このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起

12.9K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/54357

⸱

2017年5月7日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

この記事について

サマリー

神経細胞培養は、単一ニューロンまたはニューロンの人口への影響を通じて新興脳刺激技術を研究するための良いモデルです。ここに提示バス電極によって直接生成または時間変化する磁場によって誘起される電界によりパターニング神経細胞培養物の刺激のための異なる方法があります。

要約

その膜電位が一定の閾値を超えた場合、ニューロンは活動電位を発射します。脳の典型的な活動では、これは、シナプスへの化学入力の結果として生じます。しかし、ニューロンも課せられ、電界によって励起することができます。特に、最近の臨床応用には、外部から電場を作成することによって、神経細胞を活性化させます。これは、ニューロンが外部磁場に応答して、何が活動電位が発生する方法を検討することが重要です。幸いなことに、外部電場の正確かつ制御されたアプリケーションは、切除解離、および培養物中で増殖させ、胚性神経細胞のために可能です。これは、再現性の高いシステムではこれらの質問の調査を可能にします。

本論文では、ニューロン培養物に対する外部電界の制御された適用のために使用される技術のいくつかが検討されています。ネットワークは、いずれか1次元、 すなわちリネアにパターニングすることができますR形態または基板の全体面上に成長させ、したがって、二次元。また、励起は、流体中に浸漬電極を介して電界の直接適用（バス電極）または磁気パルスのリモート作成を使用して電場を誘導することによって作成することができます。

概要

ニューロンおよび外部電場との相互作用は、基本的な意味合いだけでなく、実用的なものを持っています。それは外部から印加される電界が組織を励起することができるボルタの時代から知られているが、ニューロンにおける結果として得られる活動電位の生成を担うメカニズムは、ごく最近、4 3、2、1解明され始めています。これは、電場2、5に応答ニューロンにおける膜電位の脱分極、膜特性のとイオンチャネルの役割、さらには地域の原因となるメカニズムに関する質問への回答を見つけることが含まれます。治療的神経刺激6、7、8、9、 10個の方法論は、被災地を標的とすると治療の結果を理解するために重要であることができ、この情報に特に依存しています。このような理解はまた、治療プロトコルと、脳内の異なる領域を刺激するための新しいアプローチを開発するのに役立ちます。

in vivoでの脳内の相互作用を測定することは、この理解に重要な要素が追加されますが、頭蓋骨内の測定の不正確さと低制御性によって妨げられています。対照的に、培養物中の測定を容易に高精度、ノイズ性能に優れた信号と再現性と制御性の高い大量に行うことができます。集合的ネットワーク動作のニューロン特性の多種多様を14、13、12、11明らかにすることができる培養物を使用して、 15、16。同様に、このよく制御されたシステムは、他の刺激方法がoptogeneticallyアクティブニューロン17、18の光刺激の間のチャネル開口部、19は活動電位を生成するための責任がある方法、例えば、動作するメカニズムを解明するには非常に効率的であることが期待されます。

ここでの焦点は、効率的に外部電界を経由してニューロンを励起することができるツールの開発と理解を記述するにあります。本稿では、バス電極によって異なる構成と直接印加される電界の向きを使用して、刺激を二次元の調製と一次元パターン化された海馬培養物を記述し、そして最終的に二次元の刺激とによって一次元培養をパターニング時間的に変化する電界を誘起する磁界を、5、20、21。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

倫理文：動物の扱いを含む手順は、ワイツマン科学研究所の所内動物管理使用委員会（IACUC）、および適切なイスラエルの法律のガイドラインに従って行われました。ワイツマン研究所は、実験動物管理・インターナショナルの評価と認定協会（AAALAC）の認定を受けています。ワイツマン制度動物実験委員会は、海馬神経細胞で行ったこの研究を、承認しました。

（2D）2次元の一次元（1D）海馬培養物の調製

  1. 2D培養のためにカバースリップの調製。
    1. 0.9 mLの最小必須培地（MEM）+ 3G、0.05 mLのウシ胎児血清（FCS）、0.05 mLの熱不活性化ウマ血清（HI HS）およびB27サプリメントの1μL：メッキ媒質で構成される（PM）を準備します。注：ゲンタマイシンのMEM + 3Gは、MEM×1のすべての500ミリリットルのために含まれている1 mLを、安定化L-グルタミン、100倍の5ミリリットル（参照
    2. 200ml中に1.9グラムのホウ砂（四ホウ酸ナトリウム十水和物）、二重蒸留水（DDW）（60℃で混合）と200mLのDDW中の1.24グラムのホウ酸：からなるホウ酸緩衝液を調製します。 1 M HClを用いてpH8.5に最終溶液を滴定。注：最終溶液は400mLの0.1 Mホウ酸緩衝液です。
    3. 2時間、65％硝酸でカバーガラスを浸し。絶対的な分析試薬（ABS用AR）エタノールで3回リンスが続いDDWで3回すすいでください。
    4. （ホウ酸緩衝液中で5：2秒、次いで1 mLのポリ-L-リジン0.01％溶液1に希釈し、24枚のウェルプレート中で一晩インキュベートする残す - ブンゼンバーナーの炎を介して簡単に1 2回または3回、各カバースリップを渡します0.1 M、pHは8.4）。その後、DDWでカバースリップを3回リンスし、一晩、標準37°C、5％CO 2インキュベーター中でウェルあたり1mLのPMで残します。
  2. 1D培養のためのカバースリップの調製。
    1. クリーングラム75mLのDDW、25mLの25％アンモニア溶液および25mLの30％過酸化水素からなるベースピラニア溶液に浸漬することによってLASSカバースリップ。 〜50℃の加熱板上にカバーガラス30分間、次いで窒素でカバーガラスを乾燥さと場所の溶液。
    2. 第1の堆積蒸気やスパッタのいずれかを使用して金（99.999％）の30オングストロームの層が続く6Åの厚さの薄いクロム膜（99.999％）でコートしたカバー。
      1. 0.05のスパッタリング速度を達成するために - 1オングストローム/ sが2の電子ビームでスパッタ装置を使用して、ターゲット260リットル/秒の真空システムは、2" つのサイズおよび4" 。分（RPM）あたり100ラウンド - 0から行くことができる回転ステージを使用してください。 750ワット - 0のパワーをスパッタ直流（DC）を使用します。
      2. チャンバ10ミリトールの圧力でプラズマを得るために、30 rpmで、アルゴン99.999％の回転を使用します。
      3. つながる、クロム用DCスパッタ電力W 40でスパッタリングガンの電源を操作〜0.12Å/ sのカバレッジ率、および10でDC W〜0.28 A / Sにつながる、金のために力をスパッタ。
    3. 30分間の超音波を用いて100 mLのABS ARエタノール中に0.1グラム1-オクタデカンチオールを溶解します。次いでエタノールABS ARと窒素で乾燥で洗浄し、この溶液に2時間のCr-Auの被覆されたカバースリップを置きます。
    4. 700 RPM - 600で2時間- 1撹拌し（ 材料/試薬の表を参照） を 100 mLのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）およびトリブロックコポリマー3.5gの溶液を調製。 1時間溶液中でカバースリップを置きます。窒素で乾燥したカバースリップ。
    5. 機械バイオ拒絶層22をスクラッチすることにより所望のパターンをエッチングします。ペンをエッチング針で置き換えられるペンプロッタを使用して、これを行います。下地ガラスに到達するために金属層を介してパターンを傷つけます。複製された所望のパターンを達成するために、コンピュータでこのプロセスを制御します。このプロセスによって形成されたパターンは実証されています 図2および図3の d。
    6. 100mLのD-PBS、3.5gのトリブロック共重合体、35.7μL/ mLのフィブロネクチンおよび29μL/ mLのラミニンの生体適合性層を調製する。
      1. 少なくとも10分間、紫外線でカバースリップを滅菌する。調製した生体適合性溶液中のカバースリップを一晩インキュベートする。
        注記：生体適合層は、前のステップで生体拒絶層がエッチング除去された場所にのみ形成されます。
      2. 翌日、P-DBSで2回カバースリップを洗浄する。 PMのカバーガラスを一晩インキュベートする。カバースリップは細胞播種の準備が整いました。
  3. 以前広範囲に公開されている標準的な手順23,24に従って解剖を行う。
    1. 簡単には、典型的にはE19日に、または典型的にはE17 23日にマウスから、ラット胚から海馬または皮質を抽出し、クラス= "外部参照"> 24。
    2. ヒント火災研磨されたガラスピペットと機械的に粉砕24に続いて30分間、 - 20パパイン溶液中の第一の細胞を解離します。
      注：細胞は、遺伝的に改変されたマウスから来る場合は、各胚からの組織は、全体のプロセス中に別個1.5mLのプラスチックチューブ内に維持されるべきです。
    3. 播種前にトリパンブルーを用いて細胞を数えます。
      注：遺伝子改変動物のカウントが各胚のために個別に行う必要があります。
    4. ウェル当たり85万細胞における75万で2D培養、種マウスニューロンおよびラットニューロンのため。図1Dは、ウェル当たり65万細胞で播種。カバースリップの均質なカバレッジを確保するために、播種後わずかすぐにプレートを振ります。
  4. 神経細胞培養のメンテナンス。
    1. （ミリリットルあたり）からなる培地（CM）を変更する準備：ウリジン100Xと0.9mLのMEM + 3G、0.1mLのHI HS、10μL5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（FUDR）を
    2. 0.9mLのMEM + 3Gおよび0.1mLのHI HSからなる最終培地（FM）を調製する（mLあたり）。
    3. インビトロで 4日後にPMを1〜1.5 mLのCMに交換する（DIV）。 6 DIVでは、CMの50％を新しいCMに置き換えます。 DIV 8で、培地をFM 1.5mLに変更し、FMを2日ごとに50％変更する。約1週間後、自発的な同期活動が現れる。
  5. 蛍光染料を用いたニューロン培養における自発的または誘発された活性のイメージング。
    1. 50μLのDMSO（ジメチルスルホキシド）中の50μgのカルシウム感受性蛍光色素（ Table of Materials / Reagents参照）の溶液を調製する。
    2. 10 mM HEPES、4 KCl、2 CaCl、1 MgCl、139 NaCl、10 D-グルコース、45スクロース（pH 7.4）を含む細胞外記録溶液（EM）を調製する。
    3. 8μLのカルシウム感受性蛍光色素溶液と2mLのEMのニューロン培養を1時間インキュベートする。軽くて軽く回転させてホモジナイズする細胞への色素のOUの普及。
    4. 画像化の前に、新鮮なEMとソリューションを交換してください。蛍光イメージングは、 図4に示されています。
    5. カルシウム蛍光画像（488nmの励起ピーク、520nmで発光ピーク）のための光学フィルタを有する蛍光顕微鏡で画像の視野内の関心領域（ROI）の任意の領域の強度を定量化することが可能なカメラおよびソフトウェアを使用して顕微鏡。

文化の2.電気刺激

注：電気刺激のための基本的なセットアップを図1に示されています。神経培養物は、約14日間成長されたカバースリップを、蛍光顕微鏡下でペトリ皿に置かれます。電圧が培養外側に位置しているバス電極の二対を介して印加されるニューロンの電気的活動は、カルシウム感受性色素を用いて画像化されます。電極は、などによって駆動されます。その出力は、デュアルチャネルアンプによって増幅されるignalジェネレータ。刺激のための電圧制御は、このように簡単なベクトル加算及び組合せを可能にする、より標準的な電流制御25、電界ベクトルが直接決定されるので、26よりも好ましいです。これは、電圧制御の場合のために試料全体にわたって実行することができ、電界の均一性を慎重にチェックが必要です。電圧制御ケアを使用する場合（下記2.2参照）、任意の接地ループを避けるために注意すべきであり、電界の均一性を検証すべきです。

  1. 均一な電界と電気的刺激のために平行電極線の対を使用します。
    1. 0.005「」（127ミクロン）のオーダーの厚さの白金製の電極を使用します。 13ミリメートルカバースリップで使用される場合、二つの電極間の距離は約11 mmであることを確認し、電極を配置培養上1mmです。
      注記：電極ホルダー（ 図5Aおよび6A）を作るためには、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）を使用します。電極を挿入するためにPTFEを通じて狭い穴を開けます。電極が露出している先端は、溶液との接触で来ることは決してありませんように、デバイスは、細胞外溶液よりも高くする必要があります。絶縁のために、暴露されるかもしれない電極リード線のいずれかの部分にエポキシ接着剤を使用しています。
    2. 電気分解を回避するためにないDC成分と、50％のデューティサイクルを有する方形パルス形状を使用します。文化を燃焼することなく、効果的な刺激を引き起こすことが10マイクロ秒と4ミリ秒の間のパルス期間を変更します。振幅は±22 V（ 図5参照 ）の順であることを確認してください。方形パルスが電極に並列に接続されたオシロスコープ上で観察することができます。
      注：任意の所望の波形の容易なプログラミングは、商用の波形編集ソフトウェアを使用するために（ 材料のリストを参照してください
  2. 磁場均一性をテストするには、プローブ電極を使用しています。プローブは、電極間の領域に移動して電位を測定できるように少なくとも1mm X 1mmのグリッドを使用します。
    1. 電位を測定します。つかいますfigure-protocol-1電界を計算します。参照電極として電極のいずれかを使用します。フィールドは、刺激期間の範囲内で均一であることを確認するために、4ミリ秒（100マイクロ秒のパルス持続時間の例については、図5Bを参照）は100μsの間のパルス持続時間を変化させて電場を測定します。
      注：パルス持続時間が1ミリ秒であるときに測定した電界の均一性の例については、図5Dを参照してください。
  3. より複雑な電界形状を生成するためにバス電極の2直交対を使用し、へ異なる方向に電界を配向することができる（ 図6B参照 ）。電極の2対を有する装置が使用され、各電極対上の信号は、2つの別個のオシロスコープ上で観察されるであろう。
    1. 位置1ミリメートル培養上記と10の距離で電極 - 互いから11ミリメートル。両方の電極対が（ない接地接続を有していない）がフローティングされており、電極の任意のセットの間の抵抗を測定し、電極の間の短絡が存在しないことを検証することによって、任意の共通の基盤を持っていないことを確認してください。 （ 等オシロスコープ、増幅器、信号発生器、など）電極に接続されて使用される全ての機器は、すべての機器がフローティングされ、基準電極のどれも触れていないことを確認することにより、地面に対してフローティングされていることを確認任意の接地機器。
    2. 磁場配向を変更するために、解像度を持つ2つの電極対に供給される電圧の振幅を変化させます互いにPECT（ 図7A参照 ）。例えば、0°の使用のために他の電極用パターンと0 Vに対して垂直である電極対上に22 V、±。 45°の場合は、15.6 2 15.6 2 = 22 2の振幅のベクトル和のために、無位相遅れと電極の両方の対に15.6 V±使用。
    3. 回転磁界が電界を回転固定振幅を生成する正弦波電圧パルスの1つの波形と2つの電極対余弦電圧パルスの単一の波形を使用して適用する（ 図6B参照 ）。
      注： 図6Bに見ることができるように、他の電極に±22 Vと一方の電極と余弦波の一回の周期で±22 Vの正弦波の1サイクルを使用した場合、ベクトル和が有する回転電界であります正弦と余弦波と同様、および±22 Vの振幅と周期期間
  4. クロンを測定し、計算するために、AxieおよびRheobaseの神経細胞培養における軸索の樹状細胞と同じ培養物における樹状突起は、以下のステップを実行する。
    1. 薄い（170μm）、長さ（10mm）の線にパターンを描いた1D培養液を用いて、1.5の表に記載のようにカルシウムイメージングにカルシウム感受性蛍光色素を使用する。カルシウム感受性色素を培養物に適用し、45分間インキュベートする。染料は、新しい記録溶液と交換することによって洗浄される。
    2. シナプス伝達の影響を受けずに、電気刺激に対する直接応答の母集団統計を達成するためにネットワークを切断する。そのためには、γ-アミノ酪酸-A （GABA A ）受容体、6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオン（CNQX）受容体の阻害作用を遮断する40μMのビククリンと、 α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）およびカイニン酸受容体および20μMの（2R） - アミノ-5-ホスホノバールRIC酸（APV）、そのブロックN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体。ブロッカーは、記録液に追加されます。
    3. 2.1および2.3に記載したように100マイクロ秒と4秒の間の時間期間を変化させて方形パルスを印加します。信号をオシロスコープで観測することができます。
    4. いくつかの関心領域でカルシウムトランジェントの強度を監視する（1.5を参照）は、画像取得プログラムを用いて蛍光顕微鏡を使用して、数百のニューロンをそれぞれ含みます。少なくとも毎秒20枚のフレームの画像取得速度が可能な敏感EMCCDカメラを用いて画像を（材料のリストを参照）、取得することができます。光強度の変化は、刺激された神経細胞の量に比例します。強度の相対的変化を使用して刺激されたニューロンの割合を推定します。
    5. 各パルス持続時間（4ミリ秒〜100マイクロ秒）のために、目に、強度の変化が見られない電圧（数ボルト）から始まる電極に印加する電圧の振幅を変更します（22 V、±まで）による印加電圧の強度の変化が飽和したE電圧。
      注：強度変化は、電圧パルスのそれぞれの持続時間のための刺激のための印加電圧に対する累積ガウス5のように分配されます。
    6. 各期間のための印加電圧対強度の累積ガウス分布にフィットし、このフィットからガウス平均値を抽出します。
      注：この平均は、ニューロンが応答先の代表電圧です。
    7. このプロセスの終わりに、どのニューロンが応答する各刺激期間の平均電圧を得ます。強度・持続時間曲線をプロットする期間と強みのこれらのペアを使用します（ 図7を参照）。

文化の3磁気刺激

注意：磁気刺激のための基本的な設定は、図2に示されています。右上に表示されますニューロンにおける画像カルシウム感受性色素に用いられる倒立蛍光顕微鏡。磁気コイル（青丸）は同心神経環培養、（青のアウトライン）の上方約5mmに配置されます。ペトリ皿の周囲にピックアップコイル（赤丸）は、磁気パルスによって誘起された電圧を監視します。ピックアップコイルから集積左上に、5,000キロボルトのコンデンサ電圧負荷と磁気刺激装置（MS）コイルの測定された動態を示しています。磁界は青で示されているが（14mmのリング半径について計算）誘導電界は緑色で示されています。底にニューロン培養物の画像を示しています。左下にパターン化された24 mmのカバースリップの明視野像です。白い部分はニューロンです。撮影パターンは、異なる半径を有する同心円培養物から成ります。右下の個々のニューロンを示し、環の短いセグメント上のズームです。規模については、リングWID目には約200μmです。

  1. 1D培養刺激のための円形リングパターンにおけるニューロンの成長（1.2.5に記載されるようにエッチング）。薄い（170ミクロン）上にパターニング1D培養、長い（10mM）を行と（セクション1.5で説明したように）カルシウムイメージングのためにカルシウム感受性蛍光色素を使用します。
    1. 約5ミリメートル以下とコイルと同心ペトリ皿円形の磁気コイルと位置を使用します。 5キロボルトの最大電圧を負荷した自家製または商業MSによって駆動さL = 90 はmHのインダクタンスと約30ミリメートル（内径46 mmの外径）コイルのカスタムコイルを使用します。
    2. 磁気ニューロン培養物を刺激する高電流、高電圧スイッチを使用して導電コイルを介して高電圧及び電流を放電します。 5キロボルト- 21で説明したように、磁気刺激（MS）は、1の高電圧を得るために、100 mFでの順に、大きなコンデンサを使用して構築することができます。また、商業的使用利用できるMS（参照 材料/試薬の表 ）。
      注：自家製コイル21を製造するために厚さ0.254ミリメートルと6.35ミリメートルワイドポリエステルでコーティングされた長方形の銅線を使用します。エポキシ樹脂にガラス繊維とキャストで絶縁カスタムメイドフレーム上の配線をオン（ 材料/試薬の表を参照のこと）。あるいは（ 材料/試薬の表を参照）、市販のコイルを使用します。
  2. 2Dの文化を刺激するために回転磁界を使用してください。
  3. さて、2Dの文化を刺激するために回転磁界を使用しています。強度を有するコイル読み取りの線形相関を示すために、異なる強度で、皿にない培養でTMSを発射します。
  4. 次に、神経細胞培養でのカルシウムトランジェントを記録しながら、両方のカルシウムトランジェントとコイルを記録しながら、強度を増加させることTMSを焼成開始。まず、ネットワークバーストがsho、大きなカルシウムトランジェントとして観察しますULDと同期しないコイルTMSスパイクを拾います。ある時点で、強度を増加し続け、カルシウムトランジェントはTMSスパイクと同期なり始めます。あるいは、またはさらに、同期応答を達成した後、同期がTMS閾値を決定するために、廃止されるまで、強度を低下させる開始。
    注：条件は厳密に同じ船や正確なコイルの位置および向き、正確な量を毎回使用して、セットアップごとに一定に維持されるべきです。
    1. それは神経細胞培養に平行な面内で培養に対して固定位置にあるように記録ディッシュのベースにピックアップコイルを取り付けます。
      注：これは、磁石に対するピックアップコイルの位置の依存性は、培養の位置に忠実であることを確実に位置決めにおける矛盾がピックアップコイルの読みに無視できるであろうこと。
      1. 二つの独立したコイルを使用します回転磁界および誘導電界を生成する（ 図8B）互いに直交する配置。独自のMSに各コイルを接続します。刺激物質が〜270 V / M（ 図10B）の最大分野で実空間の270度を走査する回転磁界を生じる、90度（ 図10A）の位相遅れで同様の電流を放電することを確認してください。
      2. 外部記録溶液（EM）を充填した球状ガラス容器の内部ニューロン培養物を置き。
      3. ステップ2.4.4で説明したようにカメラで刺激（神経細胞の蛍光強度の変化）を監視します。
      4. クロスコイル（ 図8B）の場合には、ピックアップコイル平行およびニューロン培養下の特定の距離に位置します。慎重に実験を通してこの構成を維持。
  5. 解析的に1次元configuraための電界を計算E maxは誘導電界の最大振幅であり、半径rのリングの接線に沿って向けられているE マックス = K 1 Brの 、によってション。 Bは、磁気パルスの振幅であり、k 1は、ピックアップコイル（ 図8A）を用いて測定することができる三次元比例定数です。
  6. 数値的に電場21をシミュレートするために、（材料リストを参照してください）数値シミュレーションパッケージを使用してください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

提示プロトコルは、神経細胞培養の容易なパターニングが可能になります。それは私たちが刺激のために開発され、いくつかの方法と組み合わせると、それは、健康と病気のニューロン27の特性を比較するための関数としての文化を刺激するための最適な方法を見つけるために、そのような時値および基電流5のように、いくつかの固有のニューロンの特性の測定を行うことができますその構造と、より多くの斬新なアプローチ。いくつかの例を次の図に示されています。

図3に示します 図1Dは、バイオ拒絶層にエッチングされた構成をパターニングします。約170ミクロン幅の細い線は、典型的には、例えば、典型的には、変化する半径（ 図3A）又は平行線と同心リングできることが刻まれ〜11ム・ロング（

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

1Dパターニングは、様々な用途に使用することができる重要なツールです。例えば、我々は、ラット海馬ニューロン5のクロナキシーおよび基電流を測定するために、より最近ニューロン培養物29からの論理ゲートを作成するための1次元パターニングを使用している、とと比較してダウン症候群海馬ニューロンにおける発火活動の信号伝搬速度の減速します野生型（WT）海馬ニューロン27。 1Dパターニングの推奨プロトコルは、ロバストであり、任意の所望のパターンを形成することが容易です。私たちは、測定がその機能に影響を与える可能性があるネットワークの任意の可能な切断、を認識する前に、1D文化を観察することをお勧めします。

ニューロンの構成のケミカルパターニングを区別履歴30、31、32を

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

著者たちは、Ofer Feinerman、Fred Wolf、Menahem Segal、Andreas Neef、Eitan Reuvenyに非常に有益な議論に感謝します。著者は、この技術の初期バージョンの開発について、Ilan BreskinとJordi Sorianoに感謝します。作者は理論的概念の助けを借りてTsvi TlustyとJean-Pierre Eckmannに感謝します。この研究は、ミネルバ財団、イスラエル科学技術省、イスラエル科学財団助成金1320/09およびバイナショナル科学財団助成金2008331によって支援された。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
APVSigma-AldrichA8054ネットワークを切断します。セクション2.4.2
B27 suppGibco17504-044メッキ媒体で言及されています。セクション1.1.1で言及
bicucullineSigma-Aldrich14343を切断します。セクション2.4.2で言及されている
ホウ砂(四ホウ酸ナトリウム十水和物)Sigma-AldrichS9640ホウ酸緩衝液。セクション1.1.2で言及
ホウ酸Frutarom Ltd5550710ホウ酸緩衝液。セクション1.1.2で言及
CaCl2、1 MFluka 21098細胞外記録ソリューション。セクション1.5.2CNQX
Sigma-AldrichC239ネットワークを切断します。セクション 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5数値シミュレーションで言及されています。セクション3.5.2で言及
D-(+)-グルコース、1 MSigma-Aldrich65146めっき培地、細胞外記録溶液。セクション1.1.1および1.5.2
D-PBSSigma-AldrichD8537。セクション 1.2.4 および 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029めっき媒体に記載されています。セクション1.1.1
ブロネクチンSigma-AldrichF1141。セクション1.2.6
Fluo4AM、生命技術、F14201自発的または誘発された活動のイメージングで言及されています。セクション1.5.1、1.5.3、および1.5.5FUDR
Sigma-AldrichF0503。セクション1.4.1
ジェンタマイシンSigma-AldrichG1272メッキ媒体、チェンジングメディウム、ファイナルメディウムで言及されています。セクション 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038めっき媒体、交換媒体、最終媒体で言及されています。セクション1.1.1
Hepes、1 MSigma-AldrichH0887外記録溶液で言及されています。セクション1.5.2
HI HSBI04-124-1Aメッキ媒体、交換媒体、最終媒体で言及されています。セクション1.1.1、1.4.1、および1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000Extracellular recording solutionで言及されています。セクション1.5.2で言及
Laminin シグマ・アルドリッチL2020バイオコーティング。セクション 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022めっき媒体、交換媒体、最終媒体で言及されています。セクション1.4.1 で言及されています。  1.4.2
MgCl2、1 MSigma-AldrichM1028細胞外記録溶液。セクション1.5.2
NaCl、4 MBio-Lab19030591細胞外記録溶液で言及されています。セクション1.5.2
オクタデカンチオールSigma-Aldrich01858Cr-Auコーティングカバースリップ(1D培養)のクリーニングで言及されています。セクション1.2.3で言及
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation 50475278バイオリジェクションコーティング、バイオコーティング。セクション1.2.4および1.2.6で言及
ポリ-L-リジン0.01%溶液 シグマ・アルドリッチ P47075細胞分裂の促進。セクション1.1.4
糖、1 MSigma-AldrichS1888外記録溶液で言及されています。セクション1.5.2
オール で言及されています。Sigma-Aldrich1858バイオリジェクションコーティング。セクション1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750Changing mediumで言及されています。セクション1.4.1で言及
されているスパッタリングマシンAJAインターナショナル株式会社ATC Orion-5シリーズ ガラスを薄い金属層でコーティングします。セクション1.2.2
プロッターで言及されています ヒューレット・パッカード HP 7475Aはコーティングされたカバースリップに模様のエッチング。セクション1.2.5
ワイヤーで言及されています AMシステム、カールスボーWA767000ニューロン培養の電気刺激。セクション2.1、2.2、2.3、および2.4.5
発生器BKPrecision4079電気信号の整形で言及されています。セクション2.3で言及
Amplifier電圧 amp信号発生器から電極への信号の増幅。セクション2.3
電源マトリックス で言及されています。MPS-3005 LK-3 スパッタリング装置への電源供給セクション1.2.2.3
経頭蓋磁気刺激スティム、スプリングガーデン、英国ラピッド2ニューロン培養の磁気刺激で言及。セクション3.1、3.3、および3.4
EpoxyCognisVersamid 140コイルの鋳造で言及されています。セクション3.4
エポキシシェルEPON 815で言及されています。自家製コイルの鋳造。セクション3.4で言及されている
プラチナワイヤー0.005インチの厚さ。A-M Systems,  カールスボーWA 767000ニューロン培養の電気刺激。セクション2.1で言及
円形磁気コイル自家製培養の磁気刺激。セクション3.3
WaveXpress SWB&で言及Kプレシジョン 波形編集ソフト。セクション2.1.32
Xion Ultra 897AndorSensitive EMCCDカメラで言及されています。セクション2.4.4で言及
されているネットワークされているされていますに記載されているされている細胞培養で言及されていますフィバイオコーティングで言及されています、、交換媒体で言及されています細胞されています されています されているショ細胞チペン電極信号されている 自家製マグ自家製されたニューロン

参考文献

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577(2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287(2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794(2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680(2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

神経細胞培養電気刺激磁気刺激一次元培養パターン化神経ネットワーク外部電場電極構成磁気パルス生成強度-時間曲線
電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。