オリジナル腫瘍の開発のマウス実験モデルと腹膜転移経由で同所接種

サマリー

卵巣癌の腹膜播種の多段階プロセスを明確にするために、現在の研究では、これらの腫瘍細胞と同所接種を介して元の腫瘍の開発と腹膜転移のマウス実験モデルを提示します。

要約

それは腹膜播種を示しているので、上皮性卵巣癌（EOC）は予後不良と関連しています。予後を改善するために、腹膜播種を制御することが重要です。しかし、腫瘍細胞が原発巣から切り離し、中皮に付着するかまだ不明です。適切な動物モデルの確立は、in vivoでの腹膜播種のメカニズムの理解を得るために必要とされます。現在の研究では、腹膜や遠隔臓器などの転移の発生にマウスの卵巣表面にEOC細胞の局所注射からプロセスをご紹介します。生後8週目の雌ヌードマウス（BALB / C NU / NU）を使用しました。ビューの顕微鏡視野下では、EOC細胞（中の細胞外マトリックス（ECM）の1×10 ⁵細胞/μlのヒドロゲル/片側性卵巣/マウスをベース）背側脇腹から後腹膜アプローチにより、マウスの卵巣に注入しました。この提案された方法は、ルですマウスのためのssの侵襲的手技とは、卵巣へのダメージを最小限に抑えることができます。ここでは、EOCの元と転移性腫瘍形成の開発における方法論の手順を説明します。

概要

上皮性卵巣癌（EOC）は、婦人科悪性腫瘍の¹の中で癌関連死亡率の最も高い割合を占めています。 EOCは、主にその後半症状に、予後不良と関連している、と多くの場合、複数の腹腔内disseminationsおよび遠隔転移^2-4と関連しています。腹膜播種は、多段階プロセスです。まず、腫瘍細胞は原発巣から離れ、そして腹腔内に移動します。腫瘍細胞が腹膜中皮に付着すると、彼らは中皮^5,6を介して組織に侵入し始めます。より良い腫瘍生物学（ 例えば 、癌の進行と治療反応）を理解するために、マウスモデルは、豊富な情報を提供しています。ヒト癌細胞を有する異種移植片は、広く、静脈内に、腹腔内に、ヒト癌細胞を皮下に接種されたマウスモデルに使用され、同所れます。同所gを有する動物モデルrafted腫瘍は、より効率的かつ正確heterotopicallyグラフトされた腫瘍を有する動物モデルと比較して、ヒトにおける腫瘍環境を反映した結果を生成することができます。そのため、多くのヒト腫瘍については、同所移植モデルは^7月11日に設立されました。

ここでは、腹側接種に比べて侵襲性が制限されている背側脇腹から後腹膜アプローチを通じて人EOC細胞の同所接種を説明します。この技術はEOCについての有用な情報、腹腔内播種の特にメカニズムの多様性を提供することができます。

プロトコル

治療プロトコルは名古屋大学で採択された動物実験のためのガイドラインに従います。

細胞懸濁液の調製

1. ヒト卵巣明細胞癌細胞株。
   1. （100単位/ ml、ストレプトマイシン：0.1mg / mlのペニシリン）、10％ウシ胎児血清（FBS）及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地中でES-2細胞^12を保持します。 5％CO ₂の加湿インキュベーター中で37℃で培養細胞。
   2. 0.05％トリプシン/ 0.02％EDTA溶液（トリプシン/ EDTA）で対数増殖期の細胞を収集します。
      1. （ - 25cm ²のあたり4ミリリットル^{、2+ の} Ca ²⁺ / Mgを含まないPBS 3）まず、次いでPBSで細胞を1回洗浄し、細胞培養容器から古いメディアを削除します。
      2. 次に、トリプシン/ EDTAの25cm ²のあたり1ミリリットルを追加します。トリプシン/ EDTAで細胞単層をカバーするために細胞培養容器を回転させます。トリプシン/ EDTAを除去し、廃棄した後、細胞を返します5分または細胞が分離されるまで - 3のためのインキュベーターに培養容器。
      3. 細胞は、細胞培養容器の表面から剥離して浮いていることを確認するために顕微鏡下で細胞を調べます。
      4. トリプシン（25cm ²のあたり5 ml）を不活性化し、細胞を再懸濁するために、増殖培地を含有する新鮮な血清を加えます。 15ミリリットルコニカルチューブに再懸濁した細胞を転送します。
      5. 5分間、300×gで遠心分離します。 4℃または室温での遠心分離のいずれかを実行します。慎重に上清を除去し、（25cm ²のあたり5 ml）を成長培地で細胞を再懸濁します。
   3. （トリパンブルー排除によって、例えば ）細胞カウントを2×10 ⁸細胞/ mlの密度で増殖培地中に再懸濁します。氷の上に懸濁した細胞を置きます。
2. 凍結した細胞外マトリックス（ECM）を解凍氷浴中でヒドロゲルアリコートをベース。
3. 1（最後のセルC：1の比率でECMベースのヒドロゲルのアリコートに細胞懸濁液を追加oncentration：1×10 ⁵細胞/培地-ECMベースのヒドロゲルのμl）を、徹底的に混ぜます。使用するまで氷浴中で調製した細胞懸濁液を置きます。

細胞懸濁液2.同所接種

注：手術は、専用のスイートを必要としません。手術は別個であり、最小限の活性を有する部屋の領域で実験室のベンチトップ上で実行することができます。層流フードを使用してもよいです。無菌の手術器具を使用する必要があり、鋏は、皮膚切開を作製するために使用すべきではありません。

1. この同所接種モデルのための8週齢で雌性ヌードマウス（BALB / C NU / NU）を使用します。
2. （ - 4％2）まず、イソフルラン吸入を用いてマウスを麻酔。しっかりとつま先のピンチの際に撤退の欠如を検証することによって麻酔深度を確認してください。マウスを麻酔した後、必要に応じて乾燥を防ぐために、目に当たり障りのない無菌眼軟膏を適用します。
3. operatに麻酔マウスを置きます段腹側を下る。アルコールとヨウ素系またはクロルヘキシジンベースのスクラブの両方で手術領域を数回駆除。
4. 垂直方向に右肋骨弓と大腿骨の間の背骨に近い〜2 cmの切開を行います。切開部位の周りに滅菌外科用ドレープを使用してください。開口部を維持するために、クランプで切開し、皮膚の表面を修正しました。
   注：リトラクターは、代わりのクランプを使用することができます。
5. 次に、腹腔を開くには、最初の切開下壁側腹膜で第2の切開（約1cm）を作ります。切開腹部の表面を固定します。腹腔から卵巣を除去するために、クランプで同側卵巣と卵管を囲む脂肪組織をクリップ。慎重にガーゼ上の卵巣と卵管を配置します。その後、解剖顕微鏡下でマウスの腹側を下に置きます。
6. 注入直前（1/2 ccで、29 G）は、インスリン注射器で細胞懸濁液を置きます。慎重に準備された細胞懸濁液を（注入1- 卵巣に2μl）を。いくつかの秒間、ECMベースのハイドロゲルのゲル化を確実にするために卵巣内針を保持します。ゲル化した後、注入された腫瘍細胞が卵巣の内部に残っています。
7. 慎重に体内に卵巣を返します。滅菌医療絹を有する第二の切開を縫合し、次に創傷クリップで皮膚を密封します。
8. 手術後、マウスは、最初の24時間の期間（ 例えば 、メロキシカム、筋肉内（IM）又は皮下（SC）、0.2ミリグラム/ kg）の鎮痛を投与されます。

3.手術後の処置

1. それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでマウスを暖かく保つためにホットパックできれいに紙の上に別々のケージに各マウスを置きます。その後、飼育および監視するためのケージに動物を返します。外科的治療後の7日 - 3毎日マウスを監視します。
2. 術後のマウスのモニタリング
   1. 痛みの兆候の場合には、analgeを投与毎日SICS（ 例えば 、メロキシカム、筋肉内または皮下、0.2ミリグラム/キログラム）。
   2. マウスは感染症（ 例えば 、発赤、腫脹、放電）の兆候がある場合は、抗感染剤（ 例えば 、ペニシリン、イム10万IU / kg）を毎日注射を投与します。
3. 14日手術後の治療後 - 10皮膚閉鎖材料を削除します。

腫瘍および転移の4分析

注： - 接種後3週間で腫瘍が注入された卵巣2に形成されます。

1. さらなる分析^14,16-20のために（ 例えば 、腫瘍、転移、臓器^）13-15二酸化炭素によりマウスを犠牲にしてから、サンプルを収集。
   注： インビボイメージングシステムは、利用可能である場合には生物発光（ 例えば 、ルシフェラーゼ）、または蛍光タンパク質（ 例えば 、GFP）を産生する酵素を有する細胞は、このプロトコルで使用することができます。この修正されたプロトコルは、有用な情報を提供します原発腫瘍からの癌細胞の広がりのダイナミクス。

結果

六ヌードマウスは、このプロトコルに記載のように、それらの卵巣は、ヒト明細胞癌細胞株ES-2を接種していました。 図1Aに示すように、2週間後、6匹のマウスの5は、ES-2細胞を接種した卵巣の腫瘍を有していたが、反対側の卵巣には腫瘍（コントロールとして使用）を接種せずに存在しませんでした。また、5匹のマウスの2は、腹水を持つ複数の腹膜disseminationsを示しました。細胞は、肝臓（ 図1B）に転移します。接種部位での腫瘍塊とし、制御側の両方の卵巣は、解剖切片、ヘマトキシリン-エオシン（HE）で染色し、顕微鏡（ 図2）で分析しました。卵巣癌細胞の大多数はなく、反対側の、接種卵巣で観察されました。細胞形態は、親腫瘍と同じでした。

ディスカッション

動物モデルは、癌細胞に対する腫瘍発生、進行、転移、及び薬効のメカニズムを分析するために不可欠です。ヒト卵巣癌細胞を有するマウスはまた、動物モデルとして使用されてきました。ここでは、同所のサイトで卵巣腫瘍細胞の投与のための低侵襲性の手順を説明します。この手順を使用して、背側脇腹から後腹膜アプローチを通じて卵巣への接種は、他の一般的に使用される技術上の重要な利点があります。まず、同所接種は、人間^13,21における腫瘍環境を反映し、より効率的かつ正確な結果を提供することができます。第二に、背側脇腹からこの後腹膜アプローチはわずかな解剖必要がある（<1〜2センチメートルを）ので、腹膜のアプローチに比べて迅速な方法です。したがって、この後腹膜アプローチは、マウスのための低侵襲性です。第三に、マウスの卵巣は非常に小さく、そしてレアを大量に受け入れることがとてもできません紳士。 ;シングルショットとして- （2μL/インジェクション1）この発表の手順では、高度に濃縮された細胞懸濁液（1×10 ⁵細胞/μl）を、低接種ボリュームを使用します従って、それは、卵巣への損傷を最小限に抑えます。また、卵巣から接...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マトリゲル行列	BD	354234	ECM ベース ハイドロゲル
インスリン シリンジ	テルモ	SS-05M2913	1/2 cc, 29 G x 1/2インチ
縫合			11 mm, 3/8, Nylon6-0
反射 7 mm 創傷クリップ アプライヤー	CellPoint Scientific	204-1000
Reflex 7 mm ワウンドクリップ	CellPoint Scientific	203-1000