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倫理文：動物の扱いを含む手順は、ワイツマン科学研究所の所内動物管理使用委員会（IACUC）、および適切なイスラエルの法律のガイドラインに従って行われました。ワイツマン研究所は、実験動物管理・インターナショナルの評価と認定協会（AAALAC）の認定を受けています。ワイツマン制度動物実験委員会は、海馬神経細胞で行ったこの研究を、承認しました。
（2D）2次元の一次元（1D）海馬培養物の調製
- 2D培養のためにカバースリップの調製。
- 0.9 mLの最小必須培地（MEM）+ 3G、0.05 mLのウシ胎児血清（FCS）、0.05 mLの熱不活性化ウマ血清（HI HS）およびB27サプリメントの1μL：メッキ媒質で構成される（PM）を準備します。注：ゲンタマイシンのMEM + 3Gは、MEM×1のすべての500ミリリットルのために含まれている1 mLを、安定化L-グルタミン、100倍の5ミリリットル（参照
- 200ml中に1.9グラムのホウ砂（四ホウ酸ナトリウム十水和物）、二重蒸留水（DDW）（60℃で混合）と200mLのDDW中の1.24グラムのホウ酸：からなるホウ酸緩衝液を調製します。 1 M HClを用いてpH8.5に最終溶液を滴定。注：最終溶液は400mLの0.1 Mホウ酸緩衝液です。
- 2時間、65％硝酸でカバーガラスを浸し。絶対的な分析試薬（ABS用AR）エタノールで3回リンスが続いDDWで3回すすいでください。
- （ホウ酸緩衝液中で5：2秒、次いで1 mLのポリ-L-リジン0.01％溶液1に希釈し、24枚のウェルプレート中で一晩インキュベートする残す - ブンゼンバーナーの炎を介して簡単に1 2回または3回、各カバースリップを渡します0.1 M、pHは8.4）。その後、DDWでカバースリップを3回リンスし、一晩、標準37°C、5％CO 2インキュベーター中でウェルあたり1mLのPMで残します。
- 1D培養のためのカバースリップの調製。
- クリーングラム75mLのDDW、25mLの25％アンモニア溶液および25mLの30％過酸化水素からなるベースピラニア溶液に浸漬することによってLASSカバースリップ。 〜50℃の加熱板上にカバーガラス30分間、次いで窒素でカバーガラスを乾燥さと場所の溶液。
- 第1の堆積蒸気やスパッタのいずれかを使用して金（99.999％）の30オングストロームの層が続く6Åの厚さの薄いクロム膜（99.999％）でコートしたカバー。
- 0.05のスパッタリング速度を達成するために - 1オングストローム/ sが2の電子ビームでスパッタ装置を使用して、ターゲット260リットル/秒の真空システムは、2" つのサイズおよび4" 。分（RPM）あたり100ラウンド - 0から行くことができる回転ステージを使用してください。 750ワット - 0のパワーをスパッタ直流（DC）を使用します。
- チャンバ10ミリトールの圧力でプラズマを得るために、30 rpmで、アルゴン99.999％の回転を使用します。
- つながる、クロム用DCスパッタ電力W 40でスパッタリングガンの電源を操作〜0.12Å/ sのカバレッジ率、および10でDC W〜0.28 A / Sにつながる、金のために力をスパッタ。
- 30分間の超音波を用いて100 mLのABS ARエタノール中に0.1グラム1-オクタデカンチオールを溶解します。次いでエタノールABS ARと窒素で乾燥で洗浄し、この溶液に2時間のCr-Auの被覆されたカバースリップを置きます。
- 700 RPM - 600で2時間- 1撹拌し（ 材料/試薬の表を参照） を 100 mLのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）およびトリブロックコポリマー3.5gの溶液を調製。 1時間溶液中でカバースリップを置きます。窒素で乾燥したカバースリップ。
- 機械バイオ拒絶層22をスクラッチすることにより所望のパターンをエッチングします。ペンをエッチング針で置き換えられるペンプロッタを使用して、これを行います。下地ガラスに到達するために金属層を介してパターンを傷つけます。複製された所望のパターンを達成するために、コンピュータでこのプロセスを制御します。このプロセスによって形成されたパターンは実証されています 図2および図3の d。
- 100mLのD-PBS、3.5gのトリブロック共重合体、35.7μL/ mLのフィブロネクチンおよび29μL/ mLのラミニンの生体適合性層を調製する。
- 少なくとも10分間、紫外線でカバースリップを滅菌する。調製した生体適合性溶液中のカバースリップを一晩インキュベートする。
注記：生体適合層は、前のステップで生体拒絶層がエッチング除去された場所にのみ形成されます。 - 翌日、P-DBSで2回カバースリップを洗浄する。 PMのカバーガラスを一晩インキュベートする。カバースリップは細胞播種の準備が整いました。
- 以前広範囲に公開されている標準的な手順23,24に従って解剖を行う。
- 簡単には、典型的にはE19日に、または典型的にはE17 23日にマウスから、ラット胚から海馬または皮質を抽出し、クラス= "外部参照"> 24。
- ヒント火災研磨されたガラスピペットと機械的に粉砕24に続いて30分間、 - 20パパイン溶液中の第一の細胞を解離します。
注：細胞は、遺伝的に改変されたマウスから来る場合は、各胚からの組織は、全体のプロセス中に別個1.5mLのプラスチックチューブ内に維持されるべきです。 - 播種前にトリパンブルーを用いて細胞を数えます。
注：遺伝子改変動物のカウントが各胚のために個別に行う必要があります。 - ウェル当たり85万細胞における75万で2D培養、種マウスニューロンおよびラットニューロンのため。図1Dは、ウェル当たり65万細胞で播種。カバースリップの均質なカバレッジを確保するために、播種後わずかすぐにプレートを振ります。
- 神経細胞培養のメンテナンス。
- （ミリリットルあたり）からなる培地（CM）を変更する準備：ウリジン100Xと0.9mLのMEM + 3G、0.1mLのHI HS、10μL5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（FUDR）を
- 0.9mLのMEM + 3Gおよび0.1mLのHI HSからなる最終培地（FM）を調製する（mLあたり）。
- インビトロで 4日後にPMを1〜1.5 mLのCMに交換する（DIV）。 6 DIVでは、CMの50％を新しいCMに置き換えます。 DIV 8で、培地をFM 1.5mLに変更し、FMを2日ごとに50％変更する。約1週間後、自発的な同期活動が現れる。
- 蛍光染料を用いたニューロン培養における自発的または誘発された活性のイメージング。
- 50μLのDMSO（ジメチルスルホキシド）中の50μgのカルシウム感受性蛍光色素（ Table of Materials / Reagents参照）の溶液を調製する。
- 10 mM HEPES、4 KCl、2 CaCl、1 MgCl、139 NaCl、10 D-グルコース、45スクロース（pH 7.4）を含む細胞外記録溶液（EM）を調製する。
- 8μLのカルシウム感受性蛍光色素溶液と2mLのEMのニューロン培養を1時間インキュベートする。軽くて軽く回転させてホモジナイズする細胞への色素のOUの普及。
- 画像化の前に、新鮮なEMとソリューションを交換してください。蛍光イメージングは、 図4に示されています。
- カルシウム蛍光画像（488nmの励起ピーク、520nmで発光ピーク）のための光学フィルタを有する蛍光顕微鏡で画像の視野内の関心領域（ROI）の任意の領域の強度を定量化することが可能なカメラおよびソフトウェアを使用して顕微鏡。
文化の2.電気刺激
注：電気刺激のための基本的なセットアップを図1に示されています。神経培養物は、約14日間成長されたカバースリップを、蛍光顕微鏡下でペトリ皿に置かれます。電圧が培養外側に位置しているバス電極の二対を介して印加されるニューロンの電気的活動は、カルシウム感受性色素を用いて画像化されます。電極は、などによって駆動されます。その出力は、デュアルチャネルアンプによって増幅されるignalジェネレータ。刺激のための電圧制御は、このように簡単なベクトル加算及び組合せを可能にする、より標準的な電流制御25、電界ベクトルが直接決定されるので、26よりも好ましいです。これは、電圧制御の場合のために試料全体にわたって実行することができ、電界の均一性を慎重にチェックが必要です。電圧制御ケアを使用する場合（下記2.2参照）、任意の接地ループを避けるために注意すべきであり、電界の均一性を検証すべきです。
- 均一な電界と電気的刺激のために平行電極線の対を使用します。
- 0.005「」（127ミクロン）のオーダーの厚さの白金製の電極を使用します。 13ミリメートルカバースリップで使用される場合、二つの電極間の距離は約11 mmであることを確認し、電極を配置培養上1mmです。
注記：電極ホルダー（ 図5Aおよび6A）を作るためには、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）を使用します。電極を挿入するためにPTFEを通じて狭い穴を開けます。電極が露出している先端は、溶液との接触で来ることは決してありませんように、デバイスは、細胞外溶液よりも高くする必要があります。絶縁のために、暴露されるかもしれない電極リード線のいずれかの部分にエポキシ接着剤を使用しています。 - 電気分解を回避するためにないDC成分と、50％のデューティサイクルを有する方形パルス形状を使用します。文化を燃焼することなく、効果的な刺激を引き起こすことが10マイクロ秒と4ミリ秒の間のパルス期間を変更します。振幅は±22 V（ 図5参照 ）の順であることを確認してください。方形パルスが電極に並列に接続されたオシロスコープ上で観察することができます。
注：任意の所望の波形の容易なプログラミングは、商用の波形編集ソフトウェアを使用するために（ 材料のリストを参照してください
- 磁場均一性をテストするには、プローブ電極を使用しています。プローブは、電極間の領域に移動して電位を測定できるように少なくとも1mm X 1mmのグリッドを使用します。
- 電位を測定します。つかいます
電界を計算します。参照電極として電極のいずれかを使用します。フィールドは、刺激期間の範囲内で均一であることを確認するために、4ミリ秒（100マイクロ秒のパルス持続時間の例については、図5Bを参照）は100μsの間のパルス持続時間を変化させて電場を測定します。
注：パルス持続時間が1ミリ秒であるときに測定した電界の均一性の例については、図5Dを参照してください。
- より複雑な電界形状を生成するためにバス電極の2直交対を使用し、へ異なる方向に電界を配向することができる（ 図6B参照 ）。電極の2対を有する装置が使用され、各電極対上の信号は、2つの別個のオシロスコープ上で観察されるであろう。
- 位置1ミリメートル培養上記と10の距離で電極 - 互いから11ミリメートル。両方の電極対が（ない接地接続を有していない）がフローティングされており、電極の任意のセットの間の抵抗を測定し、電極の間の短絡が存在しないことを検証することによって、任意の共通の基盤を持っていないことを確認してください。 （ 等オシロスコープ、増幅器、信号発生器、など）電極に接続されて使用される全ての機器は、すべての機器がフローティングされ、基準電極のどれも触れていないことを確認することにより、地面に対してフローティングされていることを確認任意の接地機器。
- 磁場配向を変更するために、解像度を持つ2つの電極対に供給される電圧の振幅を変化させます互いにPECT（ 図7A参照 ）。例えば、0°の使用のために他の電極用パターンと0 Vに対して垂直である電極対上に22 V、±。 45°の場合は、15.6 2 15.6 2 = 22 2の振幅のベクトル和のために、無位相遅れと電極の両方の対に15.6 V±使用。
- 回転磁界が電界を回転固定振幅を生成する正弦波電圧パルスの1つの波形と2つの電極対余弦電圧パルスの単一の波形を使用して適用する（ 図6B参照 ）。
注： 図6Bに見ることができるように、他の電極に±22 Vと一方の電極と余弦波の一回の周期で±22 Vの正弦波の1サイクルを使用した場合、ベクトル和が有する回転電界であります正弦と余弦波と同様、および±22 Vの振幅と周期期間
- クロンを測定し、計算するために、AxieおよびRheobaseの神経細胞培養における軸索の樹状細胞と同じ培養物における樹状突起は、以下のステップを実行する。
- 薄い（170μm）、長さ（10mm）の線にパターンを描いた1D培養液を用いて、1.5の表に記載のようにカルシウムイメージングにカルシウム感受性蛍光色素を使用する。カルシウム感受性色素を培養物に適用し、45分間インキュベートする。染料は、新しい記録溶液と交換することによって洗浄される。
- シナプス伝達の影響を受けずに、電気刺激に対する直接応答の母集団統計を達成するためにネットワークを切断する。そのためには、γ-アミノ酪酸-A （GABA A ）受容体、6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオン（CNQX）受容体の阻害作用を遮断する40μMのビククリンと、 α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）およびカイニン酸受容体および20μMの（2R） - アミノ-5-ホスホノバールRIC酸（APV）、そのブロックN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体。ブロッカーは、記録液に追加されます。
- 2.1および2.3に記載したように100マイクロ秒と4秒の間の時間期間を変化させて方形パルスを印加します。信号をオシロスコープで観測することができます。
- いくつかの関心領域でカルシウムトランジェントの強度を監視する（1.5を参照）は、画像取得プログラムを用いて蛍光顕微鏡を使用して、数百のニューロンをそれぞれ含みます。少なくとも毎秒20枚のフレームの画像取得速度が可能な敏感EMCCDカメラを用いて画像を（材料のリストを参照）、取得することができます。光強度の変化は、刺激された神経細胞の量に比例します。強度の相対的変化を使用して刺激されたニューロンの割合を推定します。
- 各パルス持続時間（4ミリ秒〜100マイクロ秒）のために、目に、強度の変化が見られない電圧（数ボルト）から始まる電極に印加する電圧の振幅を変更します（22 V、±まで）による印加電圧の強度の変化が飽和したE電圧。
注：強度変化は、電圧パルスのそれぞれの持続時間のための刺激のための印加電圧に対する累積ガウス5のように分配されます。 - 各期間のための印加電圧対強度の累積ガウス分布にフィットし、このフィットからガウス平均値を抽出します。
注：この平均は、ニューロンが応答先の代表電圧です。 - このプロセスの終わりに、どのニューロンが応答する各刺激期間の平均電圧を得ます。強度・持続時間曲線をプロットする期間と強みのこれらのペアを使用します（ 図7を参照）。
文化の3磁気刺激
注意：磁気刺激のための基本的な設定は、図2に示されています。右上に表示されますニューロンにおける画像カルシウム感受性色素に用いられる倒立蛍光顕微鏡。磁気コイル（青丸）は同心神経環培養、（青のアウトライン）の上方約5mmに配置されます。ペトリ皿の周囲にピックアップコイル（赤丸）は、磁気パルスによって誘起された電圧を監視します。ピックアップコイルから集積左上に、5,000キロボルトのコンデンサ電圧負荷と磁気刺激装置（MS）コイルの測定された動態を示しています。磁界は青で示されているが（14mmのリング半径について計算）誘導電界は緑色で示されています。底にニューロン培養物の画像を示しています。左下にパターン化された24 mmのカバースリップの明視野像です。白い部分はニューロンです。撮影パターンは、異なる半径を有する同心円培養物から成ります。右下の個々のニューロンを示し、環の短いセグメント上のズームです。規模については、リングWID目には約200μmです。
- 1D培養刺激のための円形リングパターンにおけるニューロンの成長（1.2.5に記載されるようにエッチング）。薄い（170ミクロン）上にパターニング1D培養、長い（10mM）を行と（セクション1.5で説明したように）カルシウムイメージングのためにカルシウム感受性蛍光色素を使用します。
- 約5ミリメートル以下とコイルと同心ペトリ皿円形の磁気コイルと位置を使用します。 5キロボルトの最大電圧を負荷した自家製または商業MSによって駆動さL = 90 はmHのインダクタンスと約30ミリメートル（内径46 mmの外径）コイルのカスタムコイルを使用します。
- 磁気ニューロン培養物を刺激する高電流、高電圧スイッチを使用して導電コイルを介して高電圧及び電流を放電します。 5キロボルト- 21で説明したように、磁気刺激（MS）は、1の高電圧を得るために、100 mFでの順に、大きなコンデンサを使用して構築することができます。また、商業的使用利用できるMS（参照 材料/試薬の表 ）。
注：自家製コイル21を製造するために厚さ0.254ミリメートルと6.35ミリメートルワイドポリエステルでコーティングされた長方形の銅線を使用します。エポキシ樹脂にガラス繊維とキャストで絶縁カスタムメイドフレーム上の配線をオン（ 材料/試薬の表を参照のこと）。あるいは（ 材料/試薬の表を参照）、市販のコイルを使用します。
- 2Dの文化を刺激するために回転磁界を使用してください。
- さて、2Dの文化を刺激するために回転磁界を使用しています。強度を有するコイル読み取りの線形相関を示すために、異なる強度で、皿にない培養でTMSを発射します。
- 次に、神経細胞培養でのカルシウムトランジェントを記録しながら、両方のカルシウムトランジェントとコイルを記録しながら、強度を増加させることTMSを焼成開始。まず、ネットワークバーストがsho、大きなカルシウムトランジェントとして観察しますULDと同期しないコイルTMSスパイクを拾います。ある時点で、強度を増加し続け、カルシウムトランジェントはTMSスパイクと同期なり始めます。あるいは、またはさらに、同期応答を達成した後、同期がTMS閾値を決定するために、廃止されるまで、強度を低下させる開始。
注：条件は厳密に同じ船や正確なコイルの位置および向き、正確な量を毎回使用して、セットアップごとに一定に維持されるべきです。 - それは神経細胞培養に平行な面内で培養に対して固定位置にあるように記録ディッシュのベースにピックアップコイルを取り付けます。
注：これは、磁石に対するピックアップコイルの位置の依存性は、培養の位置に忠実であることを確実に位置決めにおける矛盾がピックアップコイルの読みに無視できるであろうこと。 - 二つの独立したコイルを使用します回転磁界および誘導電界を生成する（ 図8B）互いに直交する配置。独自のMSに各コイルを接続します。刺激物質が〜270 V / M（ 図10B）の最大分野で実空間の270度を走査する回転磁界を生じる、90度（ 図10A）の位相遅れで同様の電流を放電することを確認してください。
- 外部記録溶液（EM）を充填した球状ガラス容器の内部ニューロン培養物を置き。
- ステップ2.4.4で説明したようにカメラで刺激（神経細胞の蛍光強度の変化）を監視します。
- クロスコイル（ 図8B）の場合には、ピックアップコイル平行およびニューロン培養下の特定の距離に位置します。慎重に実験を通してこの構成を維持。
- 解析的に1次元configuraための電界を計算E maxは誘導電界の最大振幅であり、半径rのリングの接線に沿って向けられているE マックス = K 1 Brの 、によってション。 Bは、磁気パルスの振幅であり、k 1は、ピックアップコイル（ 図8A）を用いて測定することができる三次元比例定数です。
- 数値的に電場21をシミュレートするために、（材料リストを参照してください）数値シミュレーションパッケージを使用してください。