方法論記事

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

DOI：

10.3791/54303

⸱

2016年10月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、無傷の胚および出生後の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化するプロトコルを記述します。組織透明化法とホールマウント染色を併用することで、胚性または出生後の心臓内の単一蛍光タンパク質標識細胞を鮮明かつ正確にイメージングすることができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全心臓レベルで単一のクローン追跡および分析は、心臓の開発中に、心臓前駆細胞の挙動および分化を決定し、正常と異常な心臓の形態形成の細胞および分子基盤の研究を可能にすることができます。レトロスペクティブ単一クローン解析の最近の新技術は、実現可能な単一細胞の解像度で心臓の形態形成の研究を行います。しかし、撮像深さ、心臓の組織の不透明性と光散乱は単細胞解像度で妨げる全心臓イメージングを増加させます。これらの障害を克服するために、照明および検出の両方のための透明性の高い心をレンダリングすることができます全胚清算システムが開発されなければなりません。幸いなことに、ここ数年では、このようなCLARITYなどの全生物の決済システム、のSca ル 、SeeDB、ClearT、3DISCO、CUBIC、DBE、BABBとPACTのための多くの方法が報告されています。このラボでは、カードの細胞および分子メカニズムに興味がありますIACの形態形成。最近、我々はROSA26-CreをERT2を経由してトレース単一細胞系統を確立し、ROSA26-紙吹雪システムまばらにラベル細胞に心臓の開発中に。私たちは、心の内の画像の単一クローンにホールマウント染色と組み合わせて胚をクリアするためのSca ルとCUBIC（クリア、遮るもののない脳画像カクテルやコンピュータ解析）を含むいくつかの胚全体-クリアする方法論を適応しました。心臓が正常に単一細胞の解像度で画像化しました。私たちは、SCA ルは、胚の心をクリアすることができることを発見しましたが、組織を効果的に溶解することによって胚の心をCUBICは、生後の心をクリアすることができますが、生後の心をクリアしますが、損害賠償はできません。ここに記載される方法は、順番に、先天性心臓欠陥の細胞および分子基盤を明らかにすることができ、心臓の形態形成、間に単一クローンの解像度での遺伝子機能の研究を可能にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心臓の形態形成は、心臓の別個のセクタに心臓前駆細胞の4つの異なるタイプの時空間組織を必要とし、また、機能的な心1,2を形成するために、このプロセスを調整するために、複数の遺伝子制御ネットワークを必要とするシーケンシャルイベントです。心臓の仕様、分化、パターニング、及びチャンバ成熟は心原性転写因子3によって規制されています。心臓前駆細胞の遺伝的変異またはこれらの因子の転写後収差は、胚性致死または先天性心臓欠陥（CHD）4のいずれかになる可能性があります。心臓の形態形成の研究では、3次元（3D）に固有の構造的な詳細を理解する必要がありますし、心臓の開発中にトレース単一ラベルされた心臓前駆細胞系譜は、心臓の形態形成の理解を促進します。高解像度の部分ベース断層撮影法の数が目に開発されています画像臓器構造5,6に数十年の過去の電子。しかしながら、これらの方法は高価で特殊な機器、広範な労働力を必要とし、最終的な体積再構成された画像7,8における単細胞解像度で詳細な構造組織を欠いています。

単一細胞レベルでの3Dボリュームイメージングは、 生体 7 に前駆細胞の分化および細胞の挙動を研究するための手段を提供します。しかし、組織の光散乱が深く、無傷の心の中の3Dでの細胞や構造を画像化する主要な障害となっています。脂質は、光散乱の主要な供給源であり、脂質および/または脂質およびその周辺地域との間の屈折率差の調整の除去は、組織透明8を高めるための潜在的なアプローチです。過去数年間で、組織のクリア方法の数は、組織の不透明度と光の散乱を低減しており、開発されたBABB（ベンジルアルコール、ベンジルbenzoatなどEの混合物）とDBE（テトラヒドロフラン、ジベンジル）;しかし、これらの方法では、蛍光消光が問題8-10まま。溶媒としては、例えばSeeDB（フルクトース/チオグリセロール）と3DISCO（ジクロロメタン/ジベンジル）などの親水性の方法を、ベースの蛍光シグナルを維持するが、7,8,11透明な臓器全体をレンダリングしません。比較では、CLARITY組織クリア方法は、透明な臓器をレンダリングするが、それはまた、7,13を埋め込むヒドロゲルを必要とする、PACT（パッシブ明確にする技術が）同じように、脂質8,12を除去するために、特殊な電気泳動装置を必要とします。利用可能なすべての組織クリアする方法に関する詳細情報については、 ら 、リチャードソンとリヒトマンの表1を参照してください。7。

2011年に、ハマらは偶然マウス脳と胚transparをレンダリングする親水性混合物」のSca ル 」（尿素、グリセロールおよびTriton X-100混合物）を発見しましたENT完全に標識されたクローン14からの蛍光シグナルを維持しながら。これは、無傷の数ミリメートルの深さで脳や細胞内の解像度でニューロン集団と突起の大規模な再構成の撮像を可能にします。須崎ら。さらにクリア時間を減少させ、リン脂質可溶化を増加し、多色蛍光イメージング8に許可された組織のクリア方法は、アミノアルコールを添加することにより、のSca ルを改善し、「CUBIC」（クリア、遮るもののない脳画像カクテルやコンピュータ解析）を開発しました。本研究では、心臓の間に心の中のSca ルの利点とCUBIC組織決済技術と高解像度の3D光学切片、個々のクローンを取ることはRosa26Cre ERT2 15、R26R-紙ふぶき 16、αMHC-Creを17、cTnTの-のCreを使用して追跡しました18、 NFATC1-Creを 19、とのRosa26-mTmG（mTmG）20マウス系統。ホールマウント染色（WMS）メソッドの組み合わせは、以前に21,22、さらに標識されたクローン中の他のタンパク質の染色のためにと3Dボリュームコンテキストで彼らの行動の研究のために許可された組織のクリア方法とを開発しました。組織のクリア及びWMSの組合せは、心臓の開発中の異なる遺伝子およびタンパク質の役割のよりよい理解を可能にし、先天性心臓欠陥の病因。このプロトコルは、開発中に、他の前駆細胞の分化、細胞の挙動、および臓器形態形成事象を研究するために適用することができます。

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プロトコル

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全ての動物実験は、アルバニー医科大学で制度動物実験委員会（IACUC）によって承認され、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って行いました。

1.ソリューションの準備

注：Rosa26Cre ERT2 15、R26R-紙ふぶき 16、αMHC-Creを17、 とのRosa26-mTmG（mTmG）20マウスのラインが商業的に購入したcTnTの-Creを 18は、アラバマ大学の博士交通からの贈り物だったのNFATc1-Creを 。医学19のアルバートアインシュタイン大学の博士ビン周からの贈り物でした。マウスは、二国間の開胸、断頭または頸椎脱臼により死亡検証の物理的手段に続いて、少なくとも60秒間密閉チャンバーに二酸化炭素吸入によって安楽死させました。

  1. タモキシフェンを準備します。ヒマワリ種子大井の10ミリリットルにタモキシフェン10mgを溶かしリットル。 -20℃で完全に溶解したら、アリコートとストア。
  2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 Na 2 HPO 4（1.41960グラム）、KH 2 PO 4（0.24496グラム）、塩化ナトリウム（8.0669グラム）及び蒸留水1L中のKCl（0.20129グラム）を溶解し、pHを7.4に調整します。
  3. PBSTを調製0.1％のTween-20溶液をPBS中でPBS 100mlのTween-20を100μlの溶解させることによって。
  4. ブロッキングバッファーを準備します。 0.2％のTween-20を含有するPBST 100mlにBSAを3gを溶解し、3％ウシ血清アルブミン（BSA）ブロッキング溶液を作ります。
  5. CUBIC-1（試薬1）を準備します。 25重量％の尿素、25重量％のN、N、N '、N'-テトラキス（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミンとのdH 2 O中15重量％のTriton X-100を混合
  6. CUBIC-2（試薬2）を準備します。 50重量％のショ糖、25重量％の尿素、10重量％の2,2 '、2' 'ミックス- nitrilotriethanolおよび0.1％（Vし/ V）のdH 2 O中のトリトンX-100
  7. Sca ル A2を準備します。4 M尿素、w / vグリセロール10％および0.1％のw / vのトリトンX-10dH 2 O中0 7.7にpHを調整します。
  8. Sca ルの B4を準備しますのdH 2 Oで8 M尿素およびワット/ vのトリトンX-100を0.1％ 8.7にpHを調整します。
  9. 4 M尿素、70％のw / vのグリセロールおよび0.1％W / VトリトンX-100 の dH 2 O中：のSca ル 70を準備します

2.タモキシフェン誘導、胚の単離と固定

  1. タモキシフェン誘導および胚の単離
    1. （R26Cre ERT2雄マウスで塞が）女性R26Cre ERT2紙吹雪マウスは、胚の発達日E7.75 33でタモキシフェンを10μg/ gの湾曲した栄養管を使用して、承認されたプロトコル（ACUP 13から12007）、強制飼養。胎生9.5（E9.5）またはE10.5では、CO 2および頸椎脱臼と雌マウスを安楽死させます。
    2. マウスの死亡確認後（セクション1を参照してください。注）、はさみでマウス腹腔を開き、子宮角を解剖、ハサミやピンセットの助けを借りて卵管層を除去し、再子宮管23,24から胚をリース。
      1. PBS（pHは7.4）を含有するペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡下では、ピンセットの助けを借りて、非胚層（絨毛膜、卵黄嚢と羊膜）を削除。
    3. 以前に22を報告したようにピンセットやハサミを使用して、遺伝子型決定のための雌マウスと胚の尾のサンプルを収集します。プラスチックピペットを用いて、1×PBSの1ミリリットルを含む48ウェルプレートのウェルに各胚を移します。
    4. 蛍光顕微鏡下では、カメラ付き倒立顕微鏡を介して、GFP / RFP / CFP陽性の胚を識別します。ピール離れてピンセットを用いて、心膜とGFP / RFP / CFPフィルターと心の両面上の蛍光クローンの数を決定するために、湾曲したピンセットの助けを借りて心/胚を回転させます。いいえカットは必要ありません。
  2. GFP / RFP / CFP陽性の胚を識別した後、すぐに目で1×PBSで2回（各2分）の胚を洗います室温（RT）でプレートシェーカー上で電子48ウェルプレート。これは、過剰な血液を除去します。
  3. RTで4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用して、胚/胎児心を修正しました。定着時間は、胚の年齢や組織のサイズによって異なります。 E9.5室温で2時間の胚を修正。後期胚の段階の胚でも生後心臓のために24時間まで延長することができ、より長い定着時間を必要とします。
    注意：パラホルムアルデヒドは毒性があり、皮膚、目や粘膜との接触を避けます。
  4. 固定後、室温でプレートシェーカー上で二回（各10分）1×PBSで48ウェルプレートに胚/心を洗います。これは、胚/心臓から過剰PFAを削除します。胚はその後さらにホールマウント染色および組織をクリアするために処理されます。

3.ホールマウント染色

注：次のようにPFA固定後胚/心臓が全体のマウント染色に供されます。

  1. 1メートルを使用して、48ウェルプレートに胚/心を透過性RTでプレートシェーカー上で2時間、0.1％PBSTのリットル。
  2. 透過処理に続いて、4ºCでプレートシェーカー上で2時間または一晩、ブロッキング緩衝液1mlに胚/心を浸します。
  3. 4ºCでプレートシェーカー上で48時間、ブロッキング緩衝液0.3ミリリットルで：（100 1）で希釈し、内皮細胞特異的抗体PECAM（CD31）に胚/心を浸し。
  4. プレートシェーカー上で室温でPBSTを5回、30分ごとを使用して胚/心を洗ってください。これは、組織からの過剰非特異的結合した一次抗体を除去します。
  5. 4ºCでプレートシェーカー上で48時間、ブロッキング緩衝液1ミリリットル中：（千1）で希釈し、アレクサフルオロ647ヤギ抗ラット二次抗体で胚/心を浸します。
  6. 二次抗体を洗浄する手順を繰り返し3.4。
  7. プレートシェーカー上で室温で1時間、4％PFAで胚/心を後固定し、PBSで5分間、それぞれで二回洗浄します。
  8. コンセントでPBSTで希釈した核染色4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（と胚/心を染色RTでプレートシェーカー上で10分間、0.01 mg / mlで）の比。それぞれ5分の2回のPBS洗浄に従ってください。

4.胚/のSCA リットルの eまたはキュービック法とハートのクリア

注：ホールマウント染色した後、胚/心臓がのSca ルまたはCUBIC組織のクリア方法のいずれかに供されます。方法の選択は、組織のサイズおよび胚の年齢に依存します。 E11.5以前の年齢の胚のための、のSCA リットル電子組織のクリア方法を使用して、古い胚または出生後の心のためにCUBIC組織クリア方法が好ましいが。

  1. 規模組織のクリア方法
    1. 時折穏やかに4℃で48時間（手で）振とうしながら（アルミホイルに包んで）シンチレーションバイアル中のSCA リットル電子 A2溶液1mlと胚/心をインキュベートします。
    2. Sca リットル電子のA2のインキュベーションの後、時折穏やかanot振とう同じバイアル中で4℃でのSCA リットル電子B4の溶液1 mLで胚/心をインキュベート彼女の48時間。
    3. 時折穏やかに振とうしながら4℃で1ミリリットルのSCA リットル電子 70と別の48時間胚/心をインキュベートします。 90％グリセロールを使用してマウント胚（セクション5.1を参照）。
  2. CUBIC組織のクリア方法
    1. 全胚/心CUBICクリアするため、時折穏やかに37ºC7で48時間振とうCUBIC-1の1ミリリットル中の各胚/心を浸します。 48時間後、新鮮なCUBIC試薬1の同じ体積で溶液を交換し、時折手で振盪しながら37℃でさらに48時間、サンプルをインキュベートします。
    2. 穏やかに手で振盪しながら室温で1×PBSで数回CUBIC-1処置した心臓/胚を洗ってください。これは、過剰CUBIC-1溶液を除去します。
    3. PBSでCUBIC-1を洗浄した後、時折穏やかに手で振盪しながら37ºCで48時間CUBIC-2溶液（胚/心あたり1グラム）で胚/心を浸します。これは、グリセロールを用いた実装胚/心を次の（第5節参照します0.2）。

5.サンプル取付け・イメージング

注：のSCA リットル電子 70またはCUBIC-2溶液中でクリア胚または器官がそれぞれ、イメージング媒体としてのスケール70とCUBIC-2溶液を用いて直接画像化することができます。しかし、試薬をクリアする胚サンプルの脆弱性を考慮すると、サンプルはすぐに画像化されたが、長期的に保存されていない場合、以下のプロトコルに従って、90％グリセロール中でサンプルを格納。

  1. 直接のSca LEが撮像されるまで4℃で90％グリセロール、店舗の1mlのサンプルをクリア浸します。
  2. 二回1×PBSで5分間ずつCUBIC処理サンプルを洗浄し、順次30分間、30％、50％、70％、90％グリセロール溶液をそれぞれ1 mlのサンプルをインキュベートします。
  3. イメージングのために、2光子機能を備えた共焦点顕微鏡を用いて、90％のグリセロールおよび画像クローンの最小量のガラス底ペトリ皿に試料を移します。
  4. 10X / 0.3 NA、25X / 0.8 NAの浸漬、または40X / 1.2 NA水矯正対物レンズと画像グリセロールで心臓や胚を。サファイアカメレオンレーザー：コヒーレントチタンから2光子励起を用いた画像DAPI。顕微鏡対物レンズの選択は光学シート蛍光顕微鏡を利用することができ、超解像のために、例えば 、実験の目的に依存するであろう。

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結果

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クリア胚の心臓を画像化

脊椎動物の心臓の形成は時空間的に調節形態形成のプロセスであり、4つの異なるソース1からの組織および前駆細胞の分化に依存します。心臓三日月の最初の心臓領域からの細胞は、線形心管を形成するために、腹側正中線に向かって折ります。最初に最初の心臓領域にdorsomediallyに存在する第二の心臓フィールドからの細胞は、その後、彼らは線形心管の既存の足場に移行するところから、咽頭および内臓中胚葉に移行します。第二の心臓野の細胞は右心室、流出路（OFT）心筋に、いくつかの心内膜25-28に貢献していきます。心臓の神経堤細胞（CNCC）、postotic rhombomeres 6、図7、図8からの発信は、尾側咽頭に移行し、signifiに貢献しますOFTにおける平滑筋層と心内膜クッションにcantly。彼らはまた、大動脈肺動脈中隔29,30の形成に寄与しています。第四の人口は...

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ディスカッション

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胚の分離は非常に重要なステップです。 E9.5胚ので細心の注意が単離中の胚/心臓の構造に損傷を与えないように注意する必要があり、サイズは非常に壊れやすいと小さいです。胚全体を撮像する場合、胚/心臓を包む非胚余分な層は、特に慎重に除去しなければなりません。これは、胚組織の奥深く抗体および清算混合物の浸透を可能にし、また、撮像する際のバックグラウンド信号を除去するのに役立ちます。 PECAMに対する抗体を含む複数の抗体、アセチル化αチューブリン及びインテグリンβ1を試験し、すべてが正常に検出された（データは示していない）33。これは、分子の完全性は、細胞の完全性および抗原互換性がこの決済処理中に破壊されなかったことを示しています。

広口トランスファーピペット（先端をカット）を使用して、胚/心を転送します。これは、取り扱い中の損傷を避けることができます。 GFP / YFP / RFP / CFP発現パターンとnクローンのアンバーは、慎重に1心あたりのクローンまたは任意の他の臓器にラベルを付けるための適切な投与量を決定するために、心臓に記録されるべきです。タモキシフ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

科学的な議論に対して、M.W.研究室のメンバーに感謝します。この作業は、AHA [13SDG16920099] から M.W. への支援を受け、National Heart, Lung, and Blood Institute の助成金 [R01HL121700] から M.W. への画像がアルバニー医科大学のイメージング コア施設で撮影されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,2&素数;,2&素数;'-ニトリロトリエタノール Sigma Aldrich90279
Affymetrix199434%パラホルムアルデヒド
 
N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル) エチレンジアミン Sigma Aldrich122262
リン酸緩衝液 生理食塩水Sigma AldrichP5368-10PAK
Triton X-100Sigma AldrichT8787
尿素Sigma AldrichU-1250
スクロースSigma Aldrich84097
グリセロールSigma AldrichG8773
タモキシフェンSigma AldrichT5648
ヒマワリ種子油Sigma AldrichS5007
Tween 20Sigma AldrichP1379
PECAM (CD31)BD Pharmingen 
Alexa Fluor 647 InvitrogenA-21247
DAPI核染色剤Sigma AldrichD9542
37oC インキュベーターThermoscientific FischerHeratherm, Compact Microbiological Incubators
48ウェルプレートCell Treat229148
Analytical BalanceMetler ToledoPB153-S/FACT
共焦点顕微鏡ツァイスツァイス 510 共焦点顕微鏡
解剖顕微鏡ユニトロンZ850
蛍光顕微鏡ツァイスオブザーバー。Z1
Germinator 500 ガラスビーズ滅菌器CellPoint ScientificGER-5287-120V
光源SCHOTTACE I
ペア はさみFine Science Tools14084-08
ペトリ皿 60 mm x15 mm TPPテクノプラスチックプロダクツAG93060
ロッカーII プラットフォームロッカーBoekel Scientific260350
チレーティングチューブFischer Scientific 03-337-26
トランスファーピペットSamco Scientific202
セットファインサイエンスツール11251-20
PBS BSA Fischer ScientificのBP16000550274シンピン

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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