計測インビトロ ATPase活性

サマリー

in vitro ATPase活性を定量するための基本的なプロトコールを記述します。このプロトコールは、特定の精製ATPaseの活性レベルと要件に基づいて最適化できます。

要約

アデノシン三リン酸加水分解酵素、またはATPアーゼは、細胞機能の多様な配列に重要な役割を果たしています。これらの動的なタンパク質は、タンパク質輸送および分解、溶質輸送、および細胞の動きとして、機械的な作業のためのエネルギーを生成することができます。ここで説明するプロトコルは、機能的な特徴付けのために精製されたATPアーゼのインビトロ活性を測定するための基本的なアッセイです。タンパク質は、無機リン酸の放出をもたらす反応でATPを加水分解し、遊離したリン酸塩の量を、比色アッセイを用いて定量されま​​す。この高度に適応プロトコルは、運動またはエンドポイントアッセイにおいてATPアーゼ活性を測定するために調整することができます。代表的なプロトコルは活動とEPSEの要件に基づいて、ここで提供され、AAA + ATPアーゼは、細菌コレラ菌にタイプIIの分泌に関与します。活性を測定するために必要な精製されたタンパク質の量は、アッセイの長さおよびSAのタイミングおよび数mpling間隔は、緩衝液および塩組成、温度、補因子、刺激剤（もしあれば）、 等は、ここで説明したものと異なる場合があり、したがって、いくつかの最適化が必要であってもよいです。このプロトコルは、特徴付けるATPアーゼのための基本的な枠組みを提供し、迅速に行われ、容易に、必要に応じて調整することができます。

概要

ATPaseは、生命のすべての王国にわたる多くのプロセスに不可欠な酵素です。ATPアーゼは、ATP加水分解のエネルギーを利用して、タンパク質の輸送、アンフォールディング、アセンブルなどの多様な反応を駆動する分子モーターとして機能します。複製と転写;細胞代謝;筋肉の動き;細胞の運動性;イオンポンピング^1-3。ATPアーゼには、膜を越えた溶質の輸送に関与する膜貫通タンパク質もあれば、細胞質であり、原形質膜や細胞小器官の膜などの生体膜と関連しているものもあります。

AAA+ ATPases(さまざまな細胞活動に関連するATPases)は、配列と構造保存を共有するATPaseの大きなグループを構成しています。これらのタンパク質は、Walker-Aおよび-Bボックスなどの保存されたヌクレオチド結合モチーフを含み、活性状態ではオリゴマー(一般に六量体)を形成します¹。ヌクレオチド結合によるこれらのタンパク質の大きなコンフォメーション変化は、AAA+ファミリーの多様なメンバー間で特徴付けられています。EpsEはAAA+ ATPaseであり、NTPase^4-6の細菌Type II/IV分泌サブファミリーのメンバーです。EpsEは、コレラの原因物質であるコレラ菌のII型分泌物(T2S)を強化します。T2Sシステムは、コレラ菌がヒトの小腸にコロニーを形成するときに大量の水様性下痢を引き起こす病原性因子コレラ毒素など、さまざまなタンパク質の分泌に関与し^{ています7。}

in vitro ATPase活性を定量化する技術は様々ですが、一般的には比色、蛍光、または放射性基質^8-11を使用してリン酸化放出を測定します。ここでは、遊離した無機リン酸塩(Pi)を測定する市販のマラカイトグリーン含有基質に基づく比色アッセイを用いて、精製タンパク質のin vitro ATPase活性を測定するための基本的な方法について説明します。低pHでは、マラカイトグリーンモリブデン酸はPiと複合体を形成し、複合体形成のレベルは650nmで測定できます。このシンプルで感度の高いアッセイは、新しいATPアーゼの機能特性評価、潜在的な活性化因子または阻害剤の役割の評価、ドメインおよび/または特定の残基の重要性の決定、または酵素活性に対する特定の処理の効果の評価に使用できます。

プロトコル

1.精製タンパク質とATP加水分解反応を行います

1. 精製タンパク質とのインキュベーションのために必要なすべての試薬の株式を準備します。
   1. 100mMのHEPES pHは8.5、65 mMのNaClおよび5％グリセロール（またはその他の適切なアッセイバッファー）を含む5倍HEPES /食塩/グリセロール（HNG）バッファを準備します。
   2. （ATPアーゼは、金属依存している場合、または他の金属）を水に100のMgCl _2を準備_します。
   3. 高純度のATPを用いて、200 mMトリス塩基（さらにpHを調整しない）で新鮮な100mMのATPを準備します。 ATPは時間をかけて分解し、そしてATPストックを凍結し、解凍を控えるよう、もはや数週間以上のために-20℃でATPストックをアリコートし、保管しません。
   4. ちょうどATP加水分解反応をセットアップする前に1：1の比率でプレミックスのMgCl ₂およびATP。
2. 反応の間、一定の間隔でサンプルを収集するために1.5ミリリットルのチューブを準備し、ラベルを付けます。時間0で、かつ時間15、30でサンプルを収集するためのチューブを準備し、45、および60分。
   注：別の方法として、唯一の時間0およびエンドポイントでサンプルを収集します。
   1. ATP加水分解反応1時50分から採取された試料を希釈するために、各チューブに245μlの1×HNGバッファを追加します。
3. すぐに反応を停止したサンプルを凍結するためにドライアイスとエタノールのバスを準備します。ゴムアイスバケットまたは他の安全な（非プラスチック）容器の中で、ドライアイスのいくつかの部分を追加し、慎重にドライアイスをカバーするのに十分な70から100パーセントのエタノールを注ぎます。
4. （通常5〜10μM）必要に応じて、1×HNG緩衝液中で精製したタンパク質を希釈し、そして氷上に保ちます。
5. ATP加水分解反応を設定します。
   1. 各サンプルの別々の0.5ミリリットルのチューブでは、以下の試薬 ​​を順に追加：H（30μlの最終容量まで_）2 O、6μlの5倍HNGまたは他のバッファー、3μlの100のMgCl ₂ -ATP混合物を、および0.25から5μMタンパク質。
   2. 何のタンパク質を添加していないされているバッファのみの負の制御条件が含まれます。
6. 、時間0での反応から5μLを削除する245μlのHNG緩衝液を含む準備された1.5mlチューブに1:50に希釈し、直ちにドライアイス/エタノール浴中でサンプルを凍結します。
7. ATP加水分解は、1時間に発生できるようにするために、37℃で反応をインキュベートします。各区間（15、30、45、および60分）で、反応から5μlのアリコートを削除し、ステップ1.6のようにHNG緩衝液を含む標識試料管に追加します。
8. ATPの加水分解反応の終了時に、貯蔵のために-80℃の冷凍庫に希釈したサンプルを移動させます。すべての試料が完全に凍結されていることを確認するには、続行する前に少なくとも10分を待ちます。

検出試薬で無料のPiを含む2.インキュベートサンプル

1. 各時点でのATP加水分解反応のアリコートを含む融解希釈した試料は、室温で（ステップ1.6および1.7から得られました）。
2. サンプルおよびリン酸塩標準を含む96ウェルプレートをセットアップ。
   1. 0.5ミリリットルのTUで104.5μlのHNGバッファに標準800μMの5.5μLを添加することにより、40μMに800μMから（Piの検出試薬に付属）、リン酸標準を希釈し、こと。よく混合し、96ウェルプレートのウェルA1に、この40μMPiを標準の100μlを添加します。
   2. パイ規格の1の連続希釈：1のためのウェルB1-H1に50μlのHNGのバッファを追加します。
   3. よくA1から40μMPiを50μlのを削除し、よくB1に50μlのアッセイバッファーに追加し、混ぜ、よくB1から50μLを削除してもG1を介して、よくC1に継続的な希釈液を追加します。各ウェルが同じボリュームを持って確保するために混合した後も、G1から50μLを捨てます。まあH1は40から0μMにPiの標準を作成するための唯一のバッファが含まれている必要があります。
      注：追加の要因は、（このような阻害剤など）をサンプルに添加されている場合は、それらの条件の下でリン酸放出または吸光度の変化を制御するために、その要因を含む標準曲線を作成します。
   4. 各SAMPの50μLを追加プレートに二重にル。水平方向と異なる時間点、垂直列に同じ時点からのサンプル（サンプル2時間0 = B2、B3サンプル1時間0 = A2、A3）を追加します。これは、プレートあたり最大8個のサンプルと5つの時点を可能にします。
3. サンプルおよび標準を含むウェル（試薬必要（ミリリットル）=サンプルおよび標準の0.1 x個）のそれぞれに100μlを添加するのに十分なマラカイトグリーン/モリブデン酸Piの検出試薬を除去するために、滅菌ピペットを使用して、簡単にピペット操作のための皿に追加マルチチャンネルピペットを使用して。 Piの汚染が発生する可能性があるとして、皿に直接検出試薬をかけないでください。
4. マルチチャンネルピペットを用いて、好ましくは、第1の時点への最後の時点から順に、慎重に気泡を導入することなく、ピペッティングと時間の一貫した数ダウンすることにより、各ウェルにPiの検出試薬の100μlを添加し、混合します。
5. 室温で25分間プレートをインキュベートし、またはミリアンペアに従ってnufacturerの指示。

マイクロプレートリーダーを使用した3定量結果

1. 吸光マイクロプレートリーダーを用いて650 nmでサンプルの吸光度を読みます。
2. Piの標準曲線を作成します。グラフ作成ソフトウェアを使用して、各試料中のリン酸量を解くために使用される式を見つけるために、濃度に対するPiの標準サンプルについて吸光度値をグラフ。
3. リン酸標準で校正することにより、各サンプルのATPase活性を計算します。リン酸解放=（OD ₆₅₀ - Y切片）/傾き。
   1. 各サンプルの重複からの総パイを平均します。この番号からバッファのみの対照の吸光度の読み取りを引きます。希釈係数（この例では50）で、これを乗算します。
   2. マイクロモルのタンパク質当たりに放出されるnmolのPiを決定します。動態アッセイにおいて、各時点のためにこれらの値をグラフ化することは、少なくともR = 150（ 図1）の線形フィットをもたらすべきです。 n個の場合OT、アッセイは、多かれ少なかれタンパク質又はより長いまたはより短いインキュベーション時間で調整することができます。
4. 所望であれば、ナノモルのPi /モルタンパク質/分（ 図2、図 3）、またはナノモルPI /μgタンパク質/分として結果を表します。

結果

T2S ATPアーゼEPSEのin vitro活性は、細胞質EPSLのドメイン（EPSE-cytoEpsL）と酸性リン脂質カルジオリピン¹²を加えてEPSEの同時精製によって刺激することができます。このアッセイを用いてタンパク質の変異形態を、野生型（WT）の活性を比較することにより、ATP加水分解の特定EPSE残基の役割を決定することも可能です。ここで、EPSE亜鉛結合ドメイン内の2つのリジン残基を置換することの効果はEPSE K417AK419A-cytoEpsLバリアントに精製されたWT EPSE-cytoEpsLのATPase活性を比較することによって測定されます。 図1では、リン酸のリリースでは、1時間動的アッセイ、運動ATPase活性の正確な定量化のための要件にわたって直線的に進行する。連で3回分析し、定量化した図1と同様の精製タンパク質サンプルから2データを示す図の面ではリン酸の放出の...

ディスカッション

これは、生化学的な特徴付けのために精製されたタンパク質のin vitroでのATPase活性に測定するための一般的なプロトコルです。この方法は、容易に最適化されています。例えば、蛋白質、緩衝液および塩組成物の量、温度を調整し、アッセイ長さ（間隔の合計数を増やすなど）の間隔を変化させると、活性定量を改善することができます。市販のマラカイトグリーンベースの試薬は非常に敏感であり、遊離リン酸（100μl中〜50ピコモル）の少量を検出することができます。このため、アッセイの感度が、使い捨てのプラスチック製品、超純水、緩衝液、およびリン酸を汚染を欠いた試薬を使用することが重要です。タンパク質を精製した後、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の純度を改善し、汚染物質を除去することをお勧めします。

インビトロの ATPase活性に弱い表示タンパク質について、刺激は、電子を向上させるために反応に添加することができますnzymatic活動。 ATPase活性を刺激する多くの要因が特徴付けられています。例え...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HEPES緩衝液	Fisher	BP310-500
塩化ナトリウム	Fisher	BP358-212
塩化マグネシウム	Fisher	BP214-500
アデノシン三リン酸(ATP)	Fisher	BP41325
96ウェルプレート(透明、平底)	VWR	82050-760
BIOMOL Green	Enzo LifeSciences	BML-AK111	Preferred リン酸塩検出試薬。注意:刺激性。
マイクロプレートリーダー			BioTek Synergy または同等の
Prism 5	GraphPad ソフトウェア