方法論記事

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

DOI：

10.3791/54391

⸱

2017年1月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この原稿は、特定のオリゴヌクレオチド指向濃縮を介して真核細胞で形成された選択された同族RNPを単離するアプローチを説明しています。DHX9/RNAヘリカーゼAで構成されるレトロウイルス5'非翻訳領域に結合した同族RNPを単離することにより、このアプローチの適用性を実証します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リボ核タンパク質粒子は、RNA結合タンパク質の異なる組み合わせを通じて、すべてのmRNAの生合成と転写後調節を指示します。これらは、位置依存性のシス作用性RNA要素と、RNA結合タンパク質のユニークな組み合わせで構成されています。特定のRNPの組成を定義することは、遺伝子調節の基本的な理解を達成するために不可欠です。選択したRNPの分離は、干し草の山から針を見つけるのと似ています。ここでは、非同期トランスフェクション細胞の選択したmRNAの5'非翻訳領域に結合するRNPを単離するアプローチを示します。この同族RNPは、特定のウイルスおよび細胞ストレス応答遺伝子の翻訳に必要であることが実証されています。

実証されたRNA-タンパク質共沈殿プロトコルは、プロテオミクス分析、免疫ブロット、または適切な生化学的同定アッセイによるタンパク質成分の下流分析に適しています。この実験プロトコルは、DHX9/RNAヘリカーゼAが同族レトロウイルスRNAの5'末端で濃縮されていることを示しており、細胞ストレス関連huRおよびjunD同族mRNAとの関連を特定するための予備情報を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

転写後遺伝子の発現は、核内でのDNA転写から始めて、正確に制御されています。RNA結合タンパク質(RBP)によって制御されるmRNAの生合成と代謝は、RNA代謝の進行中に基質前駆体mRNAと会合および解離する非常に動的なリボ核タンパク質粒子(RNP)で発生します1-3。RNP成分のダイナミックな変化は、mRNAの転写後運命に影響を及ぼし、一次転写産物の処理、その核内輸送と局在化、翻訳のためのmRNAテンプレートとしての活性、および成熟mRNAの最終的な代謝回転における品質保証を提供します。

RNA認識モチーフ(RRM)、二本鎖RNA結合ドメイン(RBD)、塩基性残基(アルギニン、リジン、グリシンなど)の伸長など、多くのタンパク質が保存されたアミノ酸ドメインによってRBPとして指定されています4。RBPは、免疫沈降戦略によって定期的に単離され、同族RNAを同定するためにスクリーニングされます。一部のRBPは、機能的に関連するpre-mRNAを共制御し、RNAレギュロン5-8と呼ばれます。これらのRBP、その同族mRNA、および場合によってはノンコーディングRNAは、組成が異なる触媒RNPを形成します。それらの一意性は、関連する要因のさまざまな組み合わせ、およびそれらの相互作用の時間的順序、位置、および持続時間によるものです9。

RNA免疫沈降(RIP)は、細胞からRNPを単離し、配列解析10-13を用いて関連する転写産物を同定する強力な技術です。候補スクリーニングからゲノムワイドスクリーニングへの移行は、RIPとマイクロアレイ解析14またはハイスループットシーケンシング(RNAseq)15を組み合わせることで実現可能です。同様に、共沈タンパク質は、それらが十分に豊富で共沈する抗体16,17から分離可能である場合、質量分析によって同定することができる。ここでは、特定の同族RNAのRNP成分を培養ヒト細胞から単離する方法を取り上げますが、このアプローチは植物細胞、真菌、ウイルス、および細菌の可溶性溶解物に対しては変更可能です。この材料のダウンストリーム分析には、図1に要約されているように、イムノブロット、質量分析、生化学的酵素アッセイ、RT-qPCR、マイクロアレイ、およびRNAseqによる候補の同定とバリデーションが含まれます。

転写後レベルでの遺伝子発現の制御におけるRNPの基本的な役割を考えると、成分RBPの発現の変化や同族RNAへのそれらのアクセス可能性は細胞にとって有害であり、神経疾患を含むいくつかのタイプの障害と関連している可能性があります18。DHX9/RNAヘリカーゼA(RHA)は、細胞およびレトロウイルス由来の選択されたmRNAの翻訳に必要です6。これらの同族RNAは、転写後制御要素(PCE)19として指定される5' UTR内に構造的に関連するシス作用性要素を示す。RHA-PCE活性は、HIV-1を含む多くのレトロウイルスやjunD6,20,21などの成長調節遺伝子の効率的なキャップ依存性翻訳に必要です。必須遺伝子(dhx9)によってコードされるRHAは、細胞増殖に不可欠であり、そのダウンレギュレーションは細胞生存能力を排除する22。RHA-PCE RNPの分子解析は、細胞増殖を制御するためにRHA-PCE活性が必要な理由を理解するための重要なステップです。

定常状態または細胞の生理学的摂動時にRHA-PCE RNP成分を正確に特性評価するには、下流の分析に十分な量でRHA-PCE RNPを選択的に濃縮し、捕捉する必要があります。ここでは、レトロウイルスPCEgag RNAに、オープンリーディングフレーム内のMS2コートタンパク質(CP)のシス作用性RNA結合部位の6つのコピーをタグ付けしました。MS2コートタンパク質は、成長細胞におけるRNPアセンブリを促進するために、プラスミドトランスフェクションによってPCEgag RNAと外因的に共発現されました。MS2 コートタンパク質と同系の MS2 タグ付き PCEgag RNA を含む RNP を細胞抽出物から免疫沈降させ、磁気ビーズに捕捉しました(図 2a)。PCEに結合したRNP成分を選択的に捕捉するために、固定化されたRNPをPCEの遠位配列に相補的なオリゴヌクレオチドとインキュベートし、RNase H活性の基質であるRNA-DNAハイブリッドを形成しました。PCEは5'非翻訳領域の5'末端に位置しているため、オリゴヌクレオチドはレトロウイルス翻訳開始部位(ギャグ開始コドン)に隣接するRNA配列に相補的でした。ギャグ開始コドン付近のRNase H切断により、固定化されたRNPから5' UTR複合体が放出され、これが溶離液として収集されました。その後、サンプルをRT-PCRで評価してPCEgagの捕捉を確認し、SDS PAGEとイムノブロットで評価して標的MS2コートタンパク質の捕捉を確認しました。次に、PCE関連RNA結合タンパク質であるDHX9/RNAヘリカーゼAの検証を行いました。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
バッファー組成物
ウォッシュバッファー:
50 mM Tris-HCl、pH 7.4
150 mM NaCl
3 mM MgCl2
低塩分バッファー:
20 mM Tris-HCl、pH 7.5
10 mM NaCl
3 mM MgCl2
2 mM DTT
1x プロテアーゼ阻害剤カクテル EDTAフリー
RNase Out 5 μl/ml (RNase阻害剤)
細胞質溶解バッファー:
0.2 m スクロース
1.2% トリトン X-100
NETN-150 ウォッシュバッファー:
20 mM Tris-HCl、pH 7.4
150 mM NaCl
0.5% NP-40
3 mM MgCl2
10%グリセロール
バインディングバッファ:
10 mM HEPES pH 7.6
40 mM KCl
3 mM MgCl2
2 mM DTT
5%グリセロール

表 2: バッファーの構成。

1. 細胞とアフィニティーマトリックスの調製

  1. サブコンフルエンス(80%)に関心のある細胞株を10cmディッシュで培養します。FLAGタグ付きNLS-MS2コートタンパク質の独立免疫沈降(IP)には、10 cmプレートを使用します。FLAG-epitopeタグに対してantiseraを使用してIPを実行します。FLAGタグ付きMS2コートタンパク質プラスミドを発現させる場合、収穫の20.
    の24-48時間前に細胞をトランスフェクションします。 注:特定のRNPは、核または細胞質のライセート、またはショ糖勾配の画分などの生化学的に分画された調製物から濃縮されてもよい。トランスフェクトされていない細胞からライセートを並行して回収し、追加のネガティブコントロールを開始することをお勧めします。
  2. プロテインG磁気ビーズスラリーのIPあたり60μlを1.7 mLの微量遠心チューブに移します。
  3. チューブをマイクロ遠心チューブ用のマグネットラックに置き、ビーズを貯蔵溶液から分離します。
  4. 保存液をマイクロピペットで慎重に引き上げて取り出します。
  5. マグネットラックからチューブを取り外します。
  6. 1x Wash Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 3 mM MgCl2; and 150 mM NaCl) 600 μl (ビーズの使用容量の10倍) でビーズを洗浄し、室温で3分間エンドオーバーエンド回転
    7. させてください。
  7. チューブをマグネットラックに置き、ウォッシュバッファーを取り外します。
  8. 10容量 (600 μl) の1x Wash Bufferと免疫沈降用FLAG抗体を平衡化したプロテインG磁気ビーズに添加し(メーカーが免疫沈降に推奨する量に従って)、室温でエンドオーバーエンドで少なくとも30分間回転させて免疫沈降抗体を標識します。対応するアイソタイプIgGを適切な抗体陰性コントロールとして使用します。
  9. チューブをマグネットラックに置き、ビーズを収集し、上清を取り除きます。
  10. チューブをマグネットラックから取り出し、抗体標識ビーズを10容量 (600 μl) の1x Wash Bufferで洗浄し、室温で3分間回転させます。この手順を 2 回繰り返します。
  11. チューブをマグネットラックに置き、ウォッシュバッファーを取り外します。

2. RNPの収穫

注:ステップ1.8の後のインキュベーション時間中にRNPを準備します。

  1. 吸引して細胞から培地を取り出し、1〜5 mLの氷冷1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回洗浄します。セルスクレーパーを使用して、湿った付着細胞を回収する前に、226 x gで4分間、4°Cで遠心分離します。
  2. 氷冷した低塩緩衝液375 μl(20 mM Tris-HCl、pH 7.5、3 mM MgCl2、10 mM NaCl、2 mM DTT、EDTAフリー、1x protease-inhibitorカクテル、EDTAフリー、および5 μl/ml RNase阻害剤)を細胞ペレットに加え、氷上に5分間置いて膨潤させます>< 注:細胞ペレットのサイズに応じて、低塩緩衝液の量を調整します。10 cmプレートから1.2 x 106細胞の場合、375 μlのバッファーで十分です。
  3. 細胞質細胞ライセートを採取するには、125 μl の氷冷溶解バッファー (0.2 M スクロース/1.2% Triton X-100) を加え、氷のバケツで事前に冷却した Dounce ホモジナイザーで 10 ストロークを実行します。
    注:全細胞抽出物を収集するには、核質/クロマチンの可溶化に標準的なRIPA溶解バッファーが推奨されます。
  4. マイクロフュージで最高速度(16,000 x g)で1分間回転させると、上清から破片と原子核が取り除かれます。
  5. 上清を氷上にあった新しい1.7 mL微量遠心チューブに移します。総タンパク質濃度は、Bradford Assay23などの標準的な実験室で推奨される方法で測定します。ウェスタンブロット分析用に少なくとも10%のアリコートを予約し、インプットコントロールとして使用します。採取した細胞ライセートは、免疫沈降のために直ちに使用するか、将来の分析のために-80°Cで保存してください
    注:私たちの経験では、これらのサンプルは、完全性を損なうことなく、数か月後に免疫沈降分析に保存および使用できます。

3. 免疫沈降

  1. ステップ2.5で決定したタンパク質濃度に基づいて、回収した細胞ライセートの所望の量を標的抗体標識ビーズに加えます。1倍洗浄バッファーを使用して、総容量を最大600 μlにし、室温で90分間エンドオーバーエンドで回転させます
    注:この期間は、非特異的結合を最小限に抑えながら、高親和性RNP複合体の堅牢な単離を生成するのに十分です。ショ糖グラジエントの画分などの代替RNP源を1倍洗浄バッファーで少なくとも1:1に希釈し、上述のように、事前に調製したビーズ抗体複合体とインキュベートします。
  2. 90分間のインキュベーション後、IPチューブをマグネットラックに置き、ビーズを収集します。上澄みをフロースルーとして予約します.
    注:この最初のフロースルーは、IP効率を測定するための重要な制御サンプルです。イムノブロットアッセイは、IPの効率と、調査した相互作用の特異性を示します。この上清は、下流の解析のために保持することをお勧めします。
  3. RNP結合抗体標識ビーズを10容量 (600 μL) の氷冷NETN-150洗浄バッファー (20 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.5% NP40、10% グリセロール) で室温で3分間回転させて洗浄します。手順を3回繰り返します.
    注:このバッファーは溶解バッファーとは異なり、弱いまたは非特異的な会合を効果的に低減します。
  4. 最終洗浄後、固定化したRNP複合体を氷冷した1x結合バッファー60 μl(10 mM HEPES、pH 7.6、40 mM KCl、3 mM MgCl2、5%グリセロール、および2 mM DTT)に再懸濁し、固定化した複合体ビーズの10%をウェスタンブロット用に、20%をRNA単離用に留保します。

4. 溶出

  1. 氷冷した1x結合バッファーで残量を100 μlに調整し、チューブを70°Cで3分間加熱します。
  2. 同族の RNA-タンパク質複合体を単離するには、目的の RNA の 3' 配列境界に相補的な ~30-nt DNA オリゴヌクレオチドを添加し、室温で 30 分間、穏やかに揺さぶりながらインキュベートします (100 nM のオリゴヌクレオチドで十分です)
    注:オリゴヌクレオチドは、このプロトコルで例として使用されるPCEコンストラクトの翻訳開始部位に隣接するヌクレオチド残基に対してアンチセンスです。適切な配列相補性は、~40%のG-C含量によって提供されます。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計して、ターゲットRNAの最小相補領域に効率的にハイブリダイゼーションします。
  3. 5〜10ユニットのRNase Hをチューブに加え、室温で1時間インキュベートして、RNA:DNAハイブリッドのRNAを切断します。上清を滅菌済みの1.7 mL微量遠心チューブに移します。このサンプルには、捕捉された目的のRNP複合体が含まれています.
    注:同族RNAのアクセシビリティによっては、RNase H処理を2回以上行うことで、ダウンストリーム分析のためのサンプル量を増やすことができる場合があります。
  4. 溶出液の20%をウェスタンブロットで既知の関連タンパク質に使用し、溶出液の20%をRNA単離に使用し、その後RT qPCRを行います。残りの60%は、質量分析やタンパク質成分の同定に使用できます。
  5. 並行して、予約した細胞ライセートのアリコートをRNA単離およびRT-PCR分析に供します。この評価は、RNP複合体内のRNAの濃縮の指標を提供します.
    注:コントロールウェスタンブロットで単離されたタンパク質調製物を使用して、RNase H切断が免疫沈殿複合体からのRNPの放出に有効であったことを確認します。

5. タンパク質電気泳動とウェスタンブロット解析

  1. 全サンプルの約10〜20%をSDS-PAGEおよび標準的な実験室プロトコルに従ってイムノブロット分析にさらします.
    注:このステップは、ダウンストリームのRNA解析に先立って、IPの効率と特異性を検証するためのものです。また、単離されたRNP複合体のタンパク質組成の評価にも使用できます。

6. 免疫沈降したRNAの採取

注:RNAの単離は、Trizol法または記載されているプロトコルに従って行うことができます。

  1. 全サンプルの半分を750 μLの酸性グアニジンチオシアン酸試薬に再懸濁し、室温で5分間インキュベートしてから、捕捉したPCE-RNP複合体からRNAを抽出します。
  2. 200 μlのクロロホルムをチューブに加え、10秒間激しく振とうし、室温で3分間インキュベー
    3. トします。
  3. 16,000 x gで4°Cで15分間遠心分離した後、水相を新たなチューブに回収し、等量のイソプロパノールを加えます。よく混合し、室温で少なくとも10分間インキュベートします。グリコールブルー1μlをサンプルに加え、冷凍庫で-20°Cで保存すると、効率的な沈殿または後日の処理が可能になります。
  4. チューブを16,000 x gで10分間、4°Cで遠心分離します。上清を慎重に収集して廃棄し、RNAペレットを乱さないようにします。このプロセスを容易にするために、p-200マイクロピペットチップの使用をお勧めします。
  5. 各チューブに500 μlの75%エタノールを加え、ボルテックスで16,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離します。ステップ6.4と同様に、上清を慎重に収集して廃棄します。ペレットを2〜3分間風乾し、100 μlのRNaseフリー水に再懸濁します
    注:再懸濁の問題を避けるために、ペレットが空気乾燥する時間を長くしないでください。
  6. 100 μlのRNAサンプルをRNAクリーンアップカラムにアプライします。メーカーのプロトコルを使用して処理します。RNaseフリー水30μlでRNAを溶出し、-80°Cで最大3ヶ月間保存してください
    注:この単離されたRNAは、RTリアルタイムPCR(qPCR)、マイクロアレイ、およびRNAシーケンシングによるダウンストリーム解析に適しています。RNPの存在量と目的のRNPを単離する効率に応じて、同じライセートを2回以上のIPラウンドにさらして、ダウンストリーム分析に適用できる十分なRNAを生成することができます。

7. PCRによるcDNAのRNA逆転写と増幅

  1. 単離されたRNAを、製造元の指示に従って、高品質の逆転写酵素(RT)を含むランダムプライマーによる逆転写にかけます。
  2. 目的のRNAを増幅するには、RNase H切断配列内に遺伝子特異的アンチセンスプライマーを設計します。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ランダムプライマー、またはオリゴ-dTプライマーを同量使用してください(材料表参照)
    注:オリゴ-dTプライマーとポリアデニル化mRNAは、RT-PCR反応のポジティブコントロール反応を提供します。
  3. ネガティブコントロールライセートIPおよびポジティブコントロールDNAサンプルと並行して行う分取qPCRのために、RT反応液の5%(1 μl)を予約して、カットオフを定義し、標準曲線を作成します。分取 qPCR の CT 値が標準曲線の範囲を超えている場合は、RT 反応を連続して 1:5 希釈で希釈し、ステップ 7.2.
    を繰り返します。 注:RNAシーケンシングおよび質量分析技術については、Supplementary Methodファイルを参照してください。この補足メソッドファイルを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックでダウンロードします。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以前のRIP結果では、レトロウイルスのGAG RNAが同定され、HIV-16、junD6、huRなど、DHX9/RHAと共沈殿する細胞RNAが選択されました(Fritz and Boris-Lawrie、未発表)。レトロウイルスの5' UTRは、核内でDHX9/RHAと共沈殿し、ポリリボソーム上の細胞質で共分離することが実証されています。これは、シス作用性転写後制御要素(PCE)6として一意に定義されています。増殖細胞で形成されたPCEgag RNA-RHAリボ核タンパク質複合体(RNP)を単離するために、トランスフェクションしたHEK293細胞ライセートでFLAG-MS2 RNP免疫沈降を行いました。その結果、FLAG-MS2タンパク質が効率的に沈殿することが示されています。特に、DHX9/RHAは、このRNP複合体内で同定され、IgGアイソタイプコントロールやネガティブコントロールのHEK293細胞ライセート内では同定されません(図2A)。RNPを含む...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明するRNP単離および同族RNA同定戦略は、特定のRNAタンパク質相互作用を調査し、細胞内の特定のRNPを共調節する候補タンパク質を発見するための選択的手段です。

オリゴヌクレオチド指向性RNase H切断を使用してRNPを単離する利点は、目的のシス作用RNA要素に下流に結合した不均一なRNPを介してRNPシス作用RNA要素を捕捉し、特異的に分析できることです。特定のRNP中の同族RNAの存在量は、RNase H切断なしで単離された収集されたRNPのごく一部であるため、このワークフローの主な欠点は、同族RNPの希少性です。私たちの経験では、この制限により、高感度のイムノブロットおよびプロテオミクス分析で検出するために、従来のRNA IPよりも5〜10倍多くの出発物質が必要でした。RNPを固定化することによってもたらされるもう1つの利点は、RNase H処理を繰り返し、追加の溶出液を収集できる利便性です。私たちの経験では、追加の溶出液を収集するために、2〜4ラウンドのRNase H処理が推奨されました。

このプロトコルで...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、NIH P50GM103297、P30CA100730、および包括的ながんP01CA16058による支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Dynabeads Protein AInvitrogen10002D
Dynabeads Protein GInvitrogen10004D
抗FLAG抗体SigmaF3165
抗FLAG抗体SigmaF7425
抗RHA抗体VaxronPA-001
TRizol LS試薬ライフテクノロジー10296-028
RNase HAmbionAM2292
ChloroformFisher ScientificBP1145-1
IsopropanolFisher ScientificBP26184
RNaeasy clean-up columnQiagen74204
Omniscript reverse transcriptaseQiagen205113
RNase OutInvitrogen10777-019
プロテアーゼ阻害剤カクテルRoche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
GlycerolFisher Scientific17904
ランダムヘキサマープライマーInvitrogenN8080127
Oligo-dT プライマーInvitrogen
PCRプライマーIDT遺伝子特異的プライマー PCR増幅
RNase用オリゴヌクレオチド H媒介切断IDT用アンチセンスプライマー
Gibco Lifeテクノロジー25300-054
DMEM組織培養培地Gibco Lifeテクノロジー11965-092
ウシ胎児血清Gibco Lifeテクノロジー10082-147
トリスベースフィッシャーサイエンティフィックBP152-5
塩化ナトリウムフィッシャー・サイエンティフィS642-212
塩化マグネシウムッシャー・サイエンティフィBP214
DTTフィッシャー・サイエンティフィR0862
ショ糖フィッシャー・サイエンティフィBP220-212
ニトロセルロース膜バイオ・ラッド1620112
マグネティックスタンド1.7 ml マイクロ遠心チューブ
層流フード動物組織培養用
CO2インキュベーター動物組織培養用
タンパク質ゲル装置タンパク質サンプル分離
タンパク質転写装置サンプル移送
すぐに使用可能タンパク質ゲル(4-15%)タンパク質サンプル分離
テーブルトップ遠心分離サンプルを下回るペレット
テーブルトップローテーターサンプルの端から端までを混合
サンプルをボルテックスで混合する
AM5730G ターゲットRNAトリプシンック フィック ック ック 保持 タンパク質機 する

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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