方法論記事

土壌中の微生物のリン脂質脂肪酸の抽出と分析

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DOI:

10.3791/54360

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2016年8月26日

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1Department of Renewable Resources, University of Alberta, 2Department of Science, Augustana Faculty, University of Alberta, 3Laboratoire Génie Civil et géo-Environnement, Université de Lille, 4Department of Earth and Environmental Sciences, Mount Royal University, 5Forest Ecology & Production, Great Lakes Forestry Centre, Natural Resources Canada

この記事について

サマリー

リン脂質脂肪酸は土壌微生物群集の構造に関する情報を提供します。我々は、単相クロロホルムの混合物で土壌サンプルからの抽出、固相抽出カラムを用いて抽出された脂質の分画、およびキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析された脂肪酸メチルエステルを生成するためのメタノリシスのための方法を提示します。

要約

リン脂質脂肪酸（PLFAs）は、微生物の細胞膜の重要な構成要素です。土壌から抽出されたPLFAsの分析は、地上微生物群集の全体構造に関する情報を提供することができます。 PLFAプロファイリングは広く、全体的な土壌の質の生物学的指標としての生態系の範囲で使用されており、土壌応答の定量的指標として管理し、他の環境ストレスを着陸させます。

単相クロロホルム混合物と土壌サンプルから1脂質抽出、他の抽出脂質からリン脂質を分離するために固相抽出カラムを使用して2分画、脂肪酸を生成するためのリン脂質の3メタノリシス：ここで紹介する標準的な方法は、4つの重要な手順を説明しますメチルエステル（FAME）、および水素炎イオン化検出器（GC-FID）を用いて、キャピラリーガスクロマトグラフィーによる4 FAME分析。次の2つの規格は、1,2- dinonadecanoyl- のsn -glycero-3ホスホコリン（PC（19含めて、使用されています0/19：0）はGC分析用の内部標準（ISTD）として：0））の抽出方法の全体的な回復を評価するため、及びデカン酸メチル（MeC10。

概要

リン脂質脂肪酸（PLFAs）は、ドメインの細菌や真核生物の微生物の細胞膜の一部です。微生物は、その直接の環境条件に応答して細胞膜の完全性と細胞機能を維持するための手段として、異なる鎖長および組成のPLFAsを生成します。したがって、地理的に離れているが、同様の土壌条件に供される微生物群集が同様PLFAsを発現することを主張することができます。 14および20個の炭素原子の間の鎖長を有する土壌PLFAsは、典型的には、主に細菌および真菌起源1であると考えられます。混合培養において、PLFA分析は、個々の微生物種を同定するために使用することができないが、それは土壌中に見出さ微生物群集の全体的な指紋を提供することができます。 PLFAsが急速に細胞死の際に分解されるので、また、それらは、生存可能な土壌微生物コミュニティ2の代表であると考えることができます。このテックhniqueは広く森林3-4から5-6草原や農業分野7までの範囲の、幅広い環境で見出さ微生物群集の構造組成を特徴付けるために使用されてきました。それは成功し、火災13、金属14と炭化水素15による汚染、および昆虫勃発16などの森林、石灰9、8切削クリア干拓10-12と同様に、外乱を含め、管理の変更を土地に土壌の応答を特徴付けるに適用されています。

現代的なPLFA分析方法は、多数の研究グループにより、いくつかの重要な進歩を経て、最後の60年の間に進化しました。二相性システム17に単相から混合物をシフトするために抽出溶液中の水の比率：メタノール：1958年に、有意な改善がクロロホルムを調整から生じました。この最適化された脂質抽出および改訂されたアイソレーションプロトコールはブライとダイアーの方法として知られるようになりました。プロトコルは、今後数十年にわたって多くの研究室で採択されたと、この時間の間に、白と同僚は、メソッドに重要な進歩に貢献しました。例えば、それらは、水、リン酸緩衝液を交換することにより抽出工程を改善し、そしてそれらは、拡張ピーク同定及び定量化を介して、ガスクロマトグラフィー（GC）による分析を最適化しました。おそらく、土壌学へのより関連性の、彼らは海 ​​洋堆積物18の微生物バイオマスを調べたときに抽出された脂質は、微生物の構造の指標として使用することができることを1979年に決定しました。

この方法は、特に根圏19に関連して、より広く利用されている土壌学におけるなったとしてさらなる発展は、1980年代に発生しました。その際、この方法は、メチルノナデカン含まれる（MeC19：0）を内部標準19および脂質分画21 <ためのケイ酸カラムの使用など/ SUP>。白19,21との仕事に続いて、Tunlidはスウェーデンに戻り、バースやFrostegårdとの共同研究を開始しました。有機物含有量が異なる土壌のスイートの異なる抽出バッファーの効率を調べることによって、グループはクエン酸緩衝液は、リン酸緩衝液22に比べて抽出した脂質のリン酸の量を増加させたことを示しました。また、土壌微生物コミュニティに石灰の影響に関する彼らの1993年出版物23は、 土壌生物学＆生化学 24で引用古典になるために行ってきました。研究者は、データ処理における主成分分析を利用しました。 PLFA分析は、メソッドがと呼ばれるようになりましたように、大規模なデータセットを生成し、これらのデータを処理するために、多変量統計手順の使用は非常に時間のための革新的な、多くのインスピレーションでした。スウェーデンで行われている作業に並行して、PLFAプロシージャへの変更はで調査されていましたドイツによってZellesや同僚25-26。手順のそのバージョンは、全体的な、より多くの研究室が集中た、固相抽出（SPE）カラムの代わりに、ケイ酸カラムの使用のために顕著であったが。

Frostegårdの論文23は 、ホワイト＆Ringelberg 27による詳細な方法論とともに、土壌科学の基本的な質問を調査するPLFA技術の使用中の爆発のための基盤を提供しました。それ以来、ファイアストンらによる方法の更なる改良は、内部GC標準の追加が含まれている（C10：0）とC19：0定量28を改善するためのサロゲート標準として、および簡素化するために、丸底バイアルのための分別ファンネルの使用を置き換えます抽出29。最近では、チョードリー氏とディック30は、メチル化工程を調査し、土壌学の文献KOH /メタノール方式のidentで使用される2つのメチル化手順のことを報告しました脂肪酸のより大きな範囲をified。

提示された方法は、主にブライとダイアーによって開発された元のメソッドに基づいて、そのようなメチル化工程のためのメタノール性KOHの使用など、上記の修正が組み込まれています。前の最初の抽出土壌サンプルに添加される、1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（0）：0/19 PC（19）のサロゲート標準の次の2つの規格は、各サンプルのために使用され、GCによって事前に同定および定量に追加されます：効率性と回復プロトコル全体の、およびデカン酸メチル（0 MeC10）の機器の標準を評価しました。

我々はPLFA法は、一般的に世界中の多くの微生物生態学研究所によって使用され、標準化2国際機関によるものを含め、何度も実証されていることを認めます。本稿の目的は、土壌に役立ちます従うことが簡単かつ堅牢なプロトコルを提示することですPLFA技術を習得しようとしている科学者。

プロトコル

注：必ず、適切な個人用保護具（P​​PE）は、プロトコル全体に着用されていることを確認してください。ガラス製品は素手で触れないようにしてください。指、毛、グリース、油および炭化水素からの脂質は、すべての潜在的な汚染物質です。きれいなガラス製品を取り扱う際には、必ず70％アルコールでニトリル手袋とリンス手袋を着用してください。

分析用ガラス器具の作製

  1. 使い捨てガラス製品（ 例えば 、遠心分離管）
    1. 450ºCで4時間半マッフル炉でアルミ箔と熱で包みます。
  2. ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）はキャップを-lined
    1. リン酸洗剤中で1時間キャップを浸し、その後、熱水およびリン酸洗剤で洗浄ブラシで洗浄します。水道水で石鹸を洗い流します。
    2. 彼らはあまりにも長い間浸漬した場合のライナーは、キャップの外に落ちることとしてだけで1時間酸浴中でプレイス（5％HCl）は（長く放置しないでください。3回すすぎ水道水インチ蒸留水で3回洗浄します。 40ºCのオーブンで乾燥しました。
  3. 再利用可能なガラス製品（ 例えば 、10ミリリットル、15ミリリットル、45ミリリットルバイアル/ジャー）
    1. お湯とリン酸洗剤での洗浄ブラシで洗浄します。酸浴（5％のHCl）で一晩中、水道水と場所との石鹸を洗い流します。 40ºCのオーブン中で乾燥した後、蒸留水で3回すすぎ、その後、水道水で3回すすいでください。
    2. きれいなアルミホイルで包む（50ミリリットルの瓶は、個別包装され、他のガラス製品は、サンプルバッチでラップされ、 例えば 、20）と450ºCで4時間半のためのマッフル炉内の熱。
  4. 体積ガラス製品（ 例えば 、メスフラスコ）
    1. お湯とリン酸洗剤での洗浄ブラシで洗浄します。酸浴（5％のHCl）で一晩中、水道水と場所との石鹸を洗い流します。 、水道水で3回すすぎ、蒸留水で3回リンスし、次いで乾燥オーブン中で40 AT＆＃186; C。
    2. マッフル炉で容積ガラス器具を置かないでください-少量の溶媒（ 例えば 、メタノール）で3回すすぎ使用前に。

土壌サンプルの2収集および処理PLFA分析の前に

  1. 滅菌バッグに土壌サンプルを収集し、これらはすぐに分析することができない限り、できるだけ早くそれらを凍結。直前まで冷凍庫（-80ºC）で保管サンプルは、サンプルの凍結乾燥を続行します。凍結乾燥機の指示に従い、サンプルの乾燥バッチを凍結。
  2. 新しい標識滅菌バッグに各凍結乾燥サンプルを転送します。 PLFA抽出のための事前標識こもり遠心管に袋に凍結乾燥物質から試料を秤量。
    注：一般的なガイドラインは、有機材料（炭素含有量> 17重量％）のために、ミネラル土壌サンプルの3.0グラムまでの0.5グラムを使用することです。各サンプルの録音サンプル重量。
  3. すべての10のサンプルについて、また、秤量分析のために、すべての20の試料のための追加の重複は、ブランク（ すなわち 、その中の任意のサンプルを持っていない遠心チューブ- PLFA抽出プロセス中の任意の潜在的な汚染を識別するための対照として使用します）。同時に試料管のプロセスのバッチ。
    注：20のサンプルのセットは、23の試料管（サンプル1〜10、サンプル10の1つの重複、サンプル12〜22、試料22、及び23の試料管の1つのブランク=バッチの重複）のバッチに対応します。
    注：GC分析のためにそれらを準備し、それらのすべてを実行する前に、サンプルのバッチで、その後、その後、抽出、分離、メチル化を実施します。これは、何かがうまくいかない、と必要な繰り返し抽出数を下げるに役立つ可能性がある場合間違いが起こった場所を特定するのに役立ちます。

3. PLFAテクニック（手順は、個々のサンプルのためのものですが、一度に一つのバッチ全体を完了）

注：手順で説明したPLFA技術のすべてのステップ1-3は、以下の適切なPPEを使用し、ラボの安全に関する注意事項を以下のドラフト内で行われるべきです。

  1. 抽出（ステップ1）。
    1. 50mlの蒸留KOHの14グラムを溶解することにより、5.0 M KOHを準備し、脱イオン水（のdH 2 O）。
    2. dH 2 O 400mlに31.52グラムのクエン酸一水和物を溶解し、0.15Mクエン酸緩衝液を調製します5.0 M KOHを加えてpHを4.00±0.02に調整します。約5.0 M KOH 45-50 mlを4.00にpHを調整する必要があります。 pHを調整すると、容量フラスコを用いて、1,000 mlのクエン酸緩衝液を希釈します。使用していない（最長1ヶ月間）冷蔵庫にクエン酸緩衝液を保管してください。
    3. （これは23サンプルのバッチのための十分なサロゲート標準を提供します）25ミリリットルのクロロホルム中のストック溶液（10mg / ml）250μlの希釈してノナデカンサロゲート標準毎日PC（0：0/19 19）を準備します。 PCの0.5ミリリットルを追加（19：0/19：0）のサンプルの遠心チューブにサロゲート標準溶液。
    4. Aⅰ）2.0ミリリットルクエン酸緩衝液、ⅱ）2.5ミリリットルのクロロホルム、およびiii）5.0ミリリットルのメタノール：次の順序で土壌サンプルへブライとダイアー抽出をddを。 30秒間PTFE内張りキャップと渦とキャップサンプル; 2時間転倒混和振盪機に配置します。
    5. 上のキャップで15分間、226×gで遠心分離します。パスツールピペットで上清をオフに描画し、ラベルされた45ミリリットルのガラスバイアルに移します。
    6. 各サンプルにブライとダイアー抽出剤の第二ラウンドを追加し、上記の手順4と5を繰り返します。パスツールピペットで上清をオフに描画し、同じラベルされた45ミリリットルのガラスバイアルに移します。
    7. クエン酸緩衝液I）5.0ミリリットルのクロロホルム、およびii）5.0ミリリットル：上清を含む標識45ミリリットルのガラスバイアルに追加します。 30秒間白PTFE内張りキャップと渦ガラスバイアルとキャップ。 （酸化を避けるために）それは暗所で室温で一晩放置します。
    8. 慎重に45ミリリットルバイアルの上部の水相（ない真空が利用可能でない場合、ピペットはaqueを通じて低下しなければならないをオフに真空有機相をピペッティングする際、ピペット内の任意のを収集しないように非常に注意深くなどのOU相）。ラベルされた15ミリリットルバイアルにピペット低い有機相。
    9. 室温で圧縮されたN 2下、15ミリリットルバイアルの場所バッチ（酸化を避けるため）。バイアル内の液体の表面フリルが、バイアルの側面を登るしないように、N 2フローを設定して、ゆっくりとクロロホルムを蒸発。
    10. ステップ2に進んで準備ができるまで（個別にではなくバッチでラップ）アルミホイルに包んで-20ºCの冷凍庫にPTFE内張りキャップや店舗サンプルにねじ込みます。
  2. 脂質分画（ステップ2）
    1. ガラスタンクにスピゴットとSPEカラムホルダーを配置します。差込口に新しいSPEカラム（シリカ、500 mgを、6ミリリットル）を挿入します。 （サンプルを混合を避けるためにお勧めします）、必要に応じてラベル列。
    2. （アセトンの5ミリリットルを追加し、それはを通して排水させることで、各列を調整してから、5ミリリットルのクロロホルムの2つの加算を追加総容量= 10mL）で。第クロロホルム洗浄がフリット上記〜1ミリメートルまで流出した後、栓を閉めることを許可します。
    3. 優しくバイアル、ボルテックスする0.5ミリリットルのクロロホルムを添加することにより、（ステップ1の終了時に15ミリリットルバイアルに保存された）サンプルを再溶解します。転送パスツールピペットを用いて、SPEカラムに試料を再溶解しました。 2転送（サンプル当たり1ミリリットルのクロロホルムの総転送量）の合計のために繰り返します。
    4. カラムの中心に直接脂質サンプルを置き、タンクに完全に排水するための溶剤ができます。
    5. 各カラムにクロロホルム5mlを添加することにより中性脂質を溶出させます。タンク内に完全に排水するための溶剤を許可します。
    6. 各カラムに5mlのアセトンを添加することにより脂質を溶出させます。収集タンクに完全に流出する溶媒を許可します。
    7. 列を削除するタンクから立って、真空装置でタンクを排水。タンクにクリーンで標識された遠心分離管にラックを挿入します。タンク上のカラムスタンドを取り付けます。上記表示した列は、標識されたCENTRで並ぶ必要があります以下ifugeチューブ。
    8. 各カラムに5mlのメタノールを添加することによって、遠心管にリン脂質を溶出させます。 SPEカラムがそれらを処分する前に、ドラフト内で完全に乾くまで待ってください。圧縮されたN 2下、室温でドライダウンのリン脂質画分。
    9. ステップ3に進んで準備ができるまでアルミホイルに包んで-20ºCで冷凍庫中のPTFE内張りキャップと店舗サンプル上のN 2ネジ（個別にではなくバッチでラップ）でパージチューブ。
  3. 脂質メチル化（ステップ3）。
    1. 37ºCに設定湯浴をオンにします。千ミリリットルのメスフラスコを用いて、千ミリリットルのdH 2 Oで57.1ミリリットルの氷酢酸を溶解させることによって（すでに行われていない場合）、1M酢酸を準備します。この溶液は、最大3ヶ月間室温で保存することができます。 。
    2. メタノール性KOHのバッチを準備します。 40ミリリットルのメタノールに0.45グラムのKOHを溶解させることによって、0.2M KOH溶液を準備します。に従ってKOHの量とメタノールを調整しますステップ3でnticipatedバッチサイズは、毎日この溶液を調製します。長期間保管しないでください。
    3. 冷凍庫から（ステップ2の後に格納されている遠心管のように）サンプルを削除し、サンプルは室温にさせます。 1.0ミリリットルのメタノールKOH続いて、各サンプルに0.5ミリリットルのクロロホルムおよび0.5ミリリットルのメタノールを追加します。キャップチューブしっかりPTFEで裏打ちキャップを有します。混合する渦巻。
    4. 30分間37ºC浴中に密封されたサンプルを置きます。水位が試料液のレベルより上の1〜2ミリメートルの最小値であることを確認してください。削除して、サンプルを冷却することができます。サンプルは、水浴中であるが、サンプルのID（PTFE内張りキャップで10mlのガラスバイアル）で小さなガラスバイアルにラベルを付けます。
    5. 各サンプルとスワールに2.0ミリリットルのヘキサンを追加します。その後、再び混合するために、各サンプルとスワールに1.0 M酢酸0.2ミリリットルを追加します。相分離が見えるようになるはずです。
    6. 相を破るために各サンプルにのdH 2 Oの2.0ミリリットルを追加します。 30秒間ボルテックスサンプル。その後、2分間226×gで遠心分離サンプル。
    7. 使い方ショートパスツールピペット、標識された10ミリリットルバイアルをきれいにする上相を転送します。下部（水）相のいずれかを転送しないように注意してください。
    8. 各サンプルの遠心分離管やスワールに2.0ミリリットルのヘキサンを追加します。 30秒間ボルテックスサンプル。その後、2分間226×gで遠心分離サンプル。
    9. ショートパスツールピペットを用いて、再度標識10mlのガラスバイアルに上相を加えます。
    10. N 2下、室温で標識された10ミリリットルガラスバイアル中の溶媒蒸発させます。 GC分析を進める準備ができるまで（個別にではなくバッチでラップ）アルミホイルに包んで-20ºCの冷凍庫にPTFE内張りキャップや店舗サンプルにねじ込みます。すべてのサンプルにラベルを付けてください。
  4. ガスクロマトグラフ（GC）分析
    注：個々のPLFAsの同定および定量化は、FIDまたはMS検出器のいずれかに接続されたGCを使用して達成されます。命令は以下のGC-FIDのためであるが、試料調製は、GC-MSに有効であろうWとしてエル。 285ºCへの初期温度190ºC、ランプ10ºC/分：GC-FIDシステムの例のセット​​アップは、以下の温度プロトコルで0.33ミクロン（5％ - フェニル） - メチル列×0.2ミリメートル×25メートルを含むであろう、0.42分31を保持し 、310ºCに9.5分、ランプ60ºC/分を保持します。
    1. （レコードが0.1 mgの重量を追加しました）100ミリリットルのヘキサンに0（デカン酸メチル）：MeC10の一滴を追加することにより、GC内部標準（ISTD）を準備します。 GCへのガスをオンにしてから、GCの電源をオンにします。 H 2は 、N 2とエアシリンダがオープンし、分析を実行するのに十分なガスが存在することがあることを確認します（H 2は 500 psiの下に取得することはありません）。
    2. 良いキャリブレーションの条件はヘキサン空白が続く脂肪酸の混合物を含むキャリブレーション標準を実行することによって満たされていることを確認してください。個々の脂肪酸の同一性は、手作業での標準について得られた保持時間との比較に基づいて割り当てることができ、またはこれはAUTOMATICAすることができLLY市販のソフトウェア31を使用して割り当てられました。全ての場合において、明確な同定は、MS検出器2を用いて達成することができます。
      注：良いキャリブレーションの追加の兆候は平らなベースラインとヘキサンリンスで無汚染が含まれます。
    3. サンプル応答が弱いことが予想される場合（あるいは、そのような非常にのように、50〜75マイクロリットルを使用ISTD溶液​​150μl中（脂質メチル化ステップ3から10mlのガラスバイアル中に含まれている）各PLFAサンプル残留物を溶解し、GCバ​​イアルに移します砂質土）。
    4. 2μLのサンプルの注入量を設定します。 300ºCにFID温度を設定します。キャリアガス（流速1.3 ml /分）、30の分割比としてH 2を用いて、250ºCの入口温度を使用して、サンプルを実行する：1。

結果

脂肪酸は、Xとして指定される：Xは、炭素原子の数を表しYωZは、Yは二重結合の数を表し、そしてZは、分子の脂肪族（ω）端から最初の二重結合の位置を示しています。接尾辞 'C'と 't'は、シスおよびトランス幾何異性体を示しています。接頭辞と接尾辞「a」及び「i 'をアンテイソおよびイソ分岐やMeおよびOH、それぞれ、メチル基と水酸基を指定するために参照してください。

ポストGCラン、サンプルは10を見て、適切なISTDを受け取ったことを確認してください：0ピーク。また、GC標準の応答を確認し、 すなわち 、追加されたISTD溶液とヘキサンを含むバイアル;これらは、他のピークを持つべきではありません。内部標準応答はすべての実行を通じて類似していなければなりません。

図1は representaを提示します的なサンプル実行。大ヘキサン溶媒ピークは特徴1.8分の周りの保持​​時間（RT）で表示されます。 ISTD標準ピーク（C10：0）C19ながら、3.4分のRTで表示されます：0は、16.2分のRTを持っています。 GC分析は、より長い鎖がよりゆっくりと溶出すると、それらの鎖長、に基づいPLFAsを分離します。例えば、C18：C16ながら、0は14.4分で溶出：0は10.8分で溶出します。また、この分析プロトコルは、不飽和およびそれらの二重結合の位置の度合いに基づいてPLFAsを分離することができます。 1図9c、及びC18：それぞれ14.0および14.1分で1 7cの溶出、（ 図1）は、例えば、C18：しばらくC18 0は、14.4分で溶出します。最後に、同様の鎖長および飽和度が異なる分岐設定（アンテイソ対イソ）のPLFAsを分離することができます。例えば、C15：0IとC15：それぞれ8.6および8.7分、で0Aの溶出（ 図1）。

別のGCピークの面積は、IMとすることができますさらに、ガスクロマトグラムの情報を処理するためにスプレッドシートに移植。識別された各PLFAは、（ナノモルg乾燥土壌の-1）以下の式を用いて定量化されています。

figure-results-1

Fは、アカウントFID選択および脂肪酸32との間のモル濃度の違いを考慮に入れるの調整係数であり、areaPLFAが識別された各PLFA、areaC10のピーク面積は、次のとおりです。0はISTDのピーク面積である（MeC10：0）、C10：0 stdが追加されたISTDの量（ナノモル）比、前GCの実行に各試料に添​​加される（C19：0のstd追加/ C19：0サンプルは）PC（O：0 / C19 C19）の回復に対応サロゲート標準、サンプル重量はオーブン乾燥土壌（G）の量は、元のサンプルの遠心分離管に添加し、PLFAsを抽出するために使用されます。

注：differe下の面積ピークは、ピーク面積、GCシステムによって応答または応答％として表されるNT。土壌PLFAの特徴付けに関連する範囲内で、領域は、脂肪酸の重量に対して直線的に比例すると仮定することができます。あるいは、小さな補正係数は、FID選択32を考慮して適用することができます。結果は、最初重量パーセント基準で表されているので、また、それらは、モル量を得るために正規化される必要があります。アカウントに個々の脂肪酸の分子量をとることによって達成されるモル濃度差を調整します。パブリッシュされたテーブル32と商用ソフトウェア31はまた、モル濃度のために正規化する際に支援する用意されています。

ISTDの量（ナノモル）をさらにように計算することができる各試料に添​​加しました。

C10：V×= [ISTD]追加0std（STDが追加しました）

[ISTD]は濃度MeC10の（ナノモルリットル-1）である場合：0（デカン酸メチル）ヘキサンに溶解させ（ステップ3.4.1を参照）、およびVは（STDが追加された）ボリュームです準備ISTD液の（L）は、GCの実行前に各サンプルに加え（ すなわち 、3.4.4のステップに応じて150μlの）。

C19の量：0（ナノモル）GC分析中に各試料中に存在するはに対応します。

figure-results-2

areaC19ここで：0（ナノモル）PLFA抽出法（参照のステップ3.1.3）の開始時に各サンプルに添加される：C19の対応する量は、一方で、O：0は、C19のピーク面積であります：

figure-results-3

ここで、[19：0] 基準色 （mgのL -1 ）でのsupはC19の濃度でクロロホルムに溶解させ0ノナデカンサロゲート標準（ステップ3.1.3）、Vは（19：0 STDを添加）を調製サロゲート標準の体積はPLFA抽出の開始時に各試料に添加します方法（参照ステップ3.1.3）、M 19：0は、1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（：0/19：0）、PC（19）の分子量です。

注：C19の1モル：0ノナデカンサロゲート標準利回りC19の2モル：0メチル化工程の後に、C10ながら：0規格は、メチル化の後に追加されます。

次PLFAsは、典型的には、土壌微生物群集の解析から除外されています。長さが<14 Cおよび> 20℃であるI）PLFAs、およびii）PLFAsピーク面積で全体の0.5％未満で。これらPLFAsが除外された後、残りのPLFAsのすべてから応答が総PLFA双方向を得るために要約することができますomass（乾燥土壌のナノモルグラム-1）。 PLFAデータの単変量解析（ 例えば 、ANOVA、実行されるテストの仮定を満たすために必要に応じてデータ変換を以下）は、全PLFAバイオマスおよび/ ​​または試料群/処理のうち選択されたグループのPLFAバイオマスを比較するために使用することができます。例えば、 図2のプレゼントのような直鎖飽和PLFAs、中鎖（10-メチル）またはターミナル分岐のいずれかで飽和PLFAs、およびモノ-または多価不飽和PLFAsなど異なるPLFAグループの相対的な分布の結果と同様に、総PLFAsの合計（乾燥土壌のナノモルグラム-1）。この特定の例では、（サイト1のサイト3に減少）樹木の年齢は、総PLFAsと異なるPLFAグループの相対的分布の両方に影響を与えることが分かります。

サンプル間PLFA組成物中の全体的なパターンを評価するために、すべてのPLFAsの多変量解析はconduすることができます33を CTED。 PLFAデータは、ヘリンガー変換は、多くの場合、データを相対化するために使用される例えば 、アドレス指定されている統計的な試験研究の質問の前提条件を満たすように前に選択多変量解析に必要に応じて変換する必要がある。非から3の結果を示す図 図2で使用したのと同じデータの-metric多次元スケーリング（NMDS）叙階。 NMDS 2-またはサンプル間のスコアランキングの類似性に基づいてデータ点の3次元位置を生成するノンパラメトリック、多変量技術です。

figure-results-4
図1 の代表的なGC-FIDクロマトグラム。培養ブラウンChernozemic土壌から得られた試料は、この分析に使用しました。保持時間とそれに対応するPLFAs（括弧内）と、それらのピーク面積（PA）A再代表ピークの図に示されています。この特定のサンプルが33識別さPLFAsをもたらしたが、明確にするために、すべてのピークは、図に示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-5
PLFAs（総PLFAsの％）の6異なるクラスの 図2. 相対的な豊かさ、および総PLFAバイオマス（ナノモルグラム-1 森林Luvisolic土壌から乾燥土壌の）。サンプルは、この分析に使用しました。結果は、中間高齢者（25歳）に続いて、古い木（> 50歳）の下に配置されているサイト1、の土壌のためのより大きな総PLFAs、木（サイト2）を示し、最後に最年少（10歳）の木（サイト3）。比較的多くの飽和PLFAsは最年少で存在していますサイト、それ以上の不飽和PLFAsは最古の部位に存在している間。エラーバーは標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-6
PLFAsの 図3. 非計量的多次元尺度法（NMDS）按手軸2および3次元の解の3（合計PLFAsデータの％を使用して）。この按手を図2に使用したものと同じデータを用いて計算した。ザ・最年少のサイト（サイト3）は、それらのPLFA微生物群集組成物にオーバーラップを示し古い二つのサイト（サイト2及び3）、から非常に明確に分離します。カッコ内に含まれる各軸によって説明PLFAコミュニティデータの変化量;変動72.5％が3-DIMENために、これら二つの軸によって説明されますsional NMDSソリューション。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

土壌微生物コミュニティで発見されたいくつかのPLFAsはまた、植物の根、藻類、および土壌動物などの単一および多真核生物に存在しているため、最小限に抑え、PLFAデータの誤解を避けるために、慎重なデータのスクリーニングを行う必要があります。また、 古細菌は PLFAsが含まれていません。代わりに、古細菌の膜はリン脂質エーテル脂質（PLELs）で構成されています。したがって、PLFAプロトコルは、土壌中の古細菌コミュニティを特徴づけるために使用することができません。

特定の微生物のグループに個々のPLFAsの関連付け（PLFA法の制限のいくつかの優れた議論についてFrostegårdや同僚34によって2011年出版物を参照）慎重に行使しなければなりません。代わりに、それらの化学構造に基づいてグループPLFAsに、 図2で行ったように、それは、より適切であるかもしれない、例えば 、I）、直鎖飽和PLFAs、ミッドチャイとii）の飽和PLFAsN（10-メチル）分岐、III）末端分枝飽和脂肪酸、IV）モノ不飽和PLFAs、v）の多不飽和PLFAs、およびVI）ヒドロキシ脂肪酸。

試料重量は、与えられた土壌試料中に含まれる抽出PLFAsの量に基づいて調整する必要があるかもしれません。少ない微生物アクティブな土壌で抽出された土壌の量を調整しないことにより、ユーザは正確に全体的な微生物群集を表現するPLFA応答（ピーク）の十分な数を取得していないの危険にさらされています。 PLFAsの高濃度の高い微生物アクティブな土壌では、ユーザーはそれによってPLFAsの正確な定量化を防止し、GCカラムの過負荷の危険にさらされています。両方の場合において、土壌試料はPLFAsについて再分析しなければなりません。良い出発点は、（このような森林の床など）の有機土壌サンプルの0.5グラム、およびミネラルの土壌試料については約3グラムを追加することです。抽出可能PLFAsの量は、典型的には、サンプル我々、土壌に含まれる有機炭素の量に相関しているので、IGHTは、土壌炭素含有量に基づいて調整することができ、炭素含有量が≦0.5である場合> 5 gが必要かもしれないが、例えば 、鉱物土試料1gは、炭素含有量が10〜15％である場合に良好なPLFA定量化を得るのに十分であってもよいです％。常に全体のセットが実行される前に、サンプル重量を最適化するために、いくつかのサンプルで試運転を行うには良いアイデアです。

次のようにPLFAプロトコルおよびGC分析のための一般的なトラブルシューティング戦略があります。 GCクロマトグラムのベースラインが高すぎる場合には、H 2ガスボンベを変更する必要があります。溶媒またはISTDピークがクロマトグラムから欠落している場合は、試料注入に問題がある可能性があり（ 例えば 、オートサンプラー、空または欠落しているバイアル、バイアルポジショニングとエラーに問題、注射器を差し込みます）。つ以上のピーク方法/サンプルブランクで検出された場合、空白の汚れがあり、同一の汚染物質（単数または複数）のサンプルのGC C中に存在する可能性が高いですhromatograms。汚染源（通常は水性媒体）を検索し、または非常に少なくとも、汚染物質に対応するピークは、試料クロマトグラムから、これらのピークはPLFAデータの統計的分析に含まれていないことを削除されていることを確認してください。また、キャリーオーバーが疑われるときにサンプル間ヘキサンリンスを実行することをお勧めします。ヘキサンリンスで追加のピークは、キャリーオーバー（前回の実行から溶出する、すなわち 、重い成分）が表示されます。

脂質は、酸化に対して特に感受性であり、特に注意は、暗闇の中でそれらを格納し、窒素下に保つように、空気および光の暴露からサンプルを保護するために、プロトコルを通じて行使される必要があります。 0サロゲート標準：すべてのサンプルとブランクは十分なC19を持っている必要があります。不足しているC19：0のピーク、サンプルまたは空白のいずれかでは、貧しい回復または分析物の完全な喪失を示しています。 C19の応答：メートルよりもかなり低い試料中の0ethod /サンプルブランクPLFAの方法論のある時点での検体の損失を示しています。貧しいC19に直面したとき：0回復、手順のすべての側面は、単離するための最初の抽出、サンプル移送のすべての段階、SPE抽出、脂肪酸メチル化、乾燥、保管およびサンプル操作を含めて慎重に検討する必要があり、調べ分析物が失われたステージやステージ。サロゲート標準の場合回復が過大評価することができる、0：一方、いくつかの土壌サンプルの抽​​出はC19をもたらすことができることとすることができます。 2標準を使用している間（PC（19（：0/19：0）とMeC10は：0）絶対的な要件ではありません、我々はトラブルシューティングを行う必要があるときは、この非常に有用であることが判明している限りMeC10として：0応答が適切です、トラブルシューティングは、GC分析の前段階に焦点を当てることができます。

前述のように生態系の重要性と生態系の関係を解釈する際に、注意がもっぱら導き出すのバイオマーカーに基づいて使用する必要がありますPLFAデータからD、純粋培養研究は、単離された細菌株がPLFAsの異なるカテゴリが含まれますことを明らかにしているので。より広範な生態系の推論を行うときに代わりに、バイオマーカーPLFAsは、証拠のスイートで有用な添加物としてみなされるべきです。文献では、個々のPLFAsが提案されており、異なる微生物のグループのためのバイオマーカーとして利用します。飽和PLFAsは、典型的には、グラム陰性細菌のために使用されるグラム陽性菌及びモノ不飽和PLFAを表すために使用されます。 1ω7、C18：1ω7、およびC18：グラム陰性細菌に認識されたバイオマーカーは、C16などのω5またはω7位に不飽和を有する一価不飽和脂肪酸を含み、1ω5。また、シクロ脂肪酸はまた、グラム陰性菌35を表すことができます。 1ω5+ A：1ω7+ A：0cycloしたがって、グラム陰性細菌からPLFAsは、の和に等しくなるように計算することができます。グラム陽性細菌のための認識のバイオマーカーは、末端SAを分岐していますturated脂肪酸、イソ分枝のC15など：0I、C16：0iは、C17：0I。または、C15など、アンテイソ - 分岐：0AとC17：0A。飽和中鎖（10-メチル）分岐とPLFAs、など10Me16：0と10Me18：0は、放線菌36で特徴的に存在しています。 0（ISO、アンテイソ、10-メチル）したがって、グラム陽性細菌からPLFAsは、の合計に等しいとして計算することができます。

真菌PLFAに関連付けられている多くのバイオマーカーは、多くの場合、多価不飽和されているが、一部の真菌のバイオマーカーは、モノ不飽和されています。例えば、真菌一価不飽和バイオマーカーの点で、C16：1ω5はC18、アーバスキュラー菌根菌（AMF）37の指標として同定されている：1ω9：1ω9は腐生真菌において一般的であり、一般的に外菌根C16が含まれています。ジ不飽和C18の存在：ectomycorr2ω6,9が適切に表すことができます。2ω6,9は、多くの場合、C18と連動して発生します。1ω9ともC18があることを示し、真菌のステロールエルゴステロール、とよく相関しますhizaeと腐生菌類38。トリ-不飽和C18：3ω6,9,12-も菌類10のためのバイオマーカーとして使用されてきました。しかし、C18：それは一般的に細菌で発見されていないが3ω6cは、植物や藻類を含む他の真核生物で見つけることができます。土壌原生生物の用語では、C20：他の仕事はC20を検出することができなかった、けれども4ω6cは、原生生物のバイオマーカー39として認識されている：生存可能な原生生物集団は光学顕微鏡40を用いて視覚的に確認されたとしても4ω6c。

多くの研究は、PLFAデータ分析ツールとして多変量な調整技術を利用することによって、全体的な土壌微生物のコミュニティに関連する生態学的問題に対処します。このアプローチを使用するときは、いくつかの著者は、サンプル4の5％未満で存在するPLFAsを除去することにより、データセットの稀PLFAsを除外することを選択しました。通常の飽和C16：0およびC18：0は、原核生物とEUKを含め、すべての土壌微生物で豊富ですaryotes。したがって、一部の研究者は、以前の彼らは土壌微生物コミュニティの組成の敏感な指標ではないかもしれない基づいて統計分析にこれらのPLFAsを削除することを選択した - しかしC16：0およびC18：0のためのすべてのPLFAsを合計するときに含まれるように残っています微生物バイオマスのインデックス。統計分析の用語では、多くの研究者がこの技術として非メートル多次元スケーリング（NMDS）叙階を実施することを選択し、通常、33配布することはできませんデータに適しています。カテゴリ変数に関連する追加の分析は、カテゴリグループに割り当てられた微生物群集の間の類似点や相違点を判断するのに役立つことができ、カテゴリグループとマルチ応答順列手順（MRPP）に固有のPLFAsの発生を関連付けることができる指標種分析を、含めることができます。また、多変量回帰ツリー（MRT）は、特に有用であることができる場合に、複数の実験変数の影響か治療は、潜在的な説明変数5（ 例えば、土の質感、水分、埋め立て年齢）として評価する必要があります。

確立されると、PLFAプロトコルは、環境の変化や人為的な外乱土壌微生物応答を定量化する際に非常に有用であることができる比較的簡単な分析方法です。このような遺伝子指紋などの分子技術は、微生物群集の詳細な特性に適していますが、PLFA法は、全微生物バイオマス34の定量的情報を提供するという利点を提供します。私たちの研究室では、1人が快適に4日間で20個のサンプルのセットを処理することができ、私たちはここで紹介するプロトコルは、土壌生物学的品質を評価するための堅牢かつ再現性のある技術であることが判明しています。

PLFA法のパワーが大きく安定同位体解析41、42に結合することによって拡張することができる。具体的には、付加O土壌への13 C標識基質fは個々のPLFAs 41の同位体分析かかわらず土壌微生物への基質の取り込みの定量化を可能にします。さらに、この方法は、土壌、食品ウェブ42における栄養リンクを解明するための非常に有望なツールであると思われます。

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この作業は、カナダ自然科学工学評議会によって部分的に資金提供されました。著者らは、Jela Burkus、Donna Macey、Jennifer Lloydの技術的専門知識と、この方法の最適化への貢献を認めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Pierce Reacti-Vap III-エバポレーター ガスマニホールド、27ポートステップ1-3で使用
圧縮窒素PraxairNi-T危険:トレーニング後にのみ使用し、接触と使用を最小限に抑えます。ステップ1-3で使用
使い捨て遠心分離管とテフロン裏地キャップフィッシャーサイエンティフィック05-569-3ステップ1(サンプルごとに1つ)とステップ2(サンプルごとに1つ)に使用
ガラスロングネックパスツールピペットフィッシャーサイエンティフィック13-678-20Dステップ1に使用(サンプルあたり2つ)
ガラスショートネックパスツールピペットフィッシャーサイエンティフィック13-678-4ステップ2(サンプルごとに1つ)、ステップ3(サンプルごとに1つ)、GC分析(サンプルごとに1つ)、およびPLFAメソッド中に分注される溶液の種類ごとに1つ(サンプルのバッチごとに~10
に玩具42199凍結乾燥用サンプルあたり
凍結乾燥機-Labconco 7806002 および 7753000PLFA 分析用のサンプル調製に使用 - ラボが持っているモデルを使用してください
フリーザー (-20 °C、-80 >C)レブコULT2586-5-A36マイナス 80 度;Cは、採取したばかりの土壌サンプルを凍結するために使用されます、-20°C;Cは、PLFA分析の3つのステップのそれぞれの最後にサンプルを保存するために使用されます
ガスクロマトグラフ-Agilent 6890シリーズキャピラリーガスクロマトグラフ(GC;ウィルミントン、DE)50メートルのウルトラ2(5%-フェニル)-メチルポリシロキサンカラムを装備したアジレント技術GC分析に使用され、GCの他のモデルも使用できます(1が必要)
分析カラムアジレント技術19091B-105
ガスクロマトグラフインサートアジレント技術5183-4692GC分析に使用(サンプルごとに1つ)
ガスクロマトグラフバイアルと蓋Agilent Technologies5188-6592GC分析に使用(サンプルごとに1つ)
HexanesFisher ScientificH292-4危険:ヒュームフードでのみ使用し、MSDSを読み取り、使用を最小限に抑え、適切なPPEを着用します。サンプルあたりの総容量= 4 ml(2.0 ml + 2.0 ml(ステップ3))
温水浴-Isotemp 220Fisher Scientificステップ3に使用(サンプルのバッチごとに1つ)
KimwipeFisher Scientific06-666-2凍結乾燥サンプル
KOH、ACSグレードフィッシャーサイエンティフィックP250-500に使用危険:ドラフト内でのみ使用し、MSDSを読み取り、使用を最小限に抑え、適切なPPEを着用してください。遠心分離管のためのクエン酸塩緩衝液(ステップ1で使用)およびメタノールKOH(ステップ3)
実験室の地震エンドオーバーエンドシェーカーBarnstead/Thermolyne3,625,485ステップ1(適切な保持容量のサンプルのバッチごとの1つ)
MeC10:0メチルデカン酸塩内部標準Sigma-Aldrich299030-2.5GGCの分析に使用
メタノールフィッシャー科学A454-4危険:ドラフト内でのみ使用し、MSDSを読み取り、使用を最小限に抑え、適切なPPEを着用してください。サンプルあたりの総容量 = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (ステップ 1) + 5 ml (ステップ 2) + 0.5 ml (ステップ 3))
MIDI ピーク同定ソフトウェアMIDI, Inc., ニューアーク, DEGC 分析出力の解釈に使用
微生物同定システム用 MIDI キャリブレーション標準ミックスLab Sphere Inc1200-ATSBA 40
ニトリル手袋フィッシャーサイエンティフィック27-058-52PLFAラボ作業を行うときに常に使用
pHメーター - Accumet XL200フィッシャーサイエンティフィッククエン酸緩衝
液ピペット(0.2 - 2 ml)の製造に使用 - Socorex - Calibra Digital 832 マクロピペットSocorex832.02ステップ全体で使用(サンプルごとに1つ)
250 & マイクロ;l ガスタイトシリンジハミルトン 1725GC分析に使用(サンプルごとに1つ)
シルバーシールドグローブSigma-AldrichZ529575クロロホルム
固相抽出(SPE)カラムAgilent Technologies5982-2265ステップ2に使用(サンプルごとに1つ)
スピゴット付きSPEガラスカラムホルダー および真空装置が取り付けられSigma-Aldrichステップ2に使用(サンプルのバッチごとに1つ)
ボルテックス - バーンステッドインターナショナル マキシミックスII- M37615バーンステッドインターナショナル M37615ステップ1-3で使用
水-超高純度およびクロモソルブHPLCグレードSigma-Aldrich270733-4L分析全体で使用
Whirl-Pak®バッグフィッシャーサイエンティフィック01-812-120サンプル収集に使用-収集したサンプルごとに2袋が必要
付き 使い捨て使い捨て)使用を作るために使用されて 遠心分離管のキャリブレーションミックスとして使用 の取り扱い時に使用 ています

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