CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

Summary

このレポートは、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、3Dでの単一細胞の解像度でのタンパク質発現パターン、増殖細胞、および皮脂細胞を可視化するCUBICプロトコルについて説明します。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価を可能にします。

Abstract

皮膚は私たちの生存に必須です。外側の表皮層は、毛包と汗腺のように私たちの体、および表皮付属のほとんどをカバーする重層扁平上皮である毛包間表皮、から構成されています。表皮は、生涯を通じておよび傷害に応答して再生を受けます。これは、しっかりと、表皮内および表皮と真皮の間の積極的な複数の調節機構によって調節されているK14発現基底表皮幹細胞/前駆細胞集団で有効になっています。この記事では、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、K14のタンパク質発現パターンを可視化するための簡単​​な方法を説明し、Ki67には増殖細胞を標識し、ナイルレッドは、3Dでの単一細胞の解像度で皮脂細胞、およびDAPI核の標識標識。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価と定量化を可能にします。 CUBICプロトコルは番目です単一細胞の解像度で全層皮膚生検における分子と細胞の相互作用を調査する日付に利用可能な電子最良の方法。

Introduction

皮膚は私たちの生存に必須です。それは3つの主要な層の外側表皮、真皮および皮下組織で構成されています。表皮は非常に再生組織です。それは主にケラチノサイトからなる扁平重層上皮です。ケラチノサイトは基底層で生まれ、差別化しながら、基底上層を通って上方に移動し、最終的に彼らは彼らの出生後約一ヶ月外側角質層に流されているされています。表皮は、毛包や皮脂腺などの付属の数を開発しています。毛包はまた、人生¹を通して循環方式で再生します。表皮の再生能力は、毛包間表皮と毛包²の基底層に位置している幹細胞および前駆細胞の存在によって有効になっています。

多くのシグナル伝達経路は、表皮の開発と再生に関与しています。これらのいくつかは、内に発生しますこのようなヘッジホッグ経路などの表皮のみ、。他のシグナル伝達事象は、真皮と表皮³との間で行われます。例えば、真皮からのWntシグナルは、毛包の発達のために重要であると考えられ、それらは毛包バルジ幹/前駆細胞の増殖および毛包の成長^4を活性化する成長期の開始時に真皮乳頭によって分泌されます。より良い彼らは、皮膚癌などの再生皮膚病に撹乱することができる方法を理解するために、表皮の開発と再生を制御する細胞および分子メカニズムを理解することが重要です。

この記事では、Cのリアを説明し、Uは、 私はカクテルやC omputational分析全体の皮膚の準備をマウントし、共焦点顕微鏡により単一細胞の解像度で3次元でのタンパク質発現パターンを可視化明確にする（CUBIC）プロトコル^5-7を maging Bの雨をnobstructed。キュービック法は、皮膚を浸漬することを含みます2アミノアルコールベースの​​化学カクテルで組織。これらのソリューションは、単一細胞の解像度で免疫検出を可能にする、透明およびタンパク質が無傷組織を残して、皮膚試料の屈折率を調整します。

このCUBICプロトコルを使用して、毛包間表皮および毛包における基礎および増殖性ケラチノサイト集団は完全な抗Keratin14を使用して、野生型マウスの厚さの皮膚生検（K14）および抗Ki67の抗体で画像化しました。野生型皮膚生検における皮脂腺も、ナイルレッド染色を用いて可視化しました。最後に、野生型および過形成YAP2-5SA-ΔCの皮膚生検における基底ケラチノサイト集団が^8を比較しました。

このCUBICプロトコルは、単一細胞の解像度で全層皮膚生検におけるタンパク質発現の視覚的評価を可能にし、遺伝的に改変されたの皮膚における表皮解剖学と形態学的欠陥を理解する重要なツールですマウスは、表皮の発達と再生の基礎となる細胞および分子機構を調査します。

Protocol

倫理文：動物を対象とするすべての手順は、承認されたACECプロト​​コル13 / 64Bの下UNSWオーストラリアでの動物管理倫理委員会（ACEC）のガイドラインに従ってください。

透明なマウスの皮膚組織の作製

注：この研究で使用した全てのマウスは、C57BL / 6遺伝的背景にありました

1. マウスの皮膚組織のコレクション。
   1. 人道的に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
   2. 慎重に肌を巻かないように注意しながらトリマーに関連する皮膚領域から毛を取り除きます。
   3. 洗浄皮膚は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の70％エタノールで除染します。
   4. 鉗子で背首の皮膚を持ち上げ、ハサミで切開を行います。
   5. 背側マウスの皮膚（約1.5×4センチ）の大面積を解剖。
   6. ろ紙上の皮膚真皮側を下に平らにし、サンプルの前後の向きをメモします。
   7. トライPBS中の新たに調製した4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液で満たされた15mlチューブ内のM個のフィルタ切開皮膚の周りに紙、および場所。
   8. 4℃で冷蔵庫で一晩、室温で1時間、修正、または。
   9. 15ミリリットルチューブ内のPBSで洗浄皮膚2×5分。
      注：以下の（1.1.10 - 1.1.12）は、組織の長期保存のためのオプションのステップです。
   10. 室温で1時間の洗浄工程の間に15mlチューブ中のエタノール（25％、50％、70％）の濃度の増加に伴って、PBS中の切開皮膚を脱水。
   11. さらに使用するまで4℃で15 mlのチューブで、PBS中の70％エタノール中で脱水肌を保管してください。
   12. 4時間クリアする前に、室温で1時間の洗浄工程の間に15mlチューブ中のエタノール濃度（70％、50％、25％、0％）に減少してPBSで皮膚組織を再水和します。
2. マウスの皮膚生検をクリア
   1. 3.85グラムの尿素3.85グラムのN、N、N '、N'を溶解させることによってCUBIC1クリア溶液を調製70°C - 60に設定されたヒータに蒸留水を5.38ミリリットル中-tetrakis（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン。ホットスターラーを使用してください。
   2. それがクリアされ、室温まで冷却した後、溶液にポリエチレングリコールモノPイソオクチルフェニルエーテル/トリトンX-100 2.31グラム加えます。
   3. 概略寸法0.2×0.5センチ生検に鋭利なカミソリの刃を持つマウスの皮膚をカットし、15mlチューブ内CUBIC1クリア溶液5mlに水没。毛包の可視化を最適化するために、生検の長辺は、サンプルの前後方向に沿って切断されていることを確認してください。
   4. 37℃でのハイブリダイゼーションオーブンで回転台に置きます。
   5. 7日後に決済ソリューションを変更します。使用前に、新鮮なCUBIC1溶液を調製します。
   6. 7日後の組織の透明性を確認してください。必要に応じて組織が完全に透明になるまで、CUBIC1クリア溶液中で生検を残します。
   7. 皮膚生検が透明になったら、CUBIC1溶液を除去し、37℃で6時間、組織を4回洗浄するために1×PBSの4ミリリットルを追加します。
   8. 37℃で4時間、15ミリリットルチューブにPBS中/ vスクロースワット20％に皮膚組織を洗浄します。
   9. -80℃の冷凍庫で一晩15mlチューブに培地最適な切削温度（OCT）化合物を取り付ける際に組織を凍結します。
      注：この手順は以降の抗体の浸透のための生検の透過性を増加します。

2.免疫蛍光染色

1. 3時間 - 2室温まで）1.2.9から組織を解凍します。
2. 10月の化合物を除去するため、室温で8時間、5mlのPBSで15ミリリットルチューブ内を洗浄する組織。
3. 37でシェーカー上で3日間PBST（PBS + 0.1％トリトンX100）で100：2 mlチューブに移し生検、および両方が1に希釈し、1ミリリットルのウサギ抗Keratin14またはウサギ抗Ki67抗体で組織をインキュベートCオーブンを°。
4. 15mlチューブに移し生検、AND 37℃のオーブン中でシェーカー上PBST 5ml中に6時間、組織を4回洗浄します。
5. 2ミリリットルチューブに移し生検は、1希釈した二次抗体をAlexa594抗ウサギ1ミリリットルを追加します。PBSTで100を、37℃のオーブンでシェーカー上で3日間インキュベートします。
6. 15mlチューブに移し生検、および、37℃のオーブンでシェーカー上PBSTの5ミリリットルで6時間、組織4回洗浄します。
7. PBST中で、37℃のオーブン中でシェーカー上で一晩インキュベート。2 mlチューブに移し生検を1mlの4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、核対比染色溶液（千1）を加えます。
8. DAPIの対比溶液を除去し、37℃のオーブンでシェーカー上で6時間、組織を4回洗浄するために2ミリリットルチューブにPBSTの1ミリリットルを追加します。
   注：オプションのステップ：生検は、少なくとも3週間、0.02％アジ化ナトリウムを含む1×PBS中で暗所に保存することができます。

3.ナイルレッド染色

1. 1M最終濃度にジメチルスルホキシド（DMSO）中のナイルレッド粉末を溶解しますグラム/ミリリットル
2. 1μg/ mlの最終濃度に1mlのPBSに1μlのナイルレッド溶液を加えます。
3. 2室温まで）1.2.9から組織を解凍 - 3時間、室温で8時間、5ミリリットルのPBSで洗浄します。
4. 2ミリリットルチューブに生検を移し、室温で2.5時間、1ミリリットルナイルレッド染色液に組織を浸します。
5. 室温で30分間、1ミリリットルPBSTで4回を2ミリリットルチューブ内の皮膚生検を洗ってください。
6. 2ミリリットルチューブからPBST溶液を除去し、DAPI核対比染色溶液（1：1,000）の1ミリリットルを追加PBST中、室温で一晩インキュベートします。
7. DAPIの対比溶液を除去し、室温で6時間、皮膚組織を4回洗浄するために2ミリリットルチューブにPBSTの1ミリリットルを追加します。
   注：オプションのステップ：生検は、少なくとも3週間、0.02％アジ化ナトリウムを含む1×PBS中で暗所に保存することができます。

4.イメージング

1. 50が含まれているCUBIC2決済ソリューションを、準備％スクロース、25％（w / v）の尿素、10％（w / v）の（w / v）の2,2 '、2' ' - nitrilotriethanol、および0.1％（v / v）のトリトンX-100。
2. 37℃のオーブンで24時間シェーカーで2ミリリットルチューブで1ミリリットルCUBIC2溶液中の皮膚組織をインキュベートします。このステップでは、組織の屈折率を均等になります。
3. 組織の透明性を確認してください。それが明確になったら、カバーガラス上にその長辺全体の皮膚生検（0.2×0.5センチ）の位置、毛包の長さ方向がカバーガラス面に平行なものであること（＃1 24×60 mm）の
   注：オプションのステップ：抗体染色された生検材料は、約7日間CUBIC2溶液中で保存することができます。ナイルレッド染色生検は最大1日のCUBIC2溶液中に保存することができ、できるだけ早く画像化されるべきです。
4. イメージング室を準備し（ 図1）
   F（ブルータック、生地を再生したり、類似の、および2カバースリップ（24×50 mm）の：イメージングチャンバーの製造のために必要な消耗品は次のとおりです。注意してくださいigureの1A）。
   1. ブルータックの2つの薄いストリップ（直径約1ミリメートル×2センチ）、および2つのカバースリップ（ 図1B）を準備します。
   2. 皮膚生検（ 図1C）のための十分なスペースを可能にする、1つのカバースリップ上にブルータックストリップを配置します。 4.4.3）
   3. CUBIC2溶液の液滴（ 図1C）でカバースリップ上のストリップ間に皮膚生検を置きます。
   4. 第二のカバーガラス（ 図1D）との皮膚生検をカバーしています。
5. 共焦点顕微鏡のステージ上に取り付けられた皮膚生検とイメージング室を配置し、光経路に組織を動かします。
6. 関心の蛍光染色された領域を同定するために、水銀やハロゲン光源と、標準的な落射蛍光フィルターを用いて、試料（ 例えば、DAPI / GFP / CY3 / CY5）をスキャンします。
7. 10X及び20X対物レンズを使用して目的の画像領域（NA 0.75）および標準共焦点蛍光イメージング技術（ 例えば 、DAと）620 nmの - PI染色したサンプルを、405nmレーザーを照射し、425の間の蛍光シグナルを収集 - 475 nmのを、およびAlexaフルーア594またはナイルレッド染色したサンプルを用いて561 nmのレーザーを照射し、570との間に蛍光信号を収集します。
8. 顕微鏡Zスタック画像収集ソフトウェアを使用して関心のある各領域の画像のZスタックを生成する（ 例えば 、下記のようにソフトウェア4.13を撮像NIS要素を使用して）。
   1. 最適なレーザーパワーとPMT HVを確認/オフセット設定は、サンプルの蛍光を収集するために選択されています。
   2. 「取得コントロール」から「ND取得」ツールバーを開きます。
   3. （他のすべてのタブが選択されていないであることを確認） "Zシリーズの設定」タブを選択します。
   4. ライブスキャン中、サンプルの上部に焦点を当て、「トップ」ボタンを押してください。
   5. サンプルの底に焦点を当て、「下」ボタンを押してください。
   6. 入力に必要なステップサイズ（またはプレスに最適化ステップサイズボタン）。
   7. プレssの「今すぐ実行」ボタンを押します。
   8. 個々のTIFF画像スタック（画像Z-スタックあたり1蛍光色素）として得られたZ-スタックを保存します。
9. 3D解析ソフトウェアを使用して、目的の3Dボリュームの領域を再構成する画像のZスタックを使用する（ 例えば 、下記のようにIMARIS x64の7.2.3を使用して）。
   1. 解析ソフトウェアを起動します。
   2. 3Dボリューム生成のためのツールバーのボタンを「サーパス」を選択します。
   3. 最初の色画像Zスタックを開きます（ 例えば 、DAPI）。
   4. 追加のカラーチャンネル、蛍光色素ごとに一つのチャネルを追加するには、「チャンネルを追加」ツールを使用します。したがって、DAPIおよびアレクサフルオロ594蛍光色素の両方を含む試料は、2つのチャネルを必要とします。
   5. 上記4.7で決定されるように、正しいピクセル（ボクセル）の寸法（XYZ）を設定するには、「画像のプロパティ」ツールを使用してください。
   6. （ 例えば、赤、青、アレクサフルオロ594チャンネルにDAPIチャネルを設定する）必要に応じて、チャネルの色を変更するには、「表示調整」ツールを使用してください。
   7. POへ画像ウィンドウ内の3Dボリュームをジション、必要に応じてクリックしてドラッグボリュームするコンピュータのマウスを使用します。
   8. 3D画像のスクリーンショットを生成するために、ツールバーの「スナップショット」ツールを使用してください。
   9. 3Dの試料回転の映画を生成するために、ツールバーの「アニメーション」ツールを使用してください。

Results

大人の野生型マウスの全層背部皮膚生検を基底ケラチノサイトマーカーKeratin14（K14）に結合する抗体で染色し、明らかにした、そして核はDAPI染色溶液（ 図2およびムービー1）で対比染色しました。

DAPI陽性の核は、サンプル（ 図2A、C）を通して見えた、とK14染色は、毛包間表皮の1セル厚の基底層に独占的に見えた、と皮脂腺（黒アスタリスク）、の外毛根鞘を概説します毛包は、セカンダリヘア細菌（ 図2B、C）には、先に^9を発表^しました 。 K14染色強度は毛包間表皮、遠位毛包と二次毛の細菌（白アスタリスク）で高く、それは、毛包（ 図2C中のBu）のバルジ領域では比較的低かったです。真皮乳頭はまた、明らかにvisiblましたDAPI標識（ 図2Cの矢印）を介して電子。

大人の野...

Discussion

皮膚の発達および恒常性を制御する調節機構は、最も一般的には、皮膚の形態、細胞集団またはタンパク質発現の唯一の制限認識を可能にする、抗体を用いて組織切片、組織学的染色又はラベリングを用いて2次元で研究されています。多くの方法は、表皮全体マウント^10-13で3次元的に単細胞解像度における細胞およびタンパク質の空間的組織の視覚化を改善するために開発されてきました。これらのいくつかは、しかし、特に毛深い皮膚を使用して技術的に困難であり、多くの場合、毛嚢の組織の損傷および破壊をもたらす真皮から表皮を分離することを伴います。また、表皮と真皮の分離は、胚発生および組織恒常性の間にそれらの間に発生する細胞および分子間相互作用を研究損ないます。

「フラットマウントアプローチ」全厚マウス別の方法であります皮膚を切開し、免疫染色し、その後、免疫蛍光信号^14を維持^しながら^、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール（BBBA）を使用して明らかにされています。この方法は、真皮から表皮の技術的に困難な分離を必要としません。しか...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6418
エタノール 96% (未変性)	Chem-supply	UN1170
ナイルレッド	シグマ-アルドリッチ	72485-100MG
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)	ロシュ	10236276001
N,N,N',N'-テトラキス (2-ヒドロキシプロピル) エチレンジアミン	メルクミリポア	821940
ポリエチレングリコール モノ-p-イソオクチルフェニルエーテル	メルクミリポア	648462
トリトン X-100	メルクミリポア	648462
ショ糖	Sigma-Aldrich	S0389
最適切断温度 (OCT) 化合物	Tissue-Tek	4583
抗ケラチン14抗体	コーヴァンス	PRB-155P
抗 Ki67 抗体	Abcam	ab16667
ロバ アンチウサギ アレクサ 594	ライフ テクノロジー	ズ A21207
ジメチルスルホキシド	シグマ - アルドリッチ	D2650
素	メルクミリポア	66612
2,2′,2′'-ニトリロトリエタノール	メルクミリポア	137002
共焦点顕微鏡	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - 共焦点顕微鏡
cruZer6 フェイストリマー	ブラウン	cruZer6 フェイス
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich