栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

Summary

ここでは、Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2の10日間の過剰発現により、マウス胚性線維芽細胞を完全に機能的で安定した栄養膜幹細胞に直接変換するためのプロトコルを紹介します。

Abstract

トロホブラスト幹細胞（のTSC）哺乳類の発生における最初の細胞の運命決定の結果として生じます。彼らは、自己再生および栄養膜系譜のすべてのサブタイプに分化する、胎盤の胎児部分を生じさせる細胞集団を幹の生体内と同等の能力を保持し、in vitroで培養することができます。したがって、のTSCは、in vitroで胚体外細胞運命の決定に対する胎盤の開発および胚を研究するためのユニークなモデルを提供しています。以降、胚盤胞段階から、DNAメチル化とヒストン修飾からなる別個のエピジェネティックな障壁がしっかりと両方の系統を分離します。ここで、我々は完全に過剰発現マウス胚性線維芽細胞における栄養膜重要な調節因子TFAP2C、GATA3、EomesとETS2の一過性のことで、この系統の障壁を克服するためのプロトコルについて説明します。誘導された栄養膜幹細胞は自己再生が可能で、派生トロホブラスト幹細胞を胚盤胞とほぼ同じです私形態学、マーカー遺伝子の発現とメチル化パターンのn項。 in vitroおよびin vivoアッセイにおける機能は、これらの細胞が栄養膜系譜は倍数体栄養膜巨細胞を発生させ、胚盤胞に注入された場合、胎盤をキメラ化に沿って分化することが可能であることを確認してください。体細胞組織からトロホブラスト幹細胞の誘導は、この胚体外系統の遺伝的およびエピジェネティックな特性を研究するための新たな道を開き、それぞれの胚を破壊することなくトロホブラスト幹細胞株を生成する可能性を提供しています。

Introduction

最近、トロホブラスト幹細胞の変換にマウス胚性幹細胞のいくつかのアプローチを比較した研究では、全ての分析システムにおいて、系統変換が不完全のままであることを明らかにしました。代わりに誘導された栄養膜幹細胞（iTSCs）のいわゆる栄養膜幹細胞様細胞は、起源¹の細胞運命のメモリを保持生成されています。ここでは、ITSC世代の異なるアプローチを行いました。マウス胚性線維芽細胞^（MEF）2からの多能性幹細胞の直接誘導と同様に、iTSCsは直接分化した体組織から変換されています。まず、MEFにおける過剰発現された場合、TSCの運命を誘導する12候補因子を同定しました。その後、要因TFAP2C、GATA3、EomesとETS2はITSC誘導³のために必要かつ十分であることが確認されています。同時に、別のグループは、独立して、TFAP2C、GATA3及びEomesがiTSCs中のMEFに変換するのに十分であることがわかりました。しかし、その中で研究は、導入遺伝子発現のために必要な時間がかなり長いETS2に転換カクテル⁴に存在しない場合、別の変換速度を示し、我々の研究と比較されます。

誘導し、胚盤胞由来トロホブラスト幹細胞の培養物を含有する従来のウシ胎児血清（FBS）は、成長不活性化MEFの^5,6によって分泌される因子の存在に依存しています。 ITSC​​誘導時には、これらの要因は、導....

Protocol

すべてのマウス実験は動物保護のドイツの法律に基づいて行われ、地元の機関動物ケア委員会（Landesamt fuerナチュール、UMWELTウントVerbraucherschutz、ノルトラインヴェストファーレン州[承認ID番号の承認と一致した：AZ 84-02.04.2013 .A428]）。

1.メディアの準備

1. ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のFBS、L-グルタミン（2mM）、​​ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）：293T媒体を準備します。
2. MEF培地を調製する：DMEM、10％（v / v）のFBS、L-グルタミン（2mM）、​​1×非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。
3. TS媒体を作製（W / FGF4 /ヘパリンO）：ロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）1640を20％（v / v）のFBS（幹細胞培養グレード）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）、L-グルタミン（2 mMの）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、2-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）。
4. 幹細胞（RPMI 1640、20％（v / v）のFBS：FGF4 /ヘパリン（TS + F4H）とTSの培地を調製培養グレード）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）、L-グルタミン（2mM）、​​ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、....

Results

4Fの導入遺伝子の発現が活性化された皿に、細胞は急速に（ 図2AおよびBを比較）の形態を変更します。一日の周りに14から21の異なる分化転換の領域は（二つの例を図2BおよびCに記載されている）出てきます。これらの一次コロニーは、典型的なTSC形態を欠いています。しかし、彼らはタイトなエッジと善意のTSCの非常に連想させる鮮やかな境界を有するサブ培養し、特徴的な上皮形態現れる（ 図2D）が一度。栄養膜転写用正4F-iTSCs染色はCdx2のとTFAP2C（ 図2E）を要因。これらITSC線は現在、in vitroまたはin vivoで 、後続のために使用することができる、 すなわち 、 インビトロ分化アッセイまたは胎盤キメラ実験を解析します。

Discussion

ここで紹介する4因子（TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2）ベースの分化転換プロトコルは、マウス胚性線維芽細胞から忠実に変換iTSCsを生成するために、信頼性の高い方法を提供しています。さらに、この方法はあるが、胚性線維芽細胞³に比べて効率の低下で、また出生後の尾の線維芽細胞に適用可能です。一般的に、初代線維芽細胞の品質は、分化転換の結果とケアの重要な要因は、初期継代細胞（継代2〜3）を使用するように注意しなければならないです。

このプロトコルの強さは、導入遺伝子発現の時間的制御を可能にドキシサイクリン誘導性ベクターの使用です。これは、導入遺伝子発現のTSC運命の独立を維持し、内因性の転写因子ネットワークを活性化し、安定ITSC株の生成を可能にします。これは、胚性幹細胞からのTSCの運命の誘導を説明する、以前に公開されたプロトコルとは対照的である、方法THAこれまでのtは不完全にしか再プログラミングされた栄養膜幹細胞様細胞^1が得られます。

しかしながら、ここで説明されたプロ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ドキシサイクリンヒクレート	Sigma-Aldrich	D9891-10G	滅菌PBSに溶解し、2mg / mlのストック溶液を調製します。アリコートを-20°Cで保管します。C
クロロキン二リン酸塩	Sigma-Aldrich	C6628-25G	滅菌細胞培養グレードの水で25 mMのストック溶液を調製します。アリコートを-20°Cで保管します。C
ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)	Sigma-Aldrich	107689-10G	滅菌細胞培養グレードの水で8 mg / mlのストック溶液を調製します。アリコートを-20°Cで保管します。C
の人間の組換えの線維芽細胞の成長因子4	ReliaTech	300-131L	はPBSの無菌0.1%BSAで分解し、25を調製し、micro;g / mlストックソリューション。アリコートを-80°Cで保管します。C
ヘパリンナトリウム塩	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	無菌PBSに溶解して1 mg/mlの原液を調製します。アリコートを-80°Cで保管します。C
ProFection 哺乳類トランスフェクションシステム	Promega	E1200
PBS、カルシウム、マグネシウムなし	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640、グルタミンなし	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25300-054
ポリ-L-リジン	Sigma-Aldrich	P4707
ウシ胎児血清	Hyclone	SH30071.03IR
界面活性剤フリーの酢酸セルロースメンブレンフィルター	Corning	431220
非必須アミノ酸	サーモフィッシャーサイエンティフィ	11140-035
ペニシリン ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15140-122
ピルビン酸ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360-039
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25030-24
2-メルカプトエタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31350-010
ジメチルスルホキシド(DMSO)、細胞培養グレード	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
マウスB6。CG-GT(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX マウス	6965
129S2SV	Charles River	129