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方法論記事

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

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DOI:

10.3791/54279

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2016年8月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dipartimento di Scienze Biomediche e Cliniche Luigi Sacco, Università di Milano, 2Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università di Milano-Bicocca

この記事について

サマリー

ラット脳微小血管内皮細胞とアストロサイトの共培養に基づく血液脳関門のin vitroモデルを確立する方法が説明され、検証されています。このシステムは、蛍光分子のトランスバリア透過に対するナノ製剤の影響を研究するための有効なツールであることが証明されました。

要約

脳微小血管内皮細胞は、周皮細胞とアストロサイトの端足によって支えられており、血液脳関門(BBB)を通る大きな水溶性薬物の浸透性が低い原因であり、効果的な薬理学的治療を困難にしています。近年、ブレインターゲティングを促進するためのさまざまな戦略が、BBB全体での薬物送達のための革新的なナノシステムを含む、このサイトでの薬物送達と活性を改善することを目的としています。これに関連して、BBBの簡略化された細胞モデルに基づくin vitroアプローチは、分子のtrans-BBB透過に対するナノ製剤の影響を調査するための有用なツールを提供します。この研究では、共培養された市販の初代ラット脳微小血管内皮細胞とアストロサイトからなる二重層BBBの開発について説明します。また、高分子量デキストランの経内皮電気抵抗と見かけの透過性の測定に基づく、モデルの検証のためのマルチパラメトリックアプローチについても説明します。このBBBモデルを使用して、バリアを越えた蛍光分子の転座に対するさまざまなナノ製剤の影響を研究するための概念実証として、フェリチンナノ粒子にロードされたフルオレセインイソチオシアネート(FITC)の使用について説明します。フェリチンがFITCのtrans-BBB透過を改善する能力は、フラックス測定と共焦点顕微鏡分析によって実証されました。この結果は、これがBBBを介した薬物の送達のためのナノシステムを検証するための有用なシステムであることを示唆しています。

概要

薬理学的治療に対する中枢神経系（CNS）の疾患（ すなわち 、癌、てんかん、うつ病、統合失調症およびHIV関連神経障害）の抵抗は、血液脳関門（BBB）を横切る困難な薬物透過を含む様々な異なるメカニズムによるものです。 BBBは、血液中を循環する物質から脳組織を分離する境界です。この障壁の中で、周皮細胞およびアストロサイトエンドフィートでサポートされている脳微小血管内皮細胞（BMECs）の層が、ダ1 400よりも高い分子量を有するものを水溶性の薬剤に対するBBBの高い選択性に責任があります。他の薬物関連耐性機構は、CNSへの薬物の浸透を減少させ、脳2から自分の押し出しを容易にするために、協働薬物排出トランスポーター（P-糖タンパク質及び多剤耐性タンパク質）のBMECsの存在にリンクされています。

過去十年間で、ナノテクノロジーの手法の多くは、BBB 3-6にわたって薬物を送達するの臨床的および生物学的な課題に応えるために開発されてきました。この文脈では、フェリチンナノスフィア（FNN）は、完全に革新的かつ有望なソリューションを表しています。 FNNは8nmで内径の中空球状構造で配置されている24の自己集合フェリチン（FN）モノマーの12 nmの球体です。フェリチンサブユニットは、酸性pHで分解し、種々の有機分子をカプセル化することができるように、中性のpHをもたらすことにより、形状記憶様式で再構築することができます。したがって、FNNは、多機能性薬物送達システム7,8の開発のための興味深いモデルを表します。また、FNNは、これらの細胞9の管腔側膜上に発現されるトランスフェリン受容体（TfRと）1、の特異的認識にBMECsのおかげと相互作用することができます。

これまで、BBBのin vitroモデルで異なるがオード開発されていますrは、様々な薬物、BBBに向かって毒性、または排出トランスポーターとの分子の相互作用にトランスBBBの透過性を解明します。確かに、これらのモデルは、 インビトロで有効であると考えているin vivo試験に進む前に、活性分子の迅速なスクリーニングのために近づきます。これらのモデルは、動物（ラット、マウス、ブタおよびウシ）またはヒト細胞株10,11,12から得られたBMECsまたは共培養BMECsとアストロサイト（まれ周皮細胞）の単一内皮層、から構成されています。経内皮電気抵抗（TEER）と定義された分子量を有するトレーサーの見かけの透過性（P アプリ ）は、in vitroモデルの品質を決定するために使用される2つの重要なパラメータを表します。ここでは、フルオレセインisothiを内包フェリチンナノケージのトランスBBB透過を研究するためにラットBMECs（RBMECs）およびラット皮質アストロサイト（RCAS）の共培養に基づいて、BBB のin vitroモデルの雇用を記述するocyanate（FITC）。

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プロトコル

1. BBBモデルの確立

注意：BBBモデルを確立するために我々は、市販の一次RBMECsとRCASを使用して示唆しています。すべてのステップは、無菌試薬および消耗品を用いて行わ層流フード内で処理する必要があります。

  1. 細胞培養
    1. ポリ-L-リジンは100μg/ mlで（RTで1時間）、またはフィブロネクチンを50μg/ mlの（37℃で1時間）で被覆細胞培養フラスコは、それぞれ、RCASまたはRBMECsの付着を促進します。そして、5％ウシ胎児血清、1％の内皮細胞増殖サプリメントおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン（SECM）を補充した1×10 6 RCASと内皮細胞培地中で5×10 5 RBMECs、解凍。 10ミリリットルSECMでT75フラスコ中で20ミリリットルSECMとRBMECsでT175フラスコ中の種子RCAS。
      注：解凍し、RCASとRBMECsの播種通路が培養中の細胞密度と時間的に調整されなければならない、BBBモデルを用いて試験する実験条件の数に応じました。スタートにより、1×10 6 RCASと5×10 5 RBMECsの1バイアルの1バイアルでる、20 BBB-ベアリングインサートまで得ることが可能です。
    2. RCASのための約80％コンフルエンスになるまで、37℃、5％、約6日間、加湿大気中のCO 2で細胞を維持し、RBMECsのための90％コンフルエンス。 5分（T75フラスコのための1 mlのトリプシンおよびT175フラスコ用2ミリリットル）のために：トリプシン-EDTA溶液（250トリプシン1）を用いて細胞を切り離します。 SECMでトリプシン活性を停止させる（2：1）、5分間750×gで遠心分離細胞懸濁液を60 mlのSECMにペレットを再懸濁します。
    3. インサート上に播種する前に、別の3日間、SECMの3 T175フラスコや文化にRBMECsを分割します。 Burkerチャンバ内で光学顕微鏡下でトリパンブルーで1：1に希釈した細胞懸濁液を観察することによって、RCAS生体の総数を数えます。
  2. インサート上に細胞播種
    1. 6マルチウェルtransparのポリエチレンテレフタレート（PET）膜の一方の側を治療します100μg/ mlのポリ-L-リジンおよびフィブロネクチンを50μg/ mlのと反対側、と耳鼻咽喉科インサートはRCASとBMECsの結合を可能にします。 PET膜との接触を避けるために、ピンセットで挿入を扱います。
      1. 6ウェルプレートへの挿入を置き、上部チャンバーにフィブロネクチン溶液（最小500μl）を追加します。 37℃でのインキュベーションの1時間後、フィブロネクチン溶液を除去マルチウェルプレートからのインサートを取るとするための無菌のサポートとして、ここで使用される150cm 2のペトリ皿の底に逆さまに置きますすでに被覆インサート。
      2. 優しく（ 図1（a）に示すように 、RCASシーディングと呼ばれる）、インサートの底面側にポリ-L-リジンの800μlを添加し、室温で1時間インサート上で解決策を続けます。
      3. ソリューションを吸引し、インサートは15​​-30分間、室温で乾燥してみましょう。インサートは、現在、細胞播種のために準備ができているだけでなく、いくつかのためのマルチウェルプレートに保存することができますBBBの建設を進める前に4℃で日、。
        注：FD40フラックス測定によりBBBの確立を検証するためのコントロールとして使用されるように、細胞から自由に少なくとも3被覆インサートを維持することを忘れないでください。
    2. シードRCAS挿入（ 図1A）逆さまに細胞懸濁液800μLを滴下することにより、ポリ-L-リジンでコーティングされたインサートの底部側に（35,000 / cm 2で）。膜への細胞の効率的な結合を可能にするために、室温で4時間、インサート上のRCAのサスペンションを残します。
    3. 吸引残留溶液を、2日毎SECMを変え、加湿雰囲気中SECMの2 mlを含有するウェルに挿入物を配置し、37℃でのマルチウェルプレートを維持し、5％CO 2。
    4. RCASは、以下の手順に従って、インサートの上側にインサートの下面、シードRBMECsをコーティングしてきた3日、後：
      1. T175フラスコからRBMECsを外し、カウント総生細胞、ステップ1.1.2および1.1.3で報告されているよう。
      2. アストロサイトのみで3インサートを残しSECM（千μL）（ 図1B）内のインサートの上面にシードRBMECs（60,000 / cm 2）を、TEERの背景として使用されます。標準的な培養条件でマルチウェルプレートを置きます。 2日ごとに、内側と下部チャンバーにSECMを変え、少なくとも3日間培養し、システムを維持します。

2. BBB検証

  1. TEERの測定
    1. 共培養の3日目には、適切なチャンバー内にBBB-ベアリングインサートを挿入することにより、TEERを確認します（つまり、キャップを有しており、チャンバとキャップの両方は、電圧検知および現在の一対の電極含む場合）4が充填されたが、 SECMのミリリットル。上皮組織のボルト/オーム計に接続します。
    2. 一緒に細胞BBB-システムのTEER測定と、RCAS番目の軸受3のインサートのTEER値を記録でBBBsで得られた値から差し引かれます。 ΩX cm 2でその結果を表現するために、インサート（4.2 cm 2）での表面で得られたTEER値を乗算します。
    3. 共培養の3日目からは、毎日TEERを測定します。注：TEERが増える初期期間の後、記録された値は、少なくとも2日間連続して安定したままであるべきである（通常、5 番目との共培養の7日目の間）。その時点でBBBは、検証（セクション2.2）および/またはトランスBBB実験のための第二段階の準備ができています。
      注：2.1節で説明する手順は、以下の透過性実験（セクション3）に専念同じBBB-システム上で実行することができます。無菌条件下で操作してください。
  2. FITCデキストラン40のトランスBBBフラックス（FD40）
    1. 3空のインサート全体のそれと比較BBBモデルの下部チャンバーに上部からFD40フラックスを測定します以下の手順に従って、（セクション1.2.1の注を参照してください）​​：
      1. EMは BBBsの上部コンパートメントに1mg / mlのFD40（SECM中に希釈）を追加し、1の後、2、3時間下室から200μLのSECMを撤回し、分光蛍光光度計により蛍光強度を測定する（λの元 488nmで、λ 515 nmの）5スリット。
      2. 同じ分析パラメータを使用して処女培地500μlを測定fluorescenceby SECMの背景の値を取得します。すべてのFD40の蛍光値からSECMのバックグラウンド蛍光を引きます。
      3. 既知濃度（ すなわち 。0.312、0.625、1.25、2.5μgの/ ml）のSECMを500μlに溶解した蛍光トレーサーので作成した検量線で観察された蛍光値の比較が浸透FD40の量を決定します。
      4. に従って平均フラックス値から見かけの透過係数（P アプリ）を計算します。
        P アプリ = J / AC 、Aは透過面積（cm 2）であり、Cは、上部区画（モル/ cm 3）を、分子の濃度です。
        注：適切なTEER値に達している3つ以上のBBB-システムは、もっぱらこの検証手順に専念しなければならない、と次の浸透性実験（セクション3）のために使用すべきではありません。無菌性は必須ではありません。

3.トランスBBB FITC-ロードフェリチンの浸透（FNN）

注：ヒトフェリチン（FN）の組換え変異体、 大腸菌で産生され、ナノケージで組み立て（FNN）異なる蛍光分子のカプセル化のためには、教授プロスペリ（ミラノビコッカ大学、イタリア）のNanoBioLabから入手可能です。 FNNは、FITCをロードし、以前に記載されたプロトコル13との両方のFnとロードされた分子の濃度に応じて正確にdeterminされていますエド。

  1. FITCのトランスBBBフラックスとFITC-FNN
    1. によると、インキュベーションの7および24時間後の遊離色素のそれと比較して、 - （共培養の7 日目 、通常、5 回目で）検証BBBモデルの下部チャンバーに上部からFITC-FNNのフラックスを測定します次の手順：
      1. FITC-FNN（50μg/ mlのFNN、1.1μMFITC）または各製剤について少なくとも6 BBBシステムの上室に無料のFITCの等しい量は、の下室からSECM溶液2mlを撤回するために追加します7時間後、および24時間後に、他の3のインサートの下室から少なくとも3を挿入。
      2. 蛍光分光計によって収集されたサンプルを500μlの蛍光強度を測定する（λ 元の488nm、λEM 515nmで、スリット5）。
      3. 同じ分析パラメータを用いて、培地500μlを測定することにより、SECMのバックグラウンド蛍光を取得します。 SECMのバックグラウンド蛍光を引きすべてのFITCまたはFITC-FNN蛍光値から。
      4. 500μlのSECMに溶解し、無料またはnanoformulated染料の既知濃度（ すなわち 。6.87、13.75、27.5、55 nM）を用いて生成される2つの異なる検量線を用いて得られた蛍光値を比較することにより、透過FITCまたはFITC-FNNの濃度を決定します。
  2. RBMECsにおけるFITC-FNNローカリゼーション
    1. 、BBBシステムの上部チャンバーからSECMを削除するPBSでインサートを洗浄し、10のための上部コンパートメントに500μlのパラホルムアルデヒド（リン酸緩衝生理食塩水、PBS中4％）を加えることによって、各実験群について少なくとも2つのインサートにRBMECsを修正RTで分。
    2. 残留パラホルムアルデヒドを除去するためにPBSでインサートを3回洗浄します。
      注：この時点から、無菌性は必要ありません。
    3. PET膜の適切な部分をカットして、次の手順に従って細胞のimmunodecorationを進めます。
      1. Permeabi10分間、PBS中0.1％トリトンX-100と平安大町RBMECs。 2％ウシ血清アルブミン（BSA）、PBS中の2％ヤギ血清を含む溶液で、室温で1時間ブロッキング工程を行います。 RTで2時間、1：20希釈で抗フォン・ヴィレブランド因子（VWF）でサンプルをインキュベートします。
      2. PBSで3回洗浄した後、2％BSA、1で適切な二次抗体を含む2％ヤギ血清溶液に、室温で2時間細胞をさらす抗VWRを明らかにするために300希釈、およびDAPI Aで1：核検出のための1500希釈。
    4. 退色防止マウントソリューション（挿入断片につき1滴）を使用して、顕微鏡スライド上に挿入片をマウントし、その後、カバースリップでサンプルを閉じます。 40X倍率、1.5ズーム、1,024×1024ピクセルの解像度で油浸レンズを用いた共焦点顕微鏡によって分析します。

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結果

インサートのBBBモデル、細胞の付着および増殖の確立中にPET膜の透明性のために光学顕微鏡のおかげを使用してモニターすることができます。 35,000細胞/ cm 2の密度で播種RCASは、RT（ 図2A）でのインキュベーションの4時間後に、インサートの底側に効率的に付着し、3日後に膜表面を覆うように成長し、紡錘状の形態をとります（ 図2B）。 60,000細胞/ cm 2の密度で播種RBMECsは、目に見えて37°C（ 図2C）でのインキュベーションの約3時間後のPET膜の上面に取り付けられています。開発RBMEC層があるため、基礎となるRCA層（ 図2D）と重なっている、光学顕微鏡を用いて、次の日にわたって視覚化することは困難です。

Bの正しい検証BBモデルは常にTEE...

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ディスカッション

ここに記載のin vitroの方法は、ナノ粒子とナノ製剤の際に蛍光分子のトランスBBBの配信を研究するための有用な検証アプローチを表します。ここでは、BBBを通過カーゴ分子の転座を研究するための良好な候補を表しFNNを、使用しています。それは、特にBMECsの管腔膜上に発現し、受容体媒介インターナリゼーション経路を使用してナノ粒子の取り込みを媒介するTfR1受容体によって認識されるので、FNNは、薬物/薬剤の経BBB送達のための金ナノベクターが考えられます。また、FNNは、天然のナノ粒子であり、したがって、良好な生体適合性プロフィールを有します。最後に、FNNは、簡単かつ効率的な機構で低次元水溶性分子をカプセル化することができます。有機又は無機ナノ粒子の他の異なるタイプのトランスBBB透過性はまた、ナノ粒子の機能に関するいくつかの考察によれば、このプロトコルを用いて評価することができます。第1のpnanoformulated薬/薬剤の浸透を研究するrerequisiteはボイドナノ粒子の安全性です。もう一つの重要な問題は、PETフィルターで調査したナノ粒子の相互作用です。この態様では、膜の細孔中に有意な保持を排除し、B...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、Assessorato alla Sanità、Regione Lombardia、Sacco Hospital(NanoMeDiaプロジェクト)の研究資金に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ラット脳微小血管内皮細胞 Sprague Dawleyラット脳組織から単離InnoprotP10308
皮質アストロサイトを送達されました InnoprotP10202、2日間のラット脳組織から単離され、1継代で凍結保存され、凍結して配送されました。
内皮細胞培地キットInnoprotP60104ECM (500 ml) と胎児ボビン血清 (25 ml)、内皮細胞増殖サプリメント (5 ml) とペニシリン/ストレプトマイシン (5 ml)。37°Cで暖かい。使用前にCウォーターバスを使用し、フェ
ユーロクローンECM0920DプシンEDTA37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前に
フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン40,000シグマFD40Sは、光
パラホルムアルデヒドから保護します ケミカルフードダル
ベッコのリン酸緩衝生理食塩水、CaおよびMgEuroCloneECB4004L
 X-100SigmaT8787
ウシ血清アルブミン シグマA7906
ヤギ美容液 EuroCloneECS0200D
mouse monoclon-anti-von Willebrand FactorDakoM0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGsThermoFischer ScientificA-11003protect from light
DAPI(4' ,6-diamidino-2-phenylindole) ThermoFischer ScientificD1306、光ProLong
ゴールド退色防止マウンタントThermoFischer ScientificP36934
Poly-L-lysine HydrobromideSigmaP1274溶液は
、ウシ血漿からのフィブロネクチンを数回使用できます シグマF1141同じ解決策は、ポリエチレン
テレフタレート(PET)インサートファルコンF3090透明ポリエチレンテレフタレート(PET)膜を数回使用することができます;表面積:4.2 cm2;細孔サイズ0.4 & マイクロ;m/表面積
T75 Primo TC フラスコEuroCloneET7076
T175 Primo TC フラスコEuroCloneET7181
EVOM2 上皮組織電圧/抵抗計   World Precision Instruments GermanyEVOM2
Endohm- 24SNAP cupWorld Precision Instruments GermanyENDOHM-24SNAP
カメラ付き光/蛍光顕微鏡Leica MicrosystemsDM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module カメラ付き生細胞倒立顕微鏡 
共焦点顕微鏡ライカマイクロシステムズTCS SPE
分光蛍光計JascoFP-8000
されたは、継代1で凍結保存され、凍結はノールレッドなしで光トリから保護します Tritonのシグマ158127希釈液はから保護します 同じ

参考文献

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