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方法論記事

グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

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DOI：

10.3791/54410

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2016年10月5日

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1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、 すなわち 、テロワールの概念を洞察するために、ベリー品質形質に対する環境の影響をブドウ果実の転写産物および代謝物への非標的メタボロミクス、トランスクリプトミクスと多変量統計解析のアプリケーションについて説明します。

要約

テロワールは、特定の生息地や経営慣行に従って、このようなブドウ（ ブドウ ）などの作物の特性に影響を与える環境要因の組み合わせを指します。この記事では、特定のテロワールの署名が多変量統計解析を用いて、ブドウ品種のコルビナのベリーメタボロームとトランスクリプトームで検出することができる方法を示しています。この方法は、まず、適切なサンプリング計画が必要です。このケーススタディでは、コルビナ品種の特定のクローンは遺伝的差異を最小限に抑えるように選択し、試料は、3つの異なる栽培期間中に三つの異なるマクロゾーンを表す7ブドウ畑から収集しました。非標的LC-MSメタボロミクスのアプローチはMZmineソフトウェアおよびフラグメンテーションツリー分析に基づいて、代謝物同定の戦略を使用して効率的なデータ処理を伴う、その高感度のために推奨されます。包括的トランスクリプトーム解析は、マイクロアレイを用いて達成することができますすべての〜99％をカバー含むプローブは異なるテロワールのコンテキスト内のすべての示差的に発現する遺伝子の同時分析を可能にする、ブドウの遺伝子を予測しました。最後に、投影法に基づいて、多変量データ解析は、メタボロミクスとトランスクリプトミクスデータを統合し、有益な相関を同定するために詳細に分析することを可能にする、強力なヴィンテージ特有の効果を克服するために使用することができます。

概要

植物のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームおよびメタボロームに基づいて、大規模データ解析は、ブドウの植物とその環境との相互作用を反映したワインのテロワールの特性のような複雑なシステムの挙動に前例のない洞察を提供しています。ワインのテロワールが同一のブドウのクローンが異なるブドウ畑で栽培された場合でも明瞭な可能性があるので、クローンのゲノムが同じであるため、ゲノミクス解析はほとんど役に立ちません。その代わりに、遺伝子発現とワインの品質特性を決定ベリーの代謝特性との相関関係を調べることが必要です。マイクロアレイ上に固定化されたプローブに、そのようなハイブリダイゼーションのような普遍的な特性を利用することによって定量分析を容易にする全ての転写物の類似の化学的特性から、トランスクリプトームの利益のレベルでの遺伝子発現の解析。プロテオミクスaの対照的に、ユニバーサル分析方法NDメタボロミクスが原因個々のタンパク質および代謝産物の巨大な物理的および化学的多様性より挑戦です。メタボロミクスの場合、個々の代謝産物がサイズ、極性、豊かさとボラティリティに大幅に異なるため、この多様性はさらに極端なので、単一の抽出方法や分析方法は、全体的なアプローチを提供しています。

不揮発性代謝物のために適切な分析プラットフォームのうち、高速液体クロマトグラフィーに基づくものを質量分析に連結された（HPLC-MS）は、はるかに敏感例えば紫外線またはダイオードアレイ検出器を用いたHPLC（HPLC-UV、HPLC-DADなどの代替よりも）または核磁気共鳴（NMR）分光法が、HPLC-MSによる定量分析は、マトリックス効果とイオン抑制/強化1-3のような現象に影響され得ます。 （HPLC-Eをエレクトロスプレーイオン化源を用いてHPLC-MSによるコルビナブドウ果実の解析中にこのような効果の調査SI-MS）は、最小の保持時間を有する糖および他の分子を強くおそらくこの領域中の分子の多くを反映し、過少報告されたことを示し、他の分子の存在量は、マトリックス効果によって過大評価または影響を受けず、過小評価することができることしかし、マトリックス効果のためのデータの正規化は、全体の結果4,5への影響は限定的を持っているように見えました。本明細書に記載される方法は、熟成中ブドウ果実において高レベルで蓄積媒体極性代謝物の分析のために最適化され、そしてこれはかなりテロワールによって影響を受けます。彼らは一緒にワインの色、味と健康関連の特性を決定する、アントシアニン、フラボノール、フラバン-3-オール、プロシアニジン、他のフラボノイド、レスベラトロール、スチルベン、ヒドロキシ酸およびヒドロキシ安息香酸が含まれます。 HPLC-MSによる定量の信頼性が低いので、そのような糖や脂肪族有機酸などの他の代謝産物は、原因effec行列に無視されますトンとイオン抑制現象5。この方法により、選択された極性の範囲内に、アプローチは、可能な6限り多くの異なった代謝物を検出することを目的とするという点で非標的です。

ブドウの転写産物の数千人が同時に監視できるようにするトランスクリプトーム法は、完全なブドウのゲノム配列7,8の利用可能性によって促進されます。ハイスループットのcDNA塩基配列決定に基づいて、初期のトランスクリプトミクス手法をまとめ、RNAのSeq技術として記載された手順のコレクションに次世代シーケンサーの登場と進化してきました。このアプローチは、急速にトランスクリプトミクス研究のための最適な方法になってきています。しかし、転写産物の数千人は、ハイブリダイゼーションによって並列に定量化することを可能にするマイクロアレイに基づく文学の大きな体は、ブドウのために蓄積してきました。 RNA-seqが主流の技術になる前に実際に、多くの専用の市販のマイクロアレイプラットフォームをしていましたブドウトランスクリプトームは、非常に詳細に検査することを可能にする開発。プラットフォームの多種多様な中で、2つだけは、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析9を可能にしました。最も進化した配列は、このように各実験のコストを削減し、単一のデバイスに最大12の独立したサンプルのハイブリダイゼーションを可能にしました。 12サブアレイはそれぞれ29549ブドウの転写産物を表す135,000 60-merのプローブを含んでいました。この装置は、試験10-24多数のに使用されています。これら2つのプラットフォームは、現在廃止されましたが、新しいカスタムマイクロアレイは、最近設計されていて、それが追加新たに発見されたブドウの遺伝子25を表すプローブのさらに多くが含まれているとして、より多くの最近の発展を表しています。

トランスクリプトミクスとメタボロミクス解析によって生成された大販売データセットは、別のフォームとの間の相関を決定するために、多変量技術を含むデータ分析に適した統計的手法を必要とし、データの秒。最も広く使用されている多変量技術は、投影に基づくものであり、これらは、主成分分析（PCA）、又は、教師なしとすることができるような潜在構造判別分析（O2PLS-DA）26への双方向直交射影として、監督します。この記事で紹介したプロトコルは、サンプルのグループ間の差異を識別するために、探索的データ解析のためのPCAとO2PLS-DAを使用しています。

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プロトコル

1.適切な材料を選択し、サンプリング計画を構築

  1. 適切なサンプリング計画を開発することによって、実験を開始します。そのようにケースバイケースで各プランを評価しない汎用的で普遍的なアプローチがありません。サンプリング計画は、サンプリング場所、時間と正確なサンプリング手順を述べていることを確認してください。このケーススタディで使用されるサンプリング計画については、 図1を参照してください。
    注：（。 ブドウ品種コルビナ、クローン48）単一のクローンから、このケーススタディ、ブドウの果実では、ヴェローナ（ガルダ湖、ヴァルポリチェッラとソアーヴェ）の州に三つの異なるマクロゾーンで7商業ブドウ畑から収集しました。各ブドウ畑の主な特徴は、表1にまとめられている。ベリーveraison（熟成の発症）、ミッド熟成と熟した果実に対応する、3つの時点で3生育期（2006年、2007年、および2008）の間に収集されました。
    1. アクの各（VINのためeyard /年/熟成段階）、無作為化高さと植物上の位置で2つのつるの行に沿って異なる位置から収穫30クラスタ。
    2. 目に見える損傷および/または感染の兆候を持つものを避け、各クラスタからランダムに3ベリーを選択します。
    3. 繰り返しは、3つの独立したプールを得るために、1.1.1と1.1.2を繰り返します。
    4. 果実の種を取り除く、液体窒素中ですぐに果皮を凍結します。
    5. 自動ミルグラインダーで各プールから10冷凍果実を粉砕し、2等分、トランスクリプトミクス解析用とメタボロミクス解析のための1つに、各粉末サンプルを分割。
    6. -80℃で粉末を保管してください。
AM BA BM CS FA MN PM
マクロゾーン ソアーヴェガルダ湖ヴァルポリチェッラガルダ湖ヴァルポリチェッラヴァルポリチェッラソアーヴェ
身長（m） 250 120 450 100 130 250 130
台木 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
行方向 EW NS EW EW EW NS NS
トレーニングシステム オーバーヘッドシステム（パーゴラ） オーバーヘッドシステム（パーゴラ） 垂直シュートポジショニング（ギヨー） オーバーヘッドシステム（パーゴラ） Overhe広告システム（パーゴラ） 垂直シュートポジショニング（ギヨー） 垂直シュートポジショニング（ギヨー）
土壌型 シルト質粘土ローム粘土ローム埴壌土シルトローム埴壌土
植栽のレイアウト（メートル） 3.20のx 1.00 4.50のx 0.80 4.00のx 1.25 3.50のx 1.20 3.50のx 0.75 2.80のx 1.00 1.80のx 0.80
総ライム％ 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
アクティブ石灰％ 0.5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
砂 ％ 15 47 66 42 29 13 36
ローム％ 43 36 21 37 39 67 36
粘土 ％ 42 17 13 21 32 20 28
土壌pH 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
有機物質（％） 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
交換可能なリン（mgを/キログラム） 26 73 73 68 48 47 64
交換性カリウム（ミリグラム/キログラム） 190 376 620 230 168 154 126
交換可能なマグネシウム（Mg / kg）を 272 468 848 623 294 293 183
交換性カルシウム（ミリグラム/キログラム） 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
ベリー還元糖2006 211.25±1.20 176.20±0.42 187.40±0.00 203.70±1.13 212.55±0.64 195.20±0.00 211.65±0.64
ベリー還元糖2007 190.00±1.27 165.25±0.49 153.00±0.42 203.60±0.71 210.90±0.71 192.25±0.64 188.70±1.84
ベリー還元糖2008 191.35±0.64 178.90±0.57 170.05±0.49 205.15±1.48 188.70±0.57 169.35±0.49 108.05±1.06
ベリーのpH 2006 3.01±0.01 2.96±0.01 2.84±0.00 2.9±0.00 2.98±0.00 3.02±0.00 3.06±0.01
ベリーのpH 2007 2.97±0.00 3.00±0.00 2.74±0.00 3.07±0.01 2.98±0.00 2.87±0.01 3.09±0.00
ベリーのpH 2008 2.83±0.00 3.04±0.01 2.71±0.00 2.98±0.01 2.98±0.00 2.82±0.00 3.11±0.00
収穫日 2006 2007 2008
Veraison 8 8月 18 - 7月 12 - 8月
ミッド登熟 4 - 9月 8 8月 2 - 9月
熟しました 18 - 9月 29 - 8月 23 - 9月

表 1：各ブドウ畑の主な機能とサンプル収集日付。メートル=メートル、EW =、NS =南北ウエストを食べます。
figure-protocol-1
図1： サンプリング手順の模式図は、3つのワインの生産マクロゾーンはヴェローナ、ヴェネト地方、イタリアの街の周囲に配置されています。 3つの時点ではブドウ栽培に熟成の開始を表すveraison（V）であり、中期熟成（MR）と熟した果実（R）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.ベリーパウダー抽出物を準備し、代謝物を分析し、データを処理

  1. 分析のためのベリー粉末試料を準備します。
    1. ために（V / V）（w / v）のメタノール0.1％酸性三巻室温でベリーサンプルの代謝抽出物を調製15分間、40 kHzの超音波浴中のマイク酸。 LC-MSグレードの水およびギ酸、およびHPLCグレードのメタノールを使用してください。
    2. 遠心し、4℃で10分間、16,000×gで抽出します。
    3. 脱イオン水の2体積（v / v）のステップ2.1.2からの上清を希釈し、0.2μmのフィルターを通過します。
  2. HPLC-ESI-MSによるベリー抽出物を分析します。
    1. 供給元の推奨に従ってHPLC-ESI-MSシステムを設定します。
      注：このケーススタディでは、セットアップは、イオントラップ質量分析計とエレクトロスプレーイオン化源とインライン接続されたオートサンプラーを装備したHPLCシステムを、構成されていました。
    2. C18ガードカラム（7.5×2.1ミリメートル2）と逆相C18カラム（150×2.1ミリメートル2、粒径3μm）を用いたHPLCシステムを接続します。
    3. 移動相として使用される溶媒を準備します。 sと溶媒Aとしての水と100％アセトニトリル、5％（v / v）アセトニトリル、0.5％（v / v）のギ酸を使用してB：ご使用のLC-MS-グレードのアセトニトリル、水及びギ酸をolvent。
    4. 0.2 mlの分の一定の流速で溶媒AおよびBの直線勾配でのHPLC分離を実行-1の30μlの試料注入体積を用いました。
      1. 最初に20％から25％溶媒B、20分間で10％から20％の溶媒Bまで、5分で0％〜10％の溶媒Bの勾配を確立し、100％溶媒Aの次のサンプル注入でカラムを平衡化5分、15分で25％〜70％溶媒Bから。
      2. 二重に各サンプルを分析します。機器主導の影響を回避するために、試料分析をランダム化します。各分析の間に100％溶媒Aで再平衡化のための20分を許可します。
    5. 代替負と正イオン化モードで質量スペクトルを取得します。このケーススタディに記載された結果は、 表2のようにパラメータを設定します。正確なマシンの設定は、特定のプラットフォームに依存します。
      注：あるいは、他のスーツを使用特定のプラットフォームに応じて可能な方法。
      1. 全ての場合において、任意の分離プラットフォームと同様に、保持時間再現性を有するために、適切な再平衡化時間を使用してください。サンプル数は、（10サンプル以上）高い場合には、各バッチの間にクロマトグラフィーカラムの洗浄​​プログラム（二溶出溶媒との間の遅い勾配）で、9-10サンプルのバッチでそれらを分析します。 、十分な保持時間の再現性を持っている各バッチの最初のクロマトグラフィー分析は空白の分析であることを確実にするために（ すなわち 、溶剤の分析）。
    6. また、断片化オプションを設定し、断片化負と正イオンモード（2つのイオン前駆体、MS 3）で質量スペクトルを取得します。製造業者の指示に従って断片化ツリー分析（MS / MS及びMS 3）の代謝物に注釈を付けます。
      注：これらは、しばしば、グリコシル化されているので、これは、植物代謝物に特に適している、THER最初のフラグメンテーション（MS / MS）EFORE（MS 3）砂糖無料アグリコンイオンを残す部分、およびその後の断片化を除去する傾向がある本物の標準ライブラリとアグリコンを識別するのに役立ちます。
    7. あるいは、1 Vのフラグメンテーション振幅のm / z範囲50-1,500にMS / MSおよびMS 3スペクトルを取得し、特定のプラットフォームに応じて他の適切な方法を使用します。
    8. 各m / zの信号については、製造元の指示に従って本物の標準ライブラリにMS / MSおよびMS 3断片化パターンと保持時間を比較します。
      注：プラットフォームの多くのタイプは、認証標準物質の分析を通じてこのライブラリの種類を構築するためのソフトウェア設備があります。これは、信号の多くを特定する必要がありますが、すべてではないの信号は注釈が付けられます。
    9. 残りの匿名の信号では、文献に発表されたもので、MS / MSおよびMS 3フラグメンテーションパターンを比較し、searcm / z値（ すなわち 、数字"のm / z 353」などのm / z記載されていると分子れる出版物を探すために）自由に利用できる一般的な検索エンジンのいずれかと、あるいはそのようなMassBankなどのオンラインデータベースを使用します（WWWのための興.massbank.jp / EN / database.html）とヒューマン・メタボローム・データベース（www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search）。
質量分析計のコンポーネント 関数 パラメーター
エレクトロスプレーイオン化ソース噴霧ガス 50 psiで、350°C
乾燥ガス 10 L分-1
イオントラップと検出器スキャンフルスキャンモード、13000メートル/秒あたりのz、範囲50-1,500 のm / z
ターゲット質量 400メートル/ zの
衝突ガスヘリウム
真空圧力 1.4×10 -5ミリバール
毛細管ソース 4000 V
エンドプレートオフセット -500 V
スキマー -40 V
キャップ出口 -121 V
10月1日DC -12 V
10月2日DC -1.7 V
レンズ1 5 V
レンズ2 60 V
正イオン化モードのためのICC 20.000
負のイオン化モードのためのICC 7,000

表2：質量スペクトルを取得するための主なパラメータセット。

操作 選択 関数 パラメーター 価値観
ピーク検出質量検出重心騒音レベル 3500
クロマトグラムビルダー最高のデータポイント分の期間 0.15
分の高さ 4,000
M / Zトレランス 0.3
ピーク検出ピークデコンボリューションローカル最小検索クロマトグラフのしきい値 70
RT範囲内検索の最小値（分） 0時50分
最小の相対的な高さ 15％
最小の絶対高さ 4,000
ピークトップ/エッジの分率 2
Durationの範囲（分） 0-10
同位体同位体ピークのハタ - M / Zトレランス 1.2
RT公差 0時50分
単調な形状いいえ
最大充電 3
代表的同位体いいえ
アラインメントアライナーに参加 - M / Zトレランス 1.2
m / zの重み 10
保持時間の許容範囲 0時50分
RTの重み 5
同じ充電状態を必要としますいいえ
同じIDが必要ですいいえ
同位体パターンの比較いいえ
ギャップを埋めるピークファインダー - 強度の許容範囲 20％
M / Zトレランス 0.9
保持時間の許容範囲 0時40分
RT補正いいえ
フィルタリングピークフィルタを複製 - M / Zトレランス 1.2
RT公差 0時30分
同じ識別を必要としますいいえ

表3：負のLC-MSのブドウ果実のデータファイルを処理するために特定の値を持つMzmineワークフロー。

  1. LC-MSデータを処理します。
    1. Accessまたは多くの生のクロマトグラムから関連情報を抽出し、それぞれの検出された代謝産物は、各サンプルにおいて定量されたデータ行列を構築することができ、データ処理ソフトウェアパッケージをダウンロードします。
      注：以下のプロトコルステップは、オープンソースソフトウェアのMZmineのv2.14（http://mzmine.sourceforge.net）に合わせて調整されています。これは、LC-MSデータ上の主な焦点で、質量分析データ処理のためのオープンソースソフトウェアです。27
    2. 機器メーカーが提供するソフトウェアを使用したnetCDF形式にLC-MSクロマトグラムデータを変換します。ここで説明する結果を得るためには、ブルカーダルトエスクァイアV5.2およびデータ解析v3.2のソフトを使用し、製造元の指示に従って手順を実行します。
      注：その他のコンバーターを使用することができる（様々なフリーウェアのコンバータが用意されています）。
    3. ソフトウェアに.CDFファイルをインポートします。
    4. PARAMETとピーク検出、アライメント、ギャップ充填およびピークフィルタリング手順を実装します表3に報告者。
      1. 最初のステップとして、ビジュアライゼーション→TIC / XICビジュアライザに行き、その後、インポート.CDFファイルを選択します。クロマトグラムにおける最小のピークのベース上にカーソルを置き、ベースイオンの最小強度信号に関するメモを取ります。そして、ピーク検出→生データのメソッドにアクセスしてください。
      2. 質量検出を選択して、スキャンごとに個別のイオンを検出し、イオンのリストを作成するには、信号レベルを埋めます。
        注：前の質量検出を実行するアルゴリズムを確認してください - それは質量分析計によって異なります。私たちのケースでは、重心を選択します。
      3. クロマトグラムBuilderを選択して、イオンリストからデータポイントを接続し、各質量値のクロマトグラムを構築するために、信号レベルで満たします。最小時間スパンおよびm / zの許容値を調整するための質量分析装置の取扱説明書で指定されたパラメータを参照してください。
      4. 次に、ピーク検出→クロマトDeconvo→ピークリストメソッドにアクセスしてくださいリューション。個々のピークに各クロマトグラムの分離を可能にするために（この場合はローカルミニマム検索で）適切なアルゴリズムを選択します。
      5. 手動で次のパラメータに適切な値を見つけるためにクロマトグラムを点検します。ノイズを除去し、2つのピークを区別するために最低限の地元の人々の存在を同定するために2（分）にRT範囲で最小を検索するために30％にクロマトグラフィーのしきい値を設定します。
      6. 2.0で最小の相対的な高さを設定します。手動でピークにではなく、バックグラウンドに対応する信号の最小絶対高さを識別するために、クロマトグラムを点検。 （例えば、提示実験10,000）絶対高さとして、この値を設定します。
      7. トップと真のピークとして認識されるために必要なピークの最低のデータ点強度の間の最小比率を述べるために1.1にピークトップ/エッジの最小比率を設定します。
      8. 手動で使用chromatにおける様々なピークの最小持続時間であるかを確認するためにクロマトグラムを検査ographic条件は、（例えば、0.2と2分、化合物に応じて、提示された実験での間）、その結果、継続時間などの許容可能なピークの長さの範囲を設定するために、ピーク時間範囲（分）として、これらの値を使用します。
      9. そして、通常、最も強烈で、一つのピークにグループにピークリスト方法→同位体→同位体ピークハタに同位体が行きます。注：パラメータは、質量分析計の分解能と保持時間の再現性に依存します。
      10. 最後に、一致スコアを使用して、 のm / zおよび保持時間に応じてピークを整列させるために、ピークリスト方法→整列→参加アライナに行きます。
    5. ピークを整列させた後、→ピークファインダーを充填ピークリスト方法→ギャップをクリックすることで、任意のデータのギャップを埋めます。最後に、ピークリストメソッド→フィルタリング→重複ピークフィルタをクリックして、フィルタ重複データポイントを。
    6. .csファイルとして得られたデータセットをエクスポートします。vファイル。
    7. 手動。txtの拡張子に。csvファイルの拡張子を変更します。何のファイル拡張子が表示されていない場合は、ファイル拡張子を明らかにするために、コンピュータの設定を変更します。 'れている拡張子は表示しない」エクスプローラの[オプション]→[表示]→[詳細設定]をファイルし、チェックボックスをオフに移動します。
    8. スプレッドシートに.txtファイルをインポートします。これは、識別番号、m / z値および保持時間によって認識されるすべての検出された代謝物は、それらのピーク面積値の点ですべてのサンプルにおいて定量されたデータ行列を生成します。

3.トランスクリプトーム解析のためのベリーパウダー抽出物を調製し、データを処理

  1. ベリーのサンプルから全RNAを抽出し、RNAの品質を決定します。
    1. ベリーサンプルから全RNAを抽出します。
      注：このケーススタディ、独自のキットおよびその相互の分子の完全な除去を確実に変更された手順でそのような多糖類およびポリフェノールなどのRNA分析とFEREは、使用しました。以下の手順は、このキット18に特異的です。
      1. 、各サンプルのベリー粉末400mgの重量を量る二つの部分に分割し、2マイクロチューブに200 mgのそれぞれを配置します。
      2. 少なくとも30秒間、直ちに、激しく粉末と渦のそれぞれ200 mgの（キットに付属）βメルカプトエタノールを含む溶解液900μLを加えます。 800rpmで振盪しながら5分間、56℃で試料を加熱します。
      3. 細胞破片をペレット化し、10分間ベンチトップ微量最大速度でサンプルを遠心分離。
      4. ピペットで2 mlのコレクションチューブに着座したキット（青の保持リング）に設けられたろ過カラムに上清700μlの。残留破片を除去するために1分間卓上微量最大速度でキャップと遠心分離機を閉じます。二回3トンで、その結果、同じ濾過カラムが、新鮮なコレクションチューブを使用して、この手順を繰り返しますubes明らかにした溶解物をそれぞれ含有〜700μlの。
      5. ピペット750清澄化ライセートの各チューブに（キットに付属）結合溶液μlの下に少なくとも5回ピペッティングによりすぐに混ぜます。 2 mlのコレクションチューブに着座したキット（赤リテーナリング）に設けられた結合列に、この混合物の700μlのを転送します。 RNAに結合するために1分間卓上微量最大速度でキャップと遠心分離機を閉じます。
      6. フロースルー画分をデカントし、コレクションチューブを反転し、残留液を排出するために吸収紙の清潔なパッドの上に簡単にそれをタップします。
      7. コレクションチューブにカラムを戻し、同じ列に残りの混合物をピペットし、遠心分離およびデカンテーションの手順を繰り返します。混合物全体が同じ赤の結合列にフィルタ処理されるまで繰り返します。
      8. 今キットの残りの指示に従い、（キットに付属）50μlの溶出バッファー中のRNAおよびストアIを溶出品質管理手順の準備ができて-80℃でT。
    2. 分光光度計を用いてRNAの量と純度を決定します。タンパク質（260/280）およびポリフェノール/多糖類（260/230）による汚染の程度を明らかに吸光度比を記録します。
      注：マイクロアレイハイブリダイゼーションに適したRNAは、両方の比率のために少なくとも1.8のスコアすべきです。
    3. RNAの完全性を決定します。
      注：様々なシステムを使用することができます。蛍光色素と組み合わせたキャピラリー電気泳動実行を行うデジタル取得企業は、このケーススタディで使用されました。マイクロアレイハイブリダイゼーションに適したRNAは、少なくとも8のRNA完全性番号（RIN）を持っている必要があります。
  2. サンプルを準備し、カスタムマイクロアレイへのRNAをハイブリダイズします。
    1. 純RNaseフリー水を用いてステップ3.1.1.8で得られたRNA溶液を希釈することにより、200ngのにマイクロアレイ解析のための全RNAの開始量を設定します。加えます1.5μlの最終容量で1.5 mlマイクロチューブにRNAの適切な量。
    2. 各RNAサンプルに希釈したスパイクミックスの2μlを添加し、第一鎖cDNAを合成したcRNAにこれを転写し、シアニン3CTPでのcRNAを標識するために、製造元の指示に従ってください。
    3. 製造元の指示に従って標識cRNAを精製し、30μlのRNaseフリー水で溶出します。
    4. 収率および分光光度計で3値を記録することにより、各cRNAの比活性を決定：シアニン3色素濃度（ピコモルμLを-1）、RNA純度（260/280）とのcRNA濃度（ngのμL-1）。 cRNAの収量（μgの）および比活性（μgのcRNAをあたりピコモルのCy3）を計算するために、メーカーの取扱説明書で見つかった式を使用してください。
      注：推奨収率および具体的な活動は、特定のマイクロアレイフォーマットに基づいて異なります。このケーススタディでは、4パック44Kフォーマットがありました選択された、推奨される収率は1.65であったと具体的な活動は9でした。
    5. プローブ設計のための適切なソフトウェアを使用してカスタムマイクロアレイを設計します。
      1. このケーススタディで説明した結果を得るために、カスタムマイクロアレイデザインやオリゴヌクレオチドライブラリーのためのWebベースのアプリケーションを使用して、4パック44K形式に設計された新しいカスタムマイクロアレイを、準備します。 29971を含む34651ターゲット転写産物と一致するように設計プローブは、ピノ・ノワールV1アレイ、コルビナのトランスクリプトームの再構築と180プライベートコルビナ遺伝子25によってピノ品種で識別された4500の新しい遺伝子座から転写産物を予測しました。
        注：これは29798ピノ・ノワールは、4392新しいピノ遺伝子座と179コルビナプライベート遺伝子を転写産物を予測備える、34651特定の60量体プローブの生産を関与しました。
    6. 以下のように4パック形式の仕様に基づいたハイブリダイゼーションアセンブリを準備します。
      1. 41.8の最終容量でのCy3標識cRNAの1.65μgのを配置純RNaseフリー水μlの。ブロッキング剤10倍と2.2μlの25X断片化バッファー11μlを添加します。 RNAを断片化するために恒温槽中で30分間60℃でインキュベートします。直ちに1分間氷上で冷却します。
      2. 最後に、室温で15,500×gで1分間ピペッティングし、スピンによってよく混ぜ、2×ハイブリダイゼーション緩衝液の55μlを添加します。速やかに氷上でマイクロ遠心チューブを配置します。すぐに使用し、それを保存しないでください。
    7. 次のようにカスタムマイクロアレイをロードします。
      1. ハイブリダイゼーションチャンバーのベースにラベル面を上にしてガスケットスライドをロードします。ゆっくりと泡を避け、ピペットの先端で液体を分配、各ウェルのガスケットの上にステップ3.2.6.2で得られたハイブリダイゼーション100μlの試料をロードします。
      2. ゆっくりカスタムマイクロアレイは、数値バーコードが上を向いていることを確認して、下に向けて置きます。サンドイッチペアが適切に配置されていることを確認します。最後に挟まれた上にハイブリダイゼーションチャンバーのカバーを置きますスライドチャンバー上にクランプを手で締めます。気泡の移動度を評価するために組み立てられたチャンバーを回転させます。
    8. オーブン65℃に設定し、ハイブリダイゼーションにロティサリーで組み立てスライドチャンバーを置きます。 10 rpmで回転するように回転子を設定します。ハイブリダイゼーションは17時間進行させます。
    9. 次のようにマイクロアレイスライドの洗浄を続行します。
      1. まず、3スライド染色の料理を準備し、適切な洗浄バッファーでそれらを埋める：室温で洗浄緩衝液1と2皿と予め温めた（37℃）洗浄バッファー2で1皿。
      2. ハイブリダイゼーションチャンバを分解し、サンドイッチを削除します。上向きにマイクロアレイスライド数字バーコードを使用すると、室温で洗浄緩衝液1を充填した最初のスライド染色ディッシュにサンドイッチを沈めると、きれいな鉗子の助けを借りて、マイクロアレイスライドからガスケットを分離します。すばやくスライドラックにマイクロアレイスライドを転送し、洗浄緩衝液1を充填した第2のスライド染色皿に入れてくださいRTで。
      3. マグネチックスターラー上にスライド染色ディッシュを入れて、中程度に撹拌しながら1分を洗います。迅速に予熱した（37℃）洗浄緩衝液2を充填した第三のスライド染色皿にスライドラックを転送し、適度な攪拌しながら1分を洗います。
      4. ゆっくりとスライド染色ディッシュからラックを削除し、慎重にラックからスライドを削除し、液滴を回避することができます。
        注：洗浄バッファーにトリトンX-102を追加し、アセトニトリル洗浄工程を省略しないでください。
    10. 室温で暗所での洗浄チップを保管してください。
  3. マイクロアレイをスキャンし、顕著な特徴を抽出します。
    1. 適切なスキャナにマイクロアレイスライドを配置し、マイクロアレイメーカーの取扱説明書で推奨パラメータ設定を使用して、各配列をスキャンします。ここで説明する結果を得るためには、スキャン手順を容易にするために、スライドホルダーに各マイクロアレイスライドを配置します。
    2. 出力をインポート.shpの数値の蛍光値にデジタル信号を変換することができる適切なソフトウェアでファイル。ハイブリダイゼーション手順が成功したことを確認するために、品質管理レポートを確認してください。
      1. ここに記載の結果を得るために、特徴抽出ソフトウェアの取扱説明書で推奨されるパラメータ設定を使用して、 表4に列挙されたパラメータは、製造業者によって与えられた正常範囲内であることを保証するために品質管理レポートを調べ。
メトリック名 上限 下限 説明
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 NA いずれかのチャンネルでムラの外れ値を特徴としている機能の割合
DetectionLimit 2.00 0.10 平均プラス直線濃度範囲を下回るスパイクインの1標準偏差
absGE1E1aSlope 1.20 0.90 E1aプローブの濃度対信号のためのフィットの傾きの絶対
MedCVProcSignal 8.00 NA 処理された信号の中央値％のCV
gNegCtrlAveBGSubSig 5.00 -10.00 バックグラウンドの平均値は（BGSubSignalが特徴からBGUsedと呼ばれる値をsubstractingによって計算された信号を意味する）すべてのインライヤネガティブコントロールの信号を減算しました
gNegCtrlAveNetSig 40.00 NA すべてインライヤ陰性対照の正味の信号の平均
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 NA の標準偏差背景はすべてインライヤ陰性対照の信号を減算しました
gNonCntrlMedCVProcSignal 8.00 NA 非対照プローブの処理された信号のための中央値％のCV
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 NA 背景トレンド除去フィットの残留

表4：マイクロアレイハイブリダイゼーションの品質を確認するためにチェックされる主なパラメータ。

  1. マイクロアレイデータを処理します。
    1. すべてのマイクロアレイスライドがスキャンされ、品質管理を積極的に評価された後、各プローブの生の蛍光強度を表し、各単サブアレイ結果ファイルからgProcessedSignal値を選択することにより、タブ区切りデータマトリックスを準備します。
    2. スプレッドシートでは、各アレイ（P値）と計算学会内の75 パーセンタイル値のデータを正規化R比を計算するために、すべての異なるサブアレイ間のすべてのP値の平均値を食べました。
    3. その後、同じスプレッドシート上で、独自のサブアレイのR比に各gProcessedSignal値を正規化します。

メタボロミクスとトランスクリプトミクスデータの詳細な統計分析を行う4.

  1. 統計解析ソフトウェアを準備します。
    注：このケーススタディ、PCAを行うことができるソフトウェアでは、PLS-DAとO2PLS-DAを使用しました。
    1. メタボロミクスとトランスクリプトミクスデータをインポートします。 MZmineソフトウェアを用いて得られたデータ行列をインポートするには、新しい正規プロジェクト→→新レギュラープロジェクトをファイルに移動。 [編集]→をクリックすると、行列全体→ホームをトランスポーズして、適切なプライマリおよびセカンダリID→[完了]を割り当てます。
    2. 平均データを中心とパレートスケールを使用して拡張できます。ホーム]ウィンドウで、[編集]→[M1に移動し、適切なパラメを変更データに依存メータ。ここで説明する結果を得るためには、パーに単位分散からスケールを変更します。
    3. 単位分散の設定を使用して、トランスクリプトミクスデータを拡大縮小。
  2. 多変量解析を行います。
    1. Fのigure 2に示すようにPCAを実装します。このケーススタディでは、PCAは、異なる熟成段階と成長の季節を反映して、サンプル間の主な相違点を明らかにしています。
      1. ワークセット]ウィンドウで、モデルタイプとしてPCA-Xを選択します。プレス自動調整。彼らはモデルの品質についての考えを与えるようR2X（兼）とQ2（兼）の値に注意してください。
        注：一般的に、非常に高いR2X（兼）とのより良い値が高いモデルが、モデルは、データをオーバーフィットすることがあります。経験則として、我々はQ2（兼）値が低下し始めるとき主要コンポーネントを追加を停止します。
      2. 次に、サンプルの可能なグループ分けを示しているプロットを見るためにスコア→散布を選択します。
      3. PCAを点検プロットをスコア。良好なモデルが得られた場合（Q2cum> 0.5）、O2PLS-DAモデル（ステップ4.2.2）を構築するために、サンプルの同じクラスを使用します。
    2. マクロゾーンによって分類サンプルを使用して、2つのO2PLS-DAモデルを構築し、200順列と順列検定を使用してモデルを検証します。
      1. 新品同様→M1→観測→ホーム画面に行くことによってクラスを割り当てます。希望のクラスを設定します。そして、-DAをO2PLSするPCA-Xからモデルタイプを変更します。プレス自動調整。 PLS-DAモデルの構成要素の数がO2PLS-DAのそれと同じであることを確認してください。
      2. O2PLS-DAモデルを検証するには、CV-ANOVAを分析し、右p値を見に行きます。また、ホーム画面→M2のように新規をクリックして、PLS-DAにO2PLS-DAからモデルタイプを変更します。プレス自動調整。
      3. →順列を分析し、200順列（選択解除再計算順列オプション）を実行するために移動します。
        注：最終的な出力は、内のR2値のショウウィンドウを示していますQ2はY軸の負の部分をヒットする必要がありながら、ldは、一般的に、0,4の下の値にY軸を打ちます。 R2および/またはQ2の値が正しくない場合は、PLS-DAとO2PLS-DAモデルで両方のコンポーネントの数を減らします。
      4. プロジェクトウィンドウでM2を選択し、プロットし、サンプルクラスの位置を確認するために散布→スコアをクリックして進みます。一つ以上の特定のクラスを特徴付ける代謝産物何を観察するには、/リスト→散布図をプロットしに行きます。
      5. それぞれ、（CORR）シリーズを追加し、PQにX軸およびシリーズでアイテムを変更→観察および荷重に選択データ型を変更し、PREDコンプ1にし、いずれか2または他の成分が存在する場合。
      6. プロット上に押され、マウスの右ボタンを使用すると、分子およびクラス間のプロットシンボルを区別するために利用規約ではプロパティ→カラーに移動して選択します。所望の特性を有するプロットを修正するために軸および/またはスタイル→レイアウト→フォーマットプロットに移動します。
      3. <メタボロミクスO2PLS-DA分析、ヒストグラムなどの代謝産物の特定の代謝産物またはクラスの相対的なレベルで存在する差異の結果に基づいてLI>。
    3. トランスクリプトミクスのO2PLS-DA分析の結果に基づいて、取得および遺伝子オントロジー（GO）が28を分類に差動的に変調された遺伝子を割り当てます。
    4. 手動代謝産物レベルおよび遺伝子発現の間の関係を識別します。

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結果

この資料に記載されているケーススタディでは、比較的189サンプル間の定量化分子イオンプラスその同位体、付加物およびいくつかの断片を含む552の信号（ のm / zの機能）、（7ブドウ畑×3熟成段階×3栽培期間xを含む最終データ行列が得られました3生物学的複製）。データポイントの合計数は、したがって、104328でした。断片化ツリー分析は、代謝産物に加えて付加体、同位体およびその断片に対応する282 のm / zの機能注釈をもたらしました。 PCAにより全データ行列の探索的分析は、熟成の段階に応じてサンプルがクラスタ化されたことが示された（veraison、半ば熟成と熟した）は、第1および第2主成分（T1-T2、 図2A）に沿って、かつ沿って成長する季節に応じて第3主成分（T1〜T3、 図2B）。

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ディスカッション

この記事では、メタボロミクス、トランスクリプトミクスとブドウ果実のテロワールの概念を解釈するために使用される統計解析プロトコルについて説明します。 HPLC-ESI-MSによるメタボロミクス解析を同時に代謝産物の多くを検出するのに十分な感度であるが、相対的な定量は、マトリックス効果とイオン抑制/増強に影響されます。しかし、同様のアプローチが既にコルビナ果実の熟成及び収穫後の枯死を記述するために使用されており、マトリクス効果の補正が結果5への影響は限定的でした。さらに、同じ試料を用いて、非標的メタボロミクスのためのNMRおよびLC-MSの比較堅牢性を決定するために、最近の大規模なマルチインストゥルメント研究室間の研究では、さまざまな楽器や技術を6一貫した結果が得られたことを明らかにしました。本明細書中に記載のケーススタディでは、3マクロ-Zで7ブドウ園から3熟成の段階でサンプルの収集と分析を関与しました3生育期を超えるもの。ここで、テロワールの署名がPCAとO2PLS-DAの多変量統計を用いて、（3ブドウ畑で表さガルダ湖とソアーヴェ、2ブドウ畑によって表される各、およびヴァルポリチェッラ、）マク...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、EUが資金提供したCOST ACTION FA1106 "トマトとブドウの木の果肉質の品質を制御する開発メカニズムを決定するための統合システムアプローチ"内で調整されたネットワーク活動の恩恵を受けました。"この研究は、カリヴェローナ銀行財団が資金提供した「Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale」プロジェクトと、イタリア農林政策省が資金提供した「Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)」プロジェクトの支援を受けました。SDSは、イタリア大学研究省FIRBのRBFR13GHC5プロジェクト「環境相互作用による遺伝子型におけるブドウのエピゲノム可塑性」によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ミルグラインダーIKAIKA A11 ベーシック
HPLC オートサンプラーベックマン・コールター-System Gold 508 オートサンプラー
HPLC システムベックマン・コールター-System Gold 127 ソルベントモジュール HPLC
C18 ガードカラムグレース -Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) ガードコラム
C18 コラムグレース -アルティマ HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) カラム
質量分析計Bruker Daltonics -Bruker Esquire 6000;質量分析計にはESIソースが装備されており、分析装置はイオントラップでした。
抽出溶媒およびHPLCバッファーSigma34966メタノールLC-MSグレード
Sigma94318ギ酸LC-MSグレード
Sigma34967アセトニトリルLC-MSグレード
Sigma39253水 LC-MS グレード
Minisart RC 4 シリンジフィルター (0.2 μm)Sartorius17764
データ収集(a)および処理のためのソフトウェア(b)Bruker Daltonics-BrukerDaltonics Esquire 5.2 Control(a);Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 software (b)
Spectrum Plant Total RNA kitSigma-AldrichSTRN250-1KTFor total RNA extractino from grape pericarps
Nanodrop 1000Thermo Scientific1000
BioAnalyzer 2100Agilent TechnologiesG2939A
RNA 6000 Nano ReagentsAgilent Technologies5067-1511
RNAチップAgilent Technologies5067-1511
Agilent Gene Expression Wash Buffer 1Agilent Technologies5188-5325
Agilent Gene Expression Wash Buffer 2Agilent Technologies5188-5326
LowInput QuickAmp Labeling kit One-ColorAgilent Technologies5190-2305
Kit RNA Spike In - One-ColorAgilentTechnologies5188-5282
遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットAgilent Technologies5188-5242
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104for cRNA purification
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer MicroarrayAgilent TechnologiesG2514F-048771 
eArrayAgilent Technologies-https://earray.chem.agilent.com/earray/
>Gasket スライドAgilent TechnologiesG2534-60012Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization
Thermostatic bathJulabo-Hybridization
ChamberAgilent技術G2534-60001
マイクロアレイハイブリダイゼーションオーブンアジレントテクノロジーG2545A
ハイブリダイゼーションオーブン ローテーターラックアジレントテクノロジーズ G2530-60029
ローテーターラックコンバージョンロッドアジレントテクノロジーズ G2530-60030
染色キットバイオオプティカ10-2000スライド染色皿とスライドラック
マグネチックスターラー装置アレックス ヒーティングマグネティックスターラーF20540163 
サーモスタットオーブンThermo ScientificHeraeus - 6030
Agilent Microarray ScannerAgilent TechnologiesG2565CA
スキャナーカルーセル、48ポジションAgilent TechnologiesG2505-60502
スライドホルダーAgilent TechnologiesG2505-60525
機能抽出ソフトウェア v11.5AgilentTechnologies-Insidethe Agilent Microarray Scanner G2565CA
SIMCA + V13 SoftwareUmetrics
ズ

参考文献

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