除去する必要があります。これは、市販のキットを用いて密度勾配超遠心分離の前に行われました。実用的な目的のために営利企業が開発した3段階の標準的な密度勾配超遠心分離プロトコルは（ 図1）変更されました。このプロトコルは、54,000 rpmで^{3、8、9、および10}までの遠心力で一般的に使用されるプロトコルよりも大幅に高速である14万回転の速度で固定角ローターで遠心分離を必要とします。で広く利用可能なT-1270ローターを採用します7万回転の最大の力は、遠心分離は、最初に遠心力に耐えることができなかったポリアロマー管を用いて行きました。管の崩壊を回避するために、ポリカーボネート管を首尾よく使用しました。遠心分離時間は、リポタンパク質の酸化および潜在的なmiRNAの劣化

ディスカッション

血液由来の新規バイオマーカーの同定は、様々な疾患の臨床診断および予後に役立ちます。マイクロRNAは、バイオマーカーのすべての資質を有することが知られており、種々の研究^14-17で示されています。本研究では、血漿HDLからのmiRNAを分離するために迅速かつ簡単な簡単な方法を示しました。 VLDL、LDLおよびHDLの分離の従来の密度勾配超遠心分離法は、プラズマの正確なサンプリング、緩衝液の正確な製剤、密度及び下部リポタンパク質画分⁸の定量的な転写の測定に依存します。 HDL ^{8 -11を}単離するために記載されている多数の方法があります。これらの方法は、しばしば非常に面倒であるか、または脱塩単離されたリポタンパク質のための血漿および透析の大容量を必要とし、完全にmiRNAの³のソースとしてエキソソームおよびリポタンパク質を削除しないでください。私たちは、このSIを確立しているこれらの欠点に対処するために、mpleと血漿HDLからのmiRNAの単離の迅速な方法。

重要な目標と本研究の主な目的は、その...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プラスチックバキュテナーラベンダーK2EDTAチューブ	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	366643
遠心分離機	サーモサイエンティフィック、ソーバル・レジェンド X1R
Densito 30PX 濃度計	メトラー・トレド	MT51324450
ExoQuick ソリューション	Invitrogen	4484451
ポリカーボネート厚肉超遠心チューブ	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 超遠心機	Thermo Scientific	46902
ファットレッド 7B	シグマ・アルドリッチ	201618
ベータ;-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 遠心フィルター装置 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra遠心フィルター装置 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo キット	ヘレナ研究所	3344,3544T
は、VLDL、LDLおよびHDLリポトロール用のヒトリポタンパク質標準物質	です。Helena Laboratories	5069
Rep Prep バッファー	ヘレナ研究所	3100
RNeasy MinEluteスピンカラム	Qiagen
NanoDrop 1000 アナライザー	Thermo Scientific
miScript II RT キット	Qiagen	218161
CFX96 Touch リアルタイム PCR 解析システム	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy 血清/血漿スパイクイン制御	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
0.20 µM滅菌シリンジフィルター	SIGMA-ALDRICH	Z227536