自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

サマリー

このプロトコルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎の薬理学的治療が免疫細胞の浸潤を抑制した結果として中枢神経系の防御を示すか、または免疫細胞の浸潤の猛攻撃中に神経保護的であるかを決定する方法を説明しています。

要約

>jove_content<自己免疫性脱髄疾患である多発性硬化症(MS)の主な特徴は、免疫細胞が脳と脊髄に浸潤し、その結果、ミエリンが破壊され、神経インパルスの伝導を遅らせるだけでなく、軸索の損傷を引き起こし、運動能力と認知機能の低下をもたらすことです。MSの現在の治療法は、中枢神経系(CNS)への免疫細胞の浸潤を弱めることに焦点を当てています。これらの治療法は再発数を減らし、生活の質を向上させますが、再発を完全に排除するわけではないため、長期的な障害は改善されません。したがって、CNSを保護する治療薬が必要です。動物モデルとMSのヒト患者の両方で、T細胞のCNSへの侵入は一般に炎症イベントの開始と考えられています。薬剤が中枢神経系を保護するかどうかを評価するためには、免疫細胞の浸潤や末梢での増殖に対する潜在的な影響を除外する必要があります。このプロトコルは、薬物介入後に観察されたCNS保護が、CNS浸潤免疫細胞の減弱または炎症性傷害中のCNS細胞の死のブロックの結果であるかどうかを判断する方法を説明しています。現在の治療法は再発(すなわち、免疫細胞浸潤)を減少させるが、完全に排除するわけではないため、炎症性傷害時にCNSを保護するMS治療を検討する能力は、治療戦略の進歩にとって非常に重要です。

概要

多発性硬化症（MS）は、早期の疾患における脳の白質領域において主に炎症性病変によって特徴付けられます。長期進行した後、灰白質萎縮は、MRIイメージングによって検出され、疾患の神経変性相をマークします。反応性神経膠症、脱髄、および白質における軸索損傷は、CNS浸潤免疫細胞に起因しています。現在MSに使用される治療法のいずれも逆転しないか、直接CNSに神経変性を防止する - その代わりに、それらは、CNSへのT細胞活性化および/または浸潤を減衰させることによって炎症を低減します。そこにMSの治療法がなく、現在の治療法を使用している患者は、疾患の進行を経験し続けているため、脱髄およびニューロンの損失を防ぐ薬の発見は非常に重要です。 すなわち 、CNSへのダメージ低減を- -のように見えるが、免疫細胞への影響およびCNS上のものとを区別することは、結果として、実験的に困難な場合がありますかかわらず、それが発生し、それを通してメカニズムの雨。したがって、CNS保護の評価は、病気のメカニズムにどのように影響するかを薬理学的薬剤を決定するために周囲に免疫細胞と免疫細胞の増殖をCNSは、浸潤性の評価と提携する必要があります。

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、現在MS ^1-4を治療するために使用される薬物の発見のための直接の原因であった自己免疫炎症性疾患の十分に確立された動物モデルです。マウスはしばしば、C57BL / 6マウスは、遺伝的変異体の利用可能性に基づいて、人気のある株であると、EAEのために使用されます。 EAEで誘導されたC57BL / 6マウスを、10日目、誘導後の周囲に発症する慢性疾患の進行を示します。脊髄実質および小脳の浸潤は、皮質実質⁵の浸潤の欠如と、これらの動物の組織病 ​​理学の特徴です。 Bでさらに、皮質病変および脱髄雨はC57BL / 6マウスでは比較的存在しない疾患^6-9の顕著な特徴です。可能であればしたがって、MS ¹⁰と同様に表示され、脳および脊髄の両方に見られる再発寛解型疾患および病変を有するSJLマウスを、使用することが好ましいです。

免疫細胞が中枢神経系に到達しない場合の処置は、神経保護として分類することはできません。したがって、このプロトコルは、以前に^11を示し^たように、脳、脊髄、およびEAEマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析の使用は、免疫細胞のCNS ​​への浸潤および末梢における免疫細胞の増殖に対する処置の効果を決定することを可能にします。程度および神経保護の性質を決定するために、中枢神経系組織の免疫組織化学的分析も記載されています。これらの方法を組み合わせることにより、CNSがあったかどうかPR免疫細胞が活性化免疫細胞がCNSに進入するかどうかを、周辺で増殖されたかどうかの決意を可能にし、そして炎症や損傷からotected。神経保護効果は、免疫系への影響にもかかわらず、疑われる場合はCNSへの免疫細胞の浸潤が発生した後、実験者は、治療の開始時間を変更することができます。

ここでは、アクティブなEAE、MSのT細胞媒介動物モデルの2つの異なるモデルを使用してプロトコルを提示し、のさまざまな側面に実験的な治療法の有効性を決定するために、病気中の様々な時点での免疫組織化学と組み合わせたフローサイトメトリー分析MSの病因。この方法は、それが簡単に薬が疾患の病因に作用する方法を絞り込むことながら、中枢神経系の保護に対する免疫細胞の増殖と浸潤に対する効果を区別するの研究者を支援します。

プロトコル

マウスを含む実験手順は、関連機関や政府の規制を遵守しなければなりません。本研究では、マウスを収容し、バーミンガム制度動物実験委員会のガイドラインで健康とアラバマ大学の国立研究所に従って処理します。

1. EAE誘導およびスコアリング

1. 以前^13に記載のようにC57BL / 6マウス^11-13またはSJLマウス^10,11にEAEを誘導します。
   注：実験者が自分の研究課題（さらに詳細のための議論を参照）のためのモデルの理想を選択する必要があります。
2. レコードのスコアは、毎日のように、以前の7日誘導後に始まる各マウスについて^11を説明しました。治療群間の時間をかけて一日平均スコアを比較します。

2.治療

1. 治療は、免疫細胞の浸潤や増殖に影響を与えるかどうかを判断するために、疾患の発症前に、EAEマウスを扱います。
   1. 治療を選択して、私送達THOD、および治療の頻度、薬物の血液脳関門透過性、半減期、および投薬量を考慮しています。
      注：EAEは、血液脳関門の透過性を増加させ、薬物はそうでなければ健康な動物におけるできないCNSに到達することを可能にします。 EAEの臨床スコアを見て用量反応曲線のための実験を​​実施することは、薬物の適切な用量を選択する際に役立つことがあります。ビヒクルコントロールは、薬物処理を並行して実行されるべきです。あるいは、条件付きノックアウトマウスは対照として同腹子と共に使用することができます。
   2. この実験のためSJLまたはC57BL / 6マウスを使用してください。配達の選択した方法を用いて、症状の発症前に、早期にEAE誘導（7日目）後のマウスを扱います。
   3. 生け贄に捧げるとステップ3.1と時間をかけて最高の臨床スコアの平均に基づいて、そのサブステップ、のように、疾患のピーク（約15日目）にマウスを解剖。
   4. 行動は、免疫細胞infiltratiを決定する（ステップ3.2のように）マウスの脊髄にフローサイトメトリーCNSの上、及び末梢における免疫細胞の増殖を決定する（ステップ3.3のように）脾臓に。独立したマウスでは、アストロサイトとミクログリア、及びミエリンの保存を定量化する（ステップ4のように）免疫組織化学を行っています。
2. 免疫細胞の浸潤が発生した後に治療がCNSを保護するかどうかを判断するために、疾患の発症後EAEマウスを扱います。
   1. 手順を繰り返し2.1.1。
   2. これらのマウスは測定可能な疾患の寛解を持っているように、この実験のためにSJLマウスを使用してください。平均臨床スコアによって測定されるように（以下再発のピーク時に、必要に応じて、または）疾患の最初のピーク時にマウスを扱います。
   3. 所望の時間の後のEAE誘導でマウスを生け贄に捧げます。浸潤が既に発生しているため、FACS分析によって浸潤を測定するために有用ではないかもしれません。しかし、免疫細胞の浸潤にもかかわらず、中枢神経系の保護があるかどうかを判断するために、反応性グリオーシスおよびミエリンを定量化するために脊髄を取ります。

3.フローサイトメトリー分析

1. 解剖
   1. 動物のIDや組織の種類と動物当たりラベル3 15ミリリットルコニカルチューブ（脳のための1つ、脊髄のための1つ、および脾臓のための1つ）が含まれます。氷の上で全体の手順のために別々のチューブ内のすべての組織を保管してください。
   2. 3分 - 脾臓のFACS分析のために、2分ごとに約15％の容器の容積の流量で二酸化炭素を用いて疾患（〜15日後のEAE誘導）のピーク時に、マウスを屠殺。呼吸の欠如によって安楽死を確認してください。各マウスの犠牲に続いて、個々に脾臓¹⁴と場所を削除し、氷冷RPMI、2％FCS、100 IUのペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシンを補充含む（ステップ3.1.1から）15ミリリットルコニカルチューブを標識しました（プロトコルを通じて「メディア」）と呼ばれます。
   3. 脳および脊髄のFACS分析のために、circulatinを解放するために、外科用はさみを用いて、マウスの右心房を切断することによって心臓の灌流を行いますグラムの血液や氷冷PBS 10mlで充填されたシリンジに接続された針を左心室を貫通します。ゆっくりと10mlのPBSを注入。
   4. マウスの頭部を切断し、手術用ハサミで頭皮の正中線をカットします。ピールは、手の甲によるまたは鉗子で皮膚を出発点として、脊髄のエントリポイントを使用して、手術用ハサミで頭蓋の正中線をカットします。
   5. マイクロ鉗子で頭蓋骨を剥がすと脳を解放するためにスコップを使用しています。 （ステップ3.1.1から）標識された15ミリリットルコニカルチューブを含有する培地に脳を置きます。
   6. 鉗子および外科はさみでマウスの皮膚を除去し、手術用はさみを使用して、マウスを骨抜き。手足、尾、肋骨を切断し、手術用ハサミで任意の周囲の筋肉が脊柱を解放します。
   7. 手術用ハサミで約5ほぼ等しい片に脊柱をカット​​し、止血剤と一体の一端を圧迫し、その後、別の止血トンを使用O脊髄は、上部から圧搾するまで一片に沿って移動し、圧搾続けます。脊柱の各部分のためにこれを繰り返して、個々にコードを配置し、メディアを含む15ミリリットル（ステップ3.1.1から）円錐管を標識しました。
2. 脳および脊髄における免疫細胞浸潤の評価
   1. 滅菌はさみを使用して小片に、脳と脊髄をカットします。メディアとのストレーナをすすぎながら、新しい50ミリリットルチューブに70μmのセルストレーナーの上に3ミリリットルシリンジからプランジャーでつぶします。メディアで50mlの体積に各チューブを持参してください。ペレット細胞に5分間、453×gで遠心分離します。
   2. 40％の密度勾配媒体の4ミリリットルで上清を吸引し、ペレットを再懸濁し。慎重勾配の適切な階層化を確実にするために、円錐管の壁に非常にゆっくりと新しい15ミリリットルコニカルチューブ、ピペットで70％の濃度勾配の2ミリリットルの上に細胞を含有する40％の濃度勾配を重ねます。で室温で20分間、796×gでスピンブレーキアウト。
   3. 慎重に、1ミリリットルの転送ピペットを用いて勾配から上位ミエリン層を除去し、新しい15ミリリットルコニカルチューブに1ミリリットルホールピペットと転送に界面で生細胞を除去します。 10分間、448×gでメディアや遠心分離機で15ミリリットルにチューブを持参してください。
   4. 再懸濁し、200μlの培地中のペレットと（各動物からの各サンプルは、独自のウェルになります）を、96ウェル丸底プレートの1ウェルに配置します。 5分間、410×gでプレートを遠心。
   5. 再刺激培地200μl中上清及び再懸濁ペレットをオフフリック（RPMI、10％FCSを補充し、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、1×非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、およびβメルカプトエタノール55μM、プラス50 ngの/ mlのホルボールミリステートアセテート（PMA）、750 ngの/ mlのイオノマイシン、およびタンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンA）。 4時間^37°Cのインキュベーターでプレートを置きます。
      注：PMAとionom全てのTリンパ球に関係なく、その抗原特異性の所定の組織内の各T細胞サブセットの数を評価するための活性化ycin再刺激をもたらします。しかし、抗原特異的エフェクターT細胞応答は、ブレフェルジンA ^15,16の存在下で、MOGペプチドを用いて細胞を再刺激を含む種々の方法で評価することができます。
   6. CNS CD4 ⁺ T細胞の表現型の評価
      1. インキュベーションに続いて、5分間、410×gで遠心分離する（ステップ3.2.5から）を、96ウェル丸底プレート、上清をオフフリック。次の染色工程の全ては、このプレートで行われます。
      2. 5分間、410×gで2％FCSおよび遠心分離機で200μlのPBSで細胞を洗浄します。上清オフフリックと10のためのFcブロック（クローン2.4G2）で2％FCSを含む200μlのPBSで細胞をインキュベート - 氷の上で15分。
      3. 50で、5分間、410×gで上清オフフリック、およびペレットを再懸濁し、細胞外染色、遠心細胞を開始するには＆＃956;表面染色カクテルL（1：200、を1μg/ ml）のCD4に対するフルオロフォア標識された抗体を含む、TCRβ15のためにPBS中に希釈し（1：200、を1μg/ mlで）、および生存率染料（500 1）氷上で分。上清オフ5分とフリックのための410×gで遠心分離細胞。ウォッシュ次いで、細胞を5分間、410×gで遠心分離し、200μlのPBSで2倍。
      4. 細胞外の汚れを除去した後、細胞内染色に続いて、固定/透過処理による細胞内染色手順を開始します。
         1. （製造元の指示に従って、物質一覧を参照してください^）17を 、開始上清オフフリックとのFoxp3転写因子染色試薬で/透過処理細胞を修正するには30分4 ^O℃で一晩のために
         2. 5分間、410×gでキットと遠心プレートから150μlの透過化バッファーで細胞を洗浄します。 IL-17Aに対するフルオロフォア標識抗体を用いた50μlの透過化バッファーで上清と染色細胞オフフリック（1：200、を1μg/ ml）を、IFN-γ（1：200、を1μg/ mlで）、およびFoxp3を（1：200、2.5μgの/ ml）を、氷上で30分間、PBSで希釈しました。
         3. 上清オフ5分とフリックのための410×gで遠心分離細胞。過剰な抗体は、その後5分間410×gで遠心分離200μlの透過化バッファーで3回洗って削除します。 200μlのPBS中の上清および再懸濁をオフにフリック。
         4. 以前に各分子を発現する細胞の割合を評価するために^11の記載のように、ライブCD4 ^+TCRβ+細胞上でゲーティング、フローサイトメトリーによって細胞を分析します。 CD4 ⁺ T細胞の表現型のそれぞれにマウスあたりの細胞数を決定するために、血球計数器¹⁸又は他の検証方法を用いて細胞を数えます。
         5. 得られたデータを用いて、特定のEAEの病因に重要な役割を果たし、これらの集団の中心と保護を、各マウスから脳と脊髄を浸潤するCD4 ⁺ T細胞の割合および数を計算^{19：IL-17A +} IFN-γ ^- 、IL-17A ^{+ IFN-γ+、IL-17A - IFN-γ+、Foxp3}を^+。
3. 末梢T細胞の増殖および活性化の評価
   1. 60×15ミリメートル培養皿にすりガラスのスライドで脾臓をつぶします。細胞を懸濁するためにメディアを使用して、15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を置きます。 5分間、448×gでメディアや遠心細胞を15ミリリットルにチューブを埋めます。
   2. 2ミリリットル中の培地を吸引し再懸濁ペレットは、ACK約3分間赤血球を溶解するために室温で溶解緩衝液。
   3. 新しいチューブに70μmのセルストレーナーを介してメディアや株と15ミリリットルボリュームにチューブを持参。 5分間、448×gで遠心分離細胞は、2ミリリットルのメディアに上清、再懸濁を吸引。
   4. Ki-67染色による末梢CD4 ⁺ T細胞増殖の評価
      1. EQの少量（典型的には200μl）を配置します96ウェル丸底プレートの個々のウェルに3.3.3からの脾細胞のuivalent数（サンプルあたり1）。
      2. 上清オフ5分とフリックのための410×gで遠心分離します。 200μlのPBSで再懸濁し、2％FCSを含有し、遠心分離を繰り返します。 PBSは、Fcをブロック（クローン2.4G2）で2％FCSを含有する上清および再懸濁細胞をオフにフリックし、10インキュベート - 氷の上で15分。細胞外染色リピートステップ3.2.6.3ください。
      3. 細胞外の汚れを除去した後、細胞内染色に続いて、固定/透過処理による細胞内染色手順を開始します。
         1. 手順を繰り返し3.2.6.4.1。
         2. 上清オフ5分とフリックのための410×gで遠心分離細胞。洗浄細胞を5分間410×gでキットや遠心分離機から200μlの透過化バッファーで1倍。 30分間：（200、1 / mlの1）抗のKi-67抗体を用いて50μlの透過化バッファーで上清と染色細胞オフフリック。
         3. 410×gでのfoで遠心分離した細胞上清オフR 5分とフリック。洗浄細胞を5分間410×gでキットや遠心分離機から200μlの透過化バッファーで2倍。
         4. 上清をオフにフリックおよび洗浄細胞を200μlのPBSで1倍と5分間、410×gで遠心。以前パーセントのKi-67 ⁺細胞を評価した後^、11を説明したように、ライブCD4 ^+TCRβ+細胞にゲーティング、フローサイトメトリーにより細胞を分析します。
   5. 末梢CD4 ⁺ T細胞の表現型の評価
      1. 5分間、410×gで96ウェル丸底プレート（サンプルあたり1ウェル）、遠心分離器に（ステップ3.3.3から）の細胞を200μlを置き、3.2.5のように再刺激します。
      2. 4時間^37°Cのインキュベーターでプレートを置きます。ステップ3.2.6とそのサブステップと同じ染色手順を実行します。 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5のようにフローサイトメトリーにより細胞を分析します。

4.免疫組織化学ANDの定量

1. 組織標本
   1. C57BL / 6マウスのための疾患の慢性期またはの平均臨床スコアのピーク時に、EAE誘導（しばしば〜30日後の任意の時点で別のステップ3で使用したものから、実験とそのサブステップでEAEマウスを生け贄に捧げますSJLマウス）反応性神経膠症および脱髄の程度を決定するために、以下の手順で。
   2. 2.5％イソフルランと97.5％の酸素でマウスを麻酔し、応答の欠如を探して、ピンセットを用いて穏やかなつま先のピンチで麻酔の適切な深さを確認します。ステップ3.1.3で説明したように経心臓灌流を行います。左心室にPBSを注入した後、PBS 注意に4％パラホルムアルデヒドの10ミリリットルを注入するために、新しい注射器を使用します 。パラホルムアルデヒドは皮膚及び肺刺激物である、目に重大な損傷を引き起こす可能性があり、および発がんのおそれの疑いがあります。吸入、経口摂取を避け、皮膚や目に接触。灌流は、ドラフト内で行うべきです。
   3. 3.1.6 - 手順3.1.4で説明したように、脳や脊柱を削除してください。脊髄のまっすぐな位置合わせを確実にするために文字列を使用してスティックにせき柱を接続します。
   4. 50ミリリットルでシンチレーション約20mlのPBS中4％パラホルムアルデヒドので動物のIDで標識されたバイアル、および脊髄に脳を入れて一晩-修正を投稿する約50mlのPBS中4％パラホルムアルデヒドので動物のIDで標識された円錐管。
   5. 脳をcryoprotectするには、1×PBS中の30％スクロース中4 ^O℃で1×PBSと店舗で3回すすいでください。脳はそのコンテナ（約3日間）の底に落下することを可能にします。
   6. 10〜となります1×PBSで3回洗浄し、pHを開始し、1×PBS中の0.5 M EDTAの大容量（マウスの脊髄では約50ミリリットル）（に置くことで脊柱からカルシウムを削除し、pHがに〜7.8骨はもはや剛性になるまで3週間 - 2のための6NのHCl）を持ちます。ステップ4.1.5に従うことによって脊柱をCryoprotect。
   7. 埋め込み脳とすぐに彼らは、容器の底に落下として、以下のサブステップを、次の10月中にせき柱。
      1. 1×PBS中の1部の30％スクロースおよび2部10月の混合物を作る（例えば、1×PBS中で15ミリリットルの30％ショ糖を追加する30ミリリットル10月）。
      2. それはフルの約1/2になるまで埋め込む金型（22×22のx 20ミリメートル、脳および脊髄のための22×30×20ミリメートル）に10月/ショ糖混合物を追加します。
      3. カミソリの刃を使用して、6均等サイズのピースに脊柱をカット​​し、冠状脊髄切片のために前方を向いた22×30×20ミリメートルの埋め込み型内に配置します。前方を向いた22×22×20ミリメートルの金型に脳全体を置きます。
      4. 組織をカバーし、それが1時間放置する10月/ショ糖混合物を追加します。そのように気泡が逃げることができます。この時間の間に、フラッシュ凍結用包埋金型を保持することができ皿に2メチルブタンを追加します。ドライアイス上に皿を置き、クール事前にカバーしています。
      5. 交流の内部-80 ^{O C}でドライアイスとストアの2-メチルブタンで金型をフラッシュ凍結脱水を防ぐためにontainer。
   8. クライオスタットと16ミクロンで準備ができたら、セクション組織と静電的に帯電したスライド上にマウントします。各脳や脊髄のためのスライド上のすべての10 ^{番目のセクション}を入れて（例えば、というように1は、セクション1、11を持ってスライドさせ、21、およびセクション2、12を持っています2をスライドさせ、22、および）。ストアは-80 ^{O C}でスライドするか、染色のためにすぐに使用しています。
2. 反応性神経膠症およびミエリンの染色
   1. 準備ができたら染色のため、同じ（またはできるだけ同じ）領域内のすべての動物のために染みあたりの脳と脊髄のための1つのスライドそれぞれを選択します。脳は、脳梁と帯状束の束を示すスライドを選択します。
   2. 場所は、7分間^70°Cのでヒートブロック上の組織にスライドします。 7分後、ヒートブロックをオフにして、スライドを別の10のためのヒートブロック上で冷ます - 15分。これは、染色手順中にスライド脱落組織切片を防止します。
   3. 洗浄は5分間（表面抗原を標的とする抗体用）（細胞内抗原のための）0.1％非イオン性界面活性剤または1x PBSで1×PBSで3回ずつスライドします。
      注：このプロトコルで使用される抗体は細胞内であるため、非イオン性界面活性剤は、後続のステップで使用されます。スライドがこのステップの後、完全に乾燥させることはありません。
   4. コンテナ内のスライドを置き、クエン酸緩衝液pH3.0でカバーしています。クエン酸緩衝液を作るために、水に100ミリリットルの最終容量に0.192グラムの無水クエン酸を追加します。以下の場合にはpHが3.0又はNaOHの上にあれば、酢酸でpHを調整します。
   5. 30分間^{、37°C ​​の}時のスライドをインキュベートし、5分間、0.1％の非イオン性界面活性剤と1×PBSで3回洗浄します。
   6. サークル疎水性バリアペンで組織の周囲の領域と、加湿チャンバー内でスライドを配置（例えば、湿ったペーパータオルを含むスライドボックス）。組織にブロッキングバッファーを追加します。室温で30分間インキュベートします。
      注：バッファをブロックすると、1×PBSで構成されてい0.3％非イオン性界面活性剤及び二次抗体、 すなわち 、IBA1ためのミエリン塩基性タンパク質（MBP）およびグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）、及びヤギ血清用のウマ血清のホストに基づいて、適切な血清（5％）を加えました。
   7. スライドをバッファ・オフし、一次抗体を追加遮断フリック（1：1,000またはオリゴデンドロサイトのために0.2μg/ mlのヤギ抗ミエリン塩基性タンパク質、1：アストロサイトのための千または1 / mlの3 / mlのマウス抗GFAP、または1 ：750または適切なブロッキング緩衝液で希釈し0.67 / mlのウサギミクログリアのための抗IBA1）（丸で囲んだ領域へのステップ4.2.6）を参照してください。加湿チャンバー内の4 ^Oの Cで一晩おきます。
   8. スライドをバッファ・オフし、5分間、0.1％の非イオン性界面活性剤と1×PBSでスライドを3回洗浄ブロッキングフリック抗体。
   9. 二次抗体を加える（1：200またはMBPおよびGFAP、またはビオチン化ヤギIBA1抗ウサギ7.5 / mlのビオチン化ウマ抗マウス）適切なブロッキング緩衝液で希釈した（STE丸で囲んだ領域にP 4.2.6）、室温で1時間、加湿チャンバー内でインキュベートするスライドを残します。
   10. スライドをバッファ・オフし、5分間、0.1％の非イオン性界面活性剤と1×PBSでスライドを3回洗浄ブロッキングフリック抗体。
   11. 使用前に免疫におけるアビジン - ビオチン - ペルオキシダーゼ複合体（ABC）（素材リストを参照してください）​​30分を準備し、4.2.12で必要になるまでシェーカー上で攪拌します。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、10分間円で囲まれた領域に、メタノール中0.3％H ₂ O _2を加えます。
   12. スライドオフフリック液とは、1×PBS中で、その後、5分間、0.1％の非イオン性界面活性剤での1×PBSまたは1x PBSで2回に1回洗います。 30分間の円内にABC試薬を追加します。
   13. 5分間水中でフリックスライドオフ溶液と5分間、1×PBSで3回洗浄し、次いで2回。 3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を作製（材料リストを参照）、セクションをカバーするためにそれを追加します。
       注：このステップでは、検出に最適な観察する顕微鏡が必要です染色とのイオン時間を比較するスライドのために同じ時間に実行する必要があります。
   14. 洗浄は、5分ごとに水で3回スライド。水中の70％エタノール、水で95％エタノール、水で100％エタノール、50％のキシレンおよび50％エタノール、100％キシレン：2分ごとに、以下の溶液中に置くことによって、組織を脱水します。樹脂製のマウンティング培地でスライドにカバースリップをシール。
   15. 以前伊庭-1およびGFAPに対する抗体を用いた反応性神経膠症を評価するために^11を説明するように別の方法として、免疫蛍光染色を行います。
   16. 4X、0.13 NAの対物レンズで（DABを用いて、各抗体で染色）各脊髄部分の画像を撮影し、.TIFFとして画像を保存します。また、20X、0.50 NAの対物レンズを用いて、左または右の脳半球における脳梁と帯状束バンドルの画像を撮影し、.TIFFとして画像を保存します。脳内の病変の負荷のより包括的な決意するためには、両方のhemispherを含むことが有益です分析でエス。
3. 反応性神経膠症についての平均分数の面積を測定（IBA1およびGFAP染色）
   1. ダウンロードNIH ImageJの（http://imagej.nih.gov/ij/）とコンピュータで開きます。 ImageJソフトウェアでは、メニューの文字列ファイル]> [開く]を使用して、ステップ4.2.16から画像を選択します。メニューバーの「ポリゴンの選択」ツールを使用して領域を描画します。脊髄については、セクション全体をトレースします。脳、脳梁と帯状束バンドルのため。イメージ>タイプに行くと、をクリックすることで16ビットに画像を変換する「16ビット」。
   2. プロセスに行くことによって脱ノイズ画像>（HTTPでImageJのユーザーガイドを参照してください背景を引き、バックグラウンドの一部ではない最大のオブジェクトのサイズ以上に「 ローリングボール半径」を設定します。//rsbweb.nih .GOV / IJ /ドキュメント/ガイド/ 146-29.html）。
      注：伊庭-1染色の4X画像の場合、我々は4.0を使用し、GFAPのために、我々は50.0を使用しますが、これらの数字は、像倍率と染色int型に応じて変えることができますensity。
   3. 「スライディング放物面」をチェックし、「OK」をクリックします。 >しきい値を調整>画像へ...スライドバーを使用して、より低い閾値レベル（トップバー）を設定します。携帯でのみ染色を含めると、画像で一致しています。暗い背景（のみ蛍光染色に適用されます）との画像については、「ダーク背景」ボックスがチェックされていることを確認してください。
   4. >セットの測定を分析するために行く...と選択「エリアフラクション」（関心領域内の閾値処理面積の割合を示します）。 「しきい値リミット "をチェックしないと「表示ラベル」がチェックされていることを確認してください。完了したら「OK」をクリックしてください。
   5. 測定値を得るために、>メジャーを分析しに行きます。 「結果」のポップアップボックスが表示され、このデータは別のプログラムにあるとして保存またはコピーすることができます。分析のために、治療群間の「面積率」の値を比較します。
4. オプトによってMBP染色の定量化iCalの密度
   1. 開いている画像とステップ4.3.1で説明したように関心領域を描きます。 >セットの測定を分析するために行く...と選択します（ピクセル数で割った選択範囲内のグレー値の合計） "グレー値を平均」。 「しきい値リミット "をチェックしないと「表示ラベル」がチェックされていることを確認してください。完了したら「OK」をクリックしてください。
   2. 測定値を得るために、>メジャーを分析しに行きます。 「結果」のポップアップボックスが表示されます確認します。このデータをコピーし、保存しているとして、または別のプログラムにコピーします。
   3. 分析のために、別のプログラムにコピー＆ペースト値。 OD = ₁₀ログ（255 /グレー平均値）：式を用いて光学密度（OD）に平均グレー値に変換します。

結果

ここでは、薬理学的薬剤は、CNS浸潤T細胞を減衰させるか、炎症性免疫細胞浸潤の猛攻撃中にミエリンおよび軸索損傷を防止することのいずれかによって中枢神経系の保護を提供する場合に理解するために、EAEの2モデルを使用していました。免疫細胞の浸潤および疾患の病理は、主に脊髄（ 図1A）のどこにあるか、治療薬は、脊髄に免疫細胞の浸潤を妨げるかどうかを判断するには、慢性EAEのC57BL / 6マウスモデルが使用されます。治療薬は、CNSへの免疫細胞の侵入時にCNSの保護を提供するかどうかを判断するには、再発寛解型EAEのSJLの動物モデルは、脳や脊髄（ 図1B）の両方で、疾患の病理を実証する、使 ​​用されています。

臨床アセスメント

関連する臨床的評価は、一般的なため、以下のルーブリック（ 図1に従って作られていますC）または非定型（ 図1D）EAE。典型的な臨床疾患について、0のスコアが異常な動作ではありません。尾の付け根によってピックアップすると、尾は（多くのヘリコプターのローターのように）迅速に回転させることができると後ろ足が広げます。 1の臨床スコアは、尾の基部によってマウスを持ち上げることによって決定することができる部分的に弛緩尾部、です。通常のヘリコプターのような回転が弱くまたは存在しない、と尾の部分が完全にぐったりしてもよいこともできます。尾の麻痺の程度を決定するための便利な方法は、部分的に麻痺尾がそうすることができませんしながらunparalyzed尾は通常、指の周りにカールするように、尾の長さを指を実行することです。 2の臨床スコアは完全に麻痺尾を表します。尾の基部にマウスアップを選ぶ際に尾のない動きは全く発生しません。 3の臨床スコアは、部分的な後肢麻痺を表します。このスコアの決意は、マウスがFLAに自由に移動することが必要ですT面。マウスが前方に移動するように、1つの後肢をドラッグしている、または1つまたは両方の後肢が部分的に麻痺のように見える場合は、3のスコアが与えられてもよい。場合4の臨床スコアは完全な後肢麻痺を表します。このスコアでは、マウスがその後肢を移動することができませんし、その前肢を使用して自分自身を前方にドラッグします。 5の臨床スコアは瀕死のマウスを表し、または困難を有するマウスは、ケージまたは呼吸を横断自体を動かします。マウスは、ケージの底部に沿ってまたはその呼吸が苦しい場合は、それ自体をドラッグすることはできません場合は、マウスを人道的に安楽死されるべきです。 6の臨床スコアは、そのケージに死んでいるのが見つかったマウスを表しています。 6のスコアが異常であるとEAE以外の死因を調査する必要があります。

非定型臨床疾患は、または麻痺を伴ってもしなくてもよいです。マウスは非定型疾患プラス典型的な症状を呈する場合には、2つの個別のスコアリングシステムを含むことが必要であり得ます。 0のスコアがA、異常な行動ではありません典型的なスコアリングシステムとの。マウスが歩いている間に1の臨床スコアは、わずかなヘッドターンや傾きを表しています。これは、マウスが前方に歩きすることを可能にする、その動きに一定の左または右の方向を観察することによって決定することができます。 2の臨床スコアは、より顕著なヘッドターンと貧しい立ち直りの能力を表します。 1の非定型スコアと同様に、マウスは、その移動に方向性があり、バランスのわずかな困難を有していてもよいです。 3の臨床スコアが一直線に歩くことができないことを表します。マウスは、困難のバランスを持っていますし、それが歩くように、右側の自分自身を助けるためにケージの側面を使用してもよいです。 4の臨床スコアが原因でバランスの問題に歩くことができない、その側に敷設マウスを表しています。マウスは、ケージの底部に沿って自分自身をドラッグすることができる場合がありますが、その動きに方向性を有していてもよいです。サポートされない限り、5の臨床スコアは、連続圧延を表します。このスコアに到達したマウスは、人道的に安楽死されるべきです。クリニック6のアルスコアがそのケージに死んでいるのが見つかったマウスを表しています。 6のスコアが異常であるとEAE以外の死因を調査する必要があります。

マウスの状態が若干または2つのスコアの間で選ぶことが困難な場合に変更された場合のスコアに0.5を追加し、「イン間の"スコア、 例えばを可能にするために必要になることがあります。例えば、マウスは、その正常な対応よりもゆっくりと移動し始めるが、何の麻痺が表示されない、またはその正面に代わりの尾をピックアップする際にその足を扇形に開くその後肢足を留めマウスは、0.5のスコアを与えることができること。のみケージの底部に沿って自分自身をドラッグして、定期的にしかその後肢をけいれんすることが可能であるか、触れたときにすることができ、マウスは3.5のスコアが与えられます。

免疫細胞の浸潤の減少を評価します

C57BL / 6マウスモデルにおけるEAE（ 図1A、0日目）、抗原presentatiの誘導後約3〜5日臨床スコアを有する本初期の免疫細胞の浸潤マウス後7日目の周りCNSへの免疫細胞の浸潤に続いて5 - 上および脾臓におけるT細胞の増殖は、1日目に起こります。治療薬は、脊髄への免疫細胞の浸潤をブロックしているかどうかを評価するために、薬物や車両は、脾臓における抗原提示および増殖後の7日目に導入されたが、免疫細胞は、脊髄に潜入を開始する前にされています。免疫細胞の浸潤が減衰されている場合は、臨床疾患の経過は、10〜15（ 図2）日から疾患の立ち上がり期の間に改善された臨床スコアを反映すべきです。

免疫細胞の浸潤の減少はまた、減少、神経炎症を生じます。反応性星状細胞および小膠が神経炎症のための主要な特徴と考えられています。イバ-1とGFAP及びミクログリアとアストロサイトの染色は、次にチャンを評価することができます神経炎症（ 図3）を定量化するための平均面積率染色のエス。

免疫細胞の浸潤が減少するかどうかを判断するには、脊髄を除去し、疾患のピーク（ 図1A、約18日）でのフローサイトメトリー分析のために処理されます。これは、免疫細胞の最大数は、脊髄を締結したことを保証します。 CNSへのT細胞のエントランスを開始する炎症性イベントとみなされ、両方Th1およびTh17の細胞は、EAEの動物モデルだけでなく、MS患者で発見されています。一緒になって、フローサイトメトリー分析は、病原性T細胞の両方のタイプの評価を含むべきです。さらに、Tregは、疾患を減衰させる十分に特徴付けサプレッサーT細胞です。したがって、全CD4 ⁺集団からのTregの割合は、エフェクターT細胞集団の割合と比較して評価する必要があります。これは、T細胞浸潤の全体的な減少が生じた場合に明らかにまたはTHER場合ますeはCNSにおけるT細胞の表現型のスキューです。代表的なドットプロット（ 図4A）、車両処理マウス（右上の象限の数字）から脊髄と比較して、薬物処置したマウスからの脊髄におけるT細胞浸潤CD4 ⁺の全体的な数の減少を示しています。それぞれ^{IFN-γ+、IL-17 +、}およびFoxp3を^+、および（ 図4A）を減少させるべきである：のTh1、Th17細胞、およびTreg細胞以下の署名タンパク質が評価さを評価します。統計分析は、有意な減少（ 図4B）を示すために、CD4 ^{+ IFN-γ+} IL-17 ⁺とのFoxp3 ^+細胞の数に対して実行されるべきです。 、IL-17 ⁺ IFN-γ ^{- -} T細胞サブセット^、IFN-γ+ IL-17 ^{+ IFN-γ+} IL-17の割合の統計的評価のスキューを排除するために、及びのFoxp3 ⁺細胞（実行されFiのグレ4C）。

CNS浸潤性T細胞の減少は、周囲に増殖、活性化、および分化を阻害する結果であるという可能性を排除するために、T細胞サブタイプの割合に加えて、活発に増殖T細胞の数を評価する必要があります。活性化と分化が影響を受けない（ 図 5A）でない場合、CD4 ^+、IFN-γ+の割合の変化、IL-17 ^+、またはFoxp3を^+が見つかりませんでしたしなければなりません。増殖は（ 図 5B）に影響されない場合はさらに、Ki67を⁺ CD4 ⁺細胞に変化は見られなかっすべきです。薬物治療は、初期抗原提示及び末梢におけるT細胞活性化を変化させることを避けるために7日目以降に導入されます。しかし、遺伝的モデル内のタンパク質は、多くの場合、胚発生の間に恒常的に削除されたり、EAEの誘導が脾臓細胞ASSE行う前に誘発されます重要度の高いssment。

CNSの保護を評価します

特定の治療薬は、免疫細胞の浸潤後にCNS疾患の病理を調節するかどう実証するために、薬物介入は、臨床疾患スコアリングの最初のピークの間に投与されるべきです。これらのマウスは、再発寛解型表現型を示すので、EAEのSJLモデルは、これらの実験のために有利です。薬物治療は、ミエリン軸索変性を防ぐ場合は、臨床スコアの改善は（ 図6）が観察されます。ミエリンの病理学的評価は、改善された臨床スコアと一致しミエリン損傷の減少を裏付ける必要があります。定量ミエリンの整合性を評価するために、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）のDAB染色が行わこの染色光学密度（ 図7）の統計分析が続きます。さらにその神経炎症を実証するために持続的またはtherapeによって減少されますutic介入、反応性グリオーシス（ 図3）上述したように、反応性グリオーシスのための平均フラクション面積を測定することによって評価することができます。治療的介入は、直接免疫調節効果なしCNSを保護していることを確証するために、脾臓における免疫細胞のCNSへの浸潤および増​​殖の減衰が割り引かなければなりません。これに対処するために、脳および免疫細胞浸潤と末梢T細胞の増殖および活性化の評価の脊髄の評価のための方法は、上記のように行われるべきである（ 図4及び5）。まとめると、CNS浸潤T細胞または末梢におけるT細胞の増殖の減少の証拠とCNSにおける細胞傷害を遮断する治療薬は、CNS保護処置です。

図1. 代表RESU臨床C57BL / 6におけるEAEからのスコアとSJLマウスのLTS。慢性疾患でEAEを生成するためにMOG _35-55で誘導されたC57BL / 6マウス（n = 10）の（A）臨床スコア（平均±SEM）。 SJLマウス（B）臨床スコア（平均±SEM）（n = 3）は、再発寛解型疾患でEAEを生成するPLP _139-151で誘導。 （C）EAEマウスの代表的な疾患の進行を追跡するために使用される臨床的スコアリング注釈。 （D）EAEマウスにおける非定型疾患の進行を追跡するために使用される臨床採点ルーブリック。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

EAEを有するC57BL / 6マウスにおける免疫細胞の浸潤に先立って 、図2 の薬理学的治療。 35-55と7日目postimmunizationからPBSで処理した（N = 20）またはSAS（N = 19）の臨床スコア（平均±SEM）。データは、3つのプールされた独立した実験からのものです。統計的な差は、* P <0.05、ノンパラメトリック両側マンホイットニーU検定を用いて決定しました。 （11）からの許可を得て再印刷します。

図3. 免疫蛍光染色および制御、EAEの脊髄における反応性神経膠症の定量化、および処理されたC57BL / 6マウス。（A）コントロールの脊髄におけるGFAP（アストロサイト）と伊庭-1（ミクログリア）のための蛍光標識（免疫されていません）マウス（左パネル）およびPBS（中央のパネル）またはSAS（右パネル）で処理したEAEマウス。スケールバー=100μmです。染色の定量は、パーセントを測定する面積率法を用いて決定したimmunopGFAP（B）と伊庭-1（C）のためのositiveエリア。平均±SEM、n = 3の対照、n = 3 SAS処理された、又はn = 4、PBS処置マウス、マウス当たり6セクション。統計的な差は、一元配置ANOVAを用いて決定した* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001。再印刷（11）からの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

EAE C57BL / 6マウスの脊髄の 図4 FACS分析は、処置されたマウスにおけるT細胞の浸潤を減少実証 C57BL / 6マウスは、EAEの7日間のpostinductionを開始、SASまたはPBSで処理しました。 Th17細胞（IFN-γ ^-脊髄を代表ドットプロットはの^{Th1（IFN-γ+} / IL-17）を示す15日目（A）で得られました^- / IL-17 ^{+）CD4 +ゲート}内の細胞（上パネル）および制御性T細胞（のFoxp3 ^+）（下のパネル）。ドットプロットは、右上の象限の割合を示しています。 （B）絶対CD4 ⁺細胞の数だけでなく^{、IFN-γ+、IL-17A +、}およびFoxp3を⁺細胞を統計学的に分析しました。 （C）SAS-およびPBS処置EAEマウスとの間のT細胞集団のパーセンテージの変化も調べました。 2つの独立した実験から処理されたSASのためであり、n = 9、平均±SEM、nは= PBS処理したため10。両側t検定は、すべての棒グラフに使用しました。 ** P <0.01。再印刷（11）からの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5. FACEAE C57BL / 6マウスの脾臓のS分析は、処理および未処理マウスにおける同等のT細胞の発現プロファイルおよび増殖を実証する。PBS-およびSAS-処置したマウスから脾臓をEAEの15のD postinductionを分析しました。 （A）CD4 ⁺ T細胞の割合の^{Th1（IFN-γ+} / IL-17 ^{- ）、Th17}細胞（IFN-γ ^- / IL-17 ^+）PBS-から脾臓における、およびT調節細胞（のFoxp3 ^+）処理された（N = 10）、およびSAS処理した（n = 9）、2つの独立した実験のマウス。 （B、左パネル）ナイーブ脾臓からCD4 ^+集団でのKi-67 ⁺細胞の割合は、（N = 4）と同様のPBS-（N = 5）およびSAS処置マウス（n = 5）で誘導しますEAE。一方向ANOVA検定は、PBSまたはSAS処置EAE脾臓のいずれかと比較してナイーブ脾臓からのKi-67 ⁺細胞の割合との間に統計的有意性を実証しました。いいえ意義は、PBSおよびSAS処置EAE脾臓の間で観察されませんでした。 （B、 ​​右パネル）代表ドットプロット;数字は、増殖の割合を示しています。ドットプロットは、割合を示します。棒グラフは、両側t検定を表し、*** P <0.001。再印刷（11）からの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

EAEを有するSJLマウスにおける免疫細胞の浸潤後の 図6 の薬理学的治療。PBSで処理したSJLマウスの臨床スコア（平均±SEM）（N = 8）またはSAS（N = 8）PLPとの日から24 postimmunization（破線） _139-151。データは、臨床スコアの平均±SEMです。統計的な差は*** p <0.001、ノンパラメトリック両側マンホイットニーU検定を用いて決定しました。一番上の行は、統計的に使用される値を表し、分析。 （11）からの許可を得て再印刷します。

光学密度を用いて、MBP染色の 図7. 定量化。（A）EAEで誘導し同腹子対照C57BL / 6マウスと比較して、不特定の遺伝子ノックアウトマウスからの胸部脊髄におけるMBPの代表的な染色。ブラケットは、脱髄を示す減少したMBP染色の代表的な領域を示しています。 （B）不特定の遺伝子ノックアウトC57BL / 6マウスから胸髄のMBP染色。 （C）EAEで誘導された不特定の遺伝子ノックアウトマウス（KOであり; n = 6マウスは、2から4腰椎と動物あたり胸部セクション）は、野生型（WTよりも脊髄におけるMBP染色の高い光学密度（OD）を示す; nは= 3匹、2 - 動物あたり4腰椎と胸椎のセクション）EAEで誘導したマウス。統計的に分析USI* P <0.05、両側t検定をngの。エラーバーはSEMを表します。スケールバーは100μm。

ディスカッション

MS患者は直接的にCNSを保護する治療選択肢の開発を正当化、CNSへのT細胞活性化および/または浸潤を減衰させる薬物を服用しながら、疾患の再発を経験し続けます。 EAEは、古典的MSの症状をモデル化するために使用され、 インビボで免疫系と中枢神経系との間の相互作用の性質を研究する際に強力なツールであることができます。 EAEにおいて治療上の考慮事項のタイミング、 例えば 、使用することは、疾患の開始前または後に、周囲にCNSにおける免疫細胞浸潤を調べ、増殖および活性化に関連して、免疫系の両方での処置の効果を描写することが可能であるとCNS。

C57BL / 6マウスにおけるEAEは、より広く利用されているが、これらのマウスは、実質における再発寛解型の表現型と免疫細胞の浸潤を持っているとして、SJLマウスにおけるEAEは、MSの症例の大部分をより表すことができます脳¹⁰の。 SJLマウスは、疾患が提示した後、それが可能な治療を開始することが、減少の炎症の時代に、ならびに寛解の間に明確な回復を持っています。 SJLマウスは、常に結果がプールされたときに、潜在的に大きなばらつきが生じ、同期して再発し、送金しないことを考慮することが重要です。そのため、一部の研究者は、疾患の進行に個別のポイントでFACS分析および組織学のためのマウスをしながら1動物から臨床スコアのための代表的な結果を示すことを選ぶことができます。

操作がEAEマウスに行われた場合を考慮すると、治療は免疫系や中枢神経系にどのように影響するかの決意を支援することができます。治療の開始時には多くのオプション、免疫細胞が中枢神経系に入っているとどのように彼らはCNSと対話することができるかどうかのために、独自的な意味合いを持つそれぞれがあります。症状の発症前に治療は、免疫細胞がまだ入力またはCNSへの損傷を引き起こしていないことを意味します。症状の発症後の治療は、免疫細胞が中枢神経系に入っているし、いくつかの被害をもたらしていることを意味します。 SJLマウスを使用して、治療はまた、免疫細胞が活発に浸潤し、炎症を引き起こしている再発、中、または免疫細胞が少ない炎症とCNSであまり普及しているかもしれ寛解、中に開始することができます。免疫細胞が治療中に病理学的過程のどこにいるか検討する際の治療はCNSおよび免疫系にどのような影響を与えるかについて初期仮説を行うことができます。

治療は、免疫細胞及びCNS、EAE症状の重症度を軽減するの最終結果にそれぞれ影響を与えることができるいくつかの方法があります。したがって、免疫細胞のCNS入力したか否かを、周囲及びCNSに影響を受けるかの免疫細胞を見てフローサイトメトリー分析および免疫組織化学を使用する必要があり、CNSは、治療に反応する方法。脊髄のフローサイトメトリー分析はどのように多くの細胞ヘクタールを判断することができますが与えられた時間にCNSを入力VEの免疫細胞の増殖は、脾臓で影響されない場合を除き、1は、この効果は減少した免疫細胞の輸送によるものであることを判断することはできません。末梢および中枢神経系の両方の組織を分析し、両方の組織を比較した場合の結果は、機構的に何を意味するかを決定することが必要です。免疫細胞活性プロファイルが調節性T細胞重プロファイルに病原性のヘルパーT細胞重いプロファイルのスイッチを有し、例えば、処理することにより変更することも可能です。異なる細胞型のマーカーを見て、処置および未処置動物の間のパーセント発現を比較するためにも重要な考慮事項です。 MS研究における新興の概念は、B細胞が自己免疫性脱髄において重要な役割を果たすことを示唆しています。これは、B細胞がT細胞²⁰の再活性化に必要であることを示す研究に基づいています。この概念は、リツキシマブなどの治療の成功は、CD20元に対する抗体によってサポートされていますB細胞^21,22の表面に押されました。臨床試験におけるモノクローナル抗体のオクレリズマブの成功によって示されるように、CD20の異なるエピトープを標的とする薬剤は、B細胞標的治療薬²³の有効性を改善することができます。

ここに提示された技術の1つの制限は、免疫細胞がCNSに入るが、実質に移動することができなくすることが可能であることです。免疫組織化学、免疫細胞の血管周囲カフィングを検出し、処理および未処理動物の間で実質に移動した距離を評価するために使用することができます。別の潜在的な制限は、EAEの病因にmicrobiomeの影響を伴います。共生腸内細菌叢は重く疾患の病因^24に影響^を与えることができます。したがって、別のコロニーに、さらに別のケージで飼育したマウスは、疾患の重症度の広大な違いを持つことができます。以下のために、同じケージで飼育同腹子対照を使用することが可能な場合したがって、それは常に好ましいです。EAEを含む実験。最後の注意は、末梢における免疫細胞増殖の変化の影響を排除するために、実験が望ましい場合、受動的伝達の誘導ではなく、このプロトコルに記載の活性誘導を使用してそうすることが可能であるということです。

神経保護のためのさらなる確認は、細胞死または細胞型に選択的にタンパク質の欠失を可能にする条件付きノックアウトマウスの使用を介して特定の機構を試験する共培養系^11を用いて達成することができます。さらに、神経保護されている薬理学的薬剤の探索を拡張するために、軸索切断および神経細胞死のマーカーが含まれるべきです。重要性の別の領域は、再ミエリン化です。負傷軸索は神経保護療法は、再ミエリン化療法の重要な一部である必要があり、さらにサポートを貸し再ミエリン化することはできません。さらに、無髄軸索がmyelinaよりも傷害に対してより脆弱ですテッドの軸索。これは、軸索は軸索損傷を防ぐことができますタイムリーな再ミエリン化を促進する脱髄治療的介入になるとことを示唆しています。これらの道を探索するために、脱髄および再ミエリン化のために他のin vivoモデル（ すなわち 、クプリゾン及びリゾレシチン）を用いることができます。本明細書に記載される方法は、ミエリンの損失を定量することによって神経保護を評価することに焦点を当てました。再ミエリン化の評価のための前駆細胞の数、ならびに増殖および成熟する能力も調査することが重要であろう。これらの代替モデルの言及で、1はまた、ウイルスに媒介される脳炎の異なるモデルを考慮しなければなりません。ミエリン損失を生成する2つのよく特徴付けRNAウイルスのモデルがあります：1は、タイラーマウス脳脊髄炎、非エンベロープピコルナウイルスであり、他方はマウス肝炎ウイルス、コロナウイルス科^25,26のメンバーです。

EAEは、STのための貴重なツールです。操作または治療は、生体内で免疫系と中枢神経系にどのような影響を与えるかのudies。ここで説明するプロトコルは、それが周辺部で、血液脳関門に、またはCNSにあるかどうか、治療は病気のプロセスに影響を与えている場所を判断するのに役立ちます。 MSのための現在の治療は、時間の経過とともに、多くの場合、経験の減少疾患患者を治すません。同様に、急性散在性脳脊髄炎、横断性脊髄炎、および視神経脊髄炎、それは浸潤免疫細胞による攻撃の直下であるとしてCNSを保護欠如処理を含む免疫細胞のCNSへの浸潤およびミエリンの分解を伴う他の疾患。考慮治療のタイミングを取り、炎症および損傷を評価するためにCNSの免疫組織化学と関連して脾臓および脊髄のフローサイトメトリー分析を使用して治療についてなされるべきメカニズムの決定を可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
22 x 22 x 20 mm 包埋型	Fisher Scientific	NC9719245
22 x 30 x 20 mm 埋込み型	Fisher Scientific	NC9531194
2-メルカプトエタノール (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
2-メチルブタン	フィッシャーサイエンティフィック	O3551-4
30 x 22 x 20 mm 包埋金型	フィッシャーサイエンティフィック	18-30
ACK 溶解バッファー	品質 生物学的	118-156-101
抗 CD4 PE-Cy7	BD バイオサイエンス 552775		0.2 mg/ml ストック濃度
anti-Foxp3-FITC	eBioscience	11-5773-82	0.5 mg/ml ストック濃度
抗 GFAP (カクテル)	バイオレジェンド	835301	1 - 3 mg/ml ストック濃度
抗 Iba-1 ポリクローナル抗体 (50 µg)	和光	019-19741	0.5 mg / mlストック濃度
抗IFN-&γ;APC	eBioscience	17-7311-82	0.2 mg/ml ストック濃度
抗 IL-17A PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-7177-82	0.2 mg/ml ストック濃度
抗 Ki-67 PE	eBioscience	12-5698-82	0.2 mg/ml ストック濃度
抗 MBP (D-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13912	0.2 mg/ml ストック濃度
抗 TCR&β;FITC	eBioscience	11-5961-85	0.5 mg/ml ストック濃度
抗 TCR&β;PE	eBioscience	12-5961-83	0.2 mg/ml ストック濃度
ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG	ベクターラボ	BA-1000	1.5 mg/ml ストック濃度
ビオチン化ウマ抗マウスIgG	ベクターラボ	BA-2000	1.5 mg / mlストック濃度
クエン酸、無水、99.5%	フィッシャーサイエンティフィック	AC42356-5000
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、四ナトリウム塩二水和物、99%	フィッシャーサイエンティフィ
ウシ胎児血清	HyClone	SH30071.03
ッシャーブランドスーパーフロストプラス顕微鏡スライド、10	ッシャーサイエンティフィック	12-550-15
ゴルジのケースプラグ	BD Biosciences	555029	タンパク質輸送阻害剤
Immedge 疎水性バリア ペン	フィッシャー サイエンティフィック	NC9545623
イオノマイシン	EMD ミリポア	407952-5mg
L-グルタミン、100x	コーニング	25-005-CL
MEM 非必須アミノ酸	コーニング	25-025-CL
ニア IR ライブ/デッド染色キット	Life Technologies	L10119	生存率染料
正常ヤギ血清	Vector Labs	S-1000
正常馬血清	Vector Labs	S-2000
パラホルムアルデヒド、96%	Fisher Scientific	AC416785000
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x	Corning	30-002-Cl
Percoll	GEヘルスケア	17-0891-01	密度勾配
パーマウント	フィッシャーサイエンティフィック	SP15-500	樹脂封入剤
ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)	シグマ	P1585-1mg
精製抗ミエリン塩基性タンパク質抗体	BioLegend	808401
RPMI 1640	コーニング	10-040-CM
ピルビン酸ナトリウム	コーニング	25-000-CL
Tissue-Tek CRYO-OCT コンパウンド	フィッシャーサイエンティフィック	14-373-65
トリトン X-100	シグマ-アルドリッチ	T9284	非イオン性洗剤
ベクタステイン エリート ABC キット (標準)	フィッシャーサイエンティフィ	NC9206402	アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ 免疫ペルオキシダーゼの複合体(ABC)
ベクターラボラトリーズペルオキシダーゼ基質キット(DAB)	Fisher Scientific	NC9276270	DAB solution