聴覚HEI-OC1細胞を使用した作業

サマリー

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) は、現在研究目的で利用可能な数少ないマウス聴覚細胞株の一つです。このプロトコルでは、HEI-OC1細胞を使用して、薬理学的薬物の細胞毒性効果と内耳タンパク質の機能特性を調査する方法について説明します。

要約

HEI-OC1は、研究目的で利用可能な数少ないマウス聴覚細胞株の一つです。もともとは耳毒性薬物のスクリーニングのためのin vitroシステムとして提案されましたが、これらの細胞は、薬物活性化アポトーシス経路、オートファジー、老化、細胞保護のメカニズム、炎症反応、細胞分化、薬理学的薬物の遺伝的およびエピジェネティックな影響、低酸素症の影響、酸化および小胞体ストレスの影響、および分子チャネルと受容体の発現の研究に使用されてきました。蝸牛有毛細胞のいくつかの重要なマーカーの中で、HEI-OC1細胞は、外側の有毛細胞のパラダイムモータータンパク質であるプレスチンを内因的に発現します。したがって、この重要な聴覚タンパク質の新たな機能的側面を解明するのに非常に有用です。HEI-OC1細胞は非常に堅牢で、通常、その培養は大きな合併症をもたらさない。ただし、ストレプトマイシンやその他の抗生物質を含む一般的な抗菌カクテルの使用を避けることや、細胞増殖を刺激するために33°Cでインキュベーションしたり、細胞分化を誘発するために39°Cでインキュベーションしたりするなど、いくつかの特別な条件が必要です。ここでは、HEI-OC1細胞の培養方法と、細胞増殖、生存率、死死、オートファジー、老化などの一般的なアッセイでの使用方法、およびパッチクランプおよび非線形静電容量測定の実施方法について説明します。

概要

コルチ1のハウス耳研究所-臓器（HEI-OC1）細胞は、トランスジェニックマウスの^1,2の聴覚器官に由来しています。 33℃/ 10％CO _2（許容条件）で、このトランスジェニックマウスからの任意の細胞のインキュベーションは、脱分化と加速増殖をトリガーする不死化遺伝子の発現を誘導します。 39℃/ 5％CO ₂の少なくともHEI-OC1、細胞死^2,3の場合には、増殖、分化を減少した（非許容条件）リードに対して細胞を移動させます。

HEI-OC1細胞をクローニングし、十年以上前に私たちの研究室で特徴付けられ、そして初期の研究は、彼らが特定のそのようなプレスチン、ミオシン7aと、のAtoh1、BDNF、カルビンジンおよびカルモジュリンなどの蝸牛有毛細胞のマーカーだけでなく、支援のマーカーを発現することが示されましたコネキシン26及び線維芽細胞増殖因子受容体^（FGF-R）2のような細胞です。したがって、それはHEI-OC1はのCommoを表すことが示唆されましたコルチ²の器官の感覚と支持細胞のためのn個の前駆細胞。薬は、非耳毒性考えながら並列研究はペニシリンのように^、2,3なかった、シスプラチン、ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンのような典型的な耳毒性薬が誘発されることをこれらの細胞におけるカスパーゼ3活性化を強力な証拠を提供しました。従って、この細胞株は、耳毒性に関与する細胞および分子機構を調査し、新しい薬理学的薬剤の潜在的な耳毒性またはotoprotective特性のスクリーニングするためのインビトロ系として提案されました。 HEI-OC1細胞を、過去10年間に発表された百以上及び五十の研究において使用されていると推定されます。

異なる薬剤の潜在的なプロアポトーシス効果を見ているが、この細胞株を含む研究のほとんどの主要な目標であったが、オートファジーと老化のような他の重要な細胞プロセスはちょうどHEI-OC1細胞^4-7で調査され始めています。私naが我々の研究室⁸からの最近の研究では、我々は頻繁に診療所で使用される異なる薬理学的薬剤によって誘導される細胞死、生存、増殖、老化およびオートファジーに関するデータの包括的なセットを収集するためにHEI-OC1の細胞を使用しました。我々はまた、同一の治療を受けてHEK-293（ヒト胎児腎臓細胞）およびHeLa細胞由来のもの（ヒト上皮細胞）でHEI-OC1細胞の応答の一部を比較しました。我々の結果は、HEI-OC1細胞を、試験下のメカニズムの少なくとも1つに特有の用量及び時間依存性の感度で、特性ようにザ各薬物に応答することが示されました。また、実験結果の正しい解釈は、複数の技術⁸と平行した研究を行う必要がありますことをその研究に強調しました。

別の研究では、プレスチンの機能的応答を評価するためのHEI-OC1細胞の使用、蝸牛外有毛細胞のモータータンパク質^{（OHCS）9を}調査しましたアップ。私たちは、許容（P-HEI-OC1）および非で培養HEI-OC1細胞におけるプレスチン発現パターンと同様に、非線形容量（NLC）および全細胞パッチクランプ研究にフローサイトメトリーおよび共焦点レーザー走査顕微鏡研究報告しました許容（NP-HEI-OC1）条件。我々の結果は、NP-HEI-OC1細胞で時間依存的に総プレスチン発現および原形質膜局在化の増加の両方。興味深いことに、我々はまた、全細胞発現の有意な変化なしに細胞質への形質膜からトランスロケーションのNa ⁺ K ⁺ ATPアーゼの減少と相関NP-HEI-OC1の細胞の細胞膜でのプレスチンの局在の増加ことがわかりました。また、我々は、P-HEI-OC1細胞は原形質膜に存在するプレスチン分子の密度が増加したときに減少し、運動機能を、プレスチンに関連付け堅牢なNLCを有することを実証しました。要するに、これらの結果は、HEI-OCの有用性をサポート1細胞は、聴覚タンパク質を調査します。

このビデオの記事では、我々は文化HEI-OC1細胞に、なぜ薬剤誘発性細胞毒性のメカニズム/秒を評価する方法、細胞毒性研究のために許容条件（P-HEI-OC1）で増殖する細胞を使用するのが便利であるとどのように方法について説明します電気生理学的研究を行うために（ 例えば 、パッチクランプ、非線形キャパシタンス（NLC））はプレスチン、蝸牛OHCSの分子モーターの機能的特性を調べました。

プロトコル

1.細胞培養

注：すべての細胞培養プロトコルは、適切な細胞培養技術を使用して実行されなければならない（：実験室ハンドブックVolume I ¹⁰参照用細胞生物学の最初の3章を参照のこと）。 HEI-OC1細胞は、適切な接着および増殖のための細胞培養皿の任意の追加のコーティングまたは治療を必要としません。非常に重要：細胞培養​​の目的のためにガラス製品食器を使用しないでください。表現型および薬理学的薬剤に対する細胞の生物学的応答は、（G Kalinec＆F Kalinec、未発表）を変更します。従来のプラスチック細胞培養皿を（材料/機器の表を参照）をお勧めします。汚染を避けるために、無菌技術に特別な注意を払うが、HEI-OC1細胞と抗生物質（ 例えば 、アンピシリンまたはストレプトマイシン）を使用することはありません。必要であれば、HeLaおよびHEK-293細胞は、HEI-OC1 ^8、任意の他の細胞株は、可能性のある以前の研究において対照として使用されてきたが、アンホテリシンBを使用この目的のために許容できます。

1. 冷凍HEI-OC1細胞の蘇生
   注：線条^13,14を vascularisからこのプロトコルはまた、同じトランスジェニックコルチ^11,12の臓器から、そのようなOC-K3として、私たちの研究室で開発されたマウス、およびSV-K1から他の細胞株を使用することができます。
   1. 液体N ₂から凍結保存しHEI-OC1細胞のバイアルを取り出し、37℃の水浴に入れてください。バイアルの下半分のみを水没、そして氷のわずかな量がバイアルに残るまで、それは解凍することができます。 70％アルコールでバイアルの外側を拭いてください。
   2. バイアルからの細胞をピペットでゆっくりと全体積（〜1.5×10 ⁵細胞/ ml）を送達する15ミリリットルに、降下によってダルベッコ変法イーグル培地（のような予め温めた増殖培地10mlを含有する円錐管を、ドロップDMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。
   3. トンを廃棄し、5分間、300〜500×gでチューブを遠心分離することにより、DMSOを削除します彼は上清および再懸濁し、新鮮な増殖培地（DMEM + 10％FBS）の9ミリリットルで細胞を。チューブの底に触れるピペットの先端に3〜4回、ピペットからの培地およびその逆に、懸濁された細胞のフラックスおよび還流により、細胞の塊またはシートを脱凝集。
   4. 100 mmの直径の未処理、プラスチック細胞培養皿中で増殖培地中に懸濁された細胞の総容積を置きます。
   5. 10％CO _2（許容条件）で33℃で細胞をインキュベートします。
2. HEI-OC1細胞のサブカルチャー
   注：コンフルエンス前に（〜80％）の細胞が培養死にかけを防止するために、サスペンションと継代培養に持ち込まれるべきです。このプロトコルはまた、線条から^13,14を vascularis、コルチ^11,12の臓器、およびSV-K1から、このようなOC-K3と同じトランスジェニックマウスから我々の研究室で開発された他の細胞株、一緒に使用することができます。
   1. 古い培地を除去し、2mlのPBSで細胞を洗浄。
   2. 表面積25cm ²のあたりを1ml用いて、0.25％トリプシン溶液で細胞単層を覆います。次のステップに移動するには、細胞の40％以上が切り離されなければなりません。必要に応じて、倒立顕微鏡を用いて細胞を調べて、「平手打ちまたはタップし、「残りの付着した細胞を解放するために静かに培養皿を。
      注：細胞死を引き起こす可能性があります長時間トリプシン処理として注意してください。十分かつ計画的研究のために移入された細胞はなります不足していません。
   3. 1.1.3に記載の手順に従って、細胞を再懸濁し、15mLのコニカルチューブに移します。
   4. 300〜500×gで5分間遠心し、培地を廃棄し、新鮮な増殖培地で細胞を収集し、少なくとも、4 100ミリメートル直径の細胞培養皿をそれらをシードします。ディッシュあたりの細胞数は、回収された細胞の量に依存するであろう。 10％CO _{2（P-HEI-OC1）}で33℃で細胞をインキュベートして、再度のために必要な回数を分割計画された実験や新株を生成します。
   5. 株式の準備のために、250〜550ミリリットルの細胞培養フラスコにより100ミリメートル直径の料理を置き換えます。実験のために、小さな皿またはマルチウェルプレートは、より適切であり得ます。
   6. 彼らは〜80％コンフルエンスに達するまでの分化のために、許容条件下でHEI-OC1細胞をインキュベート。その後、2〜3週間、5％CO _{2（NP-HEI-OC1）}で39℃に皿を移動します。
      注：細胞を漸進的に増殖すると死んで停止します。死細胞を除去するために、一日おきに培地を変更します。細胞の元の数に応じて、通常3〜4週間後にはより多くの細胞を実験に使用できなくなります。分化は、すぐに細胞がNP条件に置かれるように開始しますが、すべてのセルは同じペースで区別していません。分化プロセスの間に重要なことは、プレスチン発現と膜局在化が増加した （ 図4、 代表的な結果を参照してください）、定性を提供および分化のレベルの定量的な指標。

2.薬物細胞毒性研究

注：許容条件（P-HEI-OC1）で成長したHEI-OC1細胞（ 図 1、 代表的な結果を参照してください）これらの研究のために推奨されています。

1. 細胞生存率（MTTアッセイ）
   1. 1.2に記載された手順に従うことによって、P-HEI-OC1細胞を収集し、自動細胞カウンターまたは血球計のいずれかでそれらを数えます。 2.0×10 ⁵細胞/ mlに濃度を調整します。
   2. 、96ウェル透明平底プレート（ウェル当たり100μl）を上に細胞をシード基板への取り付けのために一晩インキュベートし、次いで、目的の薬とそれらを扱います。ブランクおよび非処理細胞（コントロール）を含めることを忘れないでください！
   3. 薬物治療（33℃、通常24または48時間）した後、製造者のプロトコルに従ってMTTアッセイを行います。一般に、このアッセイのためのプロトコルは、以下のステップがあります。
      1. 各ウェルにMTT試薬10μlのを追加します。
      2. 紫色の色素が表示されるまで、2〜4時間、37℃でプレートをインキュベートし、各ウェルにMTT洗剤試薬100μlのを追加します。プレートを振らないでください。
      3. プレートを覆い、37℃で2〜4時間、暗闇の中でそれを残します。
      4. ブランク（単独で、増殖培地）を含む各ウェルに570 nmの吸光度を測定するためにマイクロプレートリーダーを使用します。生存率100％とコントロール細胞の平均ODを使用してデータを正規化します。
2. カスパーゼ3/7活性化アッセイ
   注：許容条件（P-HEI-OC1）で成長したHEI-OC1細胞は、これらの研究のために推奨されています。
   1. 1.2に記載された手順に従うことによりHEI-OC1細胞を収集し、自動細胞カウンターまたは血球計のいずれかでそれらを数えます。 2.0×10 ⁵細胞/ mlに濃度を調整します。
   2. WH上の細胞をシード（ウェル当たり100μl）を96ウェルプレートをITE肉、基板への取り付けのために一晩インキュベートし、次いで、目的の薬とそれらを扱います。ブランクおよび非処理細胞（コントロール）を含めることを忘れないでください！
   3. 薬物治療（33℃、通常24または48時間）した後、それぞれの製造者のプロトコルに従ってカスパーゼアッセイを行います。一般的に、このアッセイのためのプロトコールは、以下のステップを有します。
      1. 、試薬を準備するだけでなく、それらを混合し、それらを室温に平衡化することができます。
      2. インキュベーターから細胞を除去し、プレートを室温に平衡化することができます。
      3. 同じピペットチップで異なるサンプルを含むウェルに触れていないことにより、交差汚染を避けるために注意しながら、各ウェルに試薬の指示量を追加します。
      4. プレートをカバーし、300〜500 rpmでプレートシェーカーを用いて30秒間混ぜます。
      5. 少なくとも、30分の期間、室温でプレートをインキュベートします。 Determin経験的に最適なインキュベーション時間を電子。室温が温度の変動が発光の読み取りに影響するため、恒温培養器を使用変動する場合。
      6. 各ウェルでの発光を測定し、カスパーゼ活性化の100％とコントロール細胞における平均発光を使用して値を正規化します。
3. 細胞分裂（増殖）
   1. 1.2に記載された手順に従うことによりHEI-OC1細胞を収集し、自動細胞カウンターまたは血球計のいずれかでそれらを数えます。 2.0×10 ⁵細胞/ mlに濃度を調整します。
   2. 、96ウェル透明平底プレート（ウェル当たり100μl）を上に細胞をシード基板に取り付けるための許容条件で一晩インキュベートし、次いで、目的の薬とそれらを扱います。ブランクおよび非処理細胞（コントロール）を含めることを忘れないでください！
   3. 一時間処理した後、各ウェルに準備された100倍のBrdU（5-ブロモ-2'- deoxyuriの1μlを添加します）ソリューションを食事をし、33℃のインキュベーターにプレートを返します。
   4. 12、24および48時間後に、対応するプレートから既存のメディアを除去し、PBSでよく一度それぞれを洗います。
   5. 製造業者のプロトコルに従って細胞増殖アッセイを実行します。一般的に、このアッセイのためのプロトコールは、以下のステップを有します。
      1. 固定/製造業者のプロトコルに示されるように、溶液、洗浄緩衝液は、一次抗体の検出溶液、二次抗体検出溶液とのBrdU変性溶液を含む試薬を準備します。
      2. 製造業者のプロトコルに示された量で、各ウェルに固定/変性溶液を加え、30分間室温でプレートを保持します。
      3. 固定/変性溶液を除去し、製造者のプロトコルに示されている濃度の一次抗体を追加します。 1時間室温でプレートを保管してください。
      4. 主要なアリとソリューションを削除しますibody、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、その後製造業者のプロトコールに示した濃度の二次抗体を加えます。室温で30分間、二次抗体を用いてプレートを保管してください。
      5. 二次抗体を含む溶液を除去プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、基質を加えます。室温で10分間インキュベートした後、停止溶液を加えます。注意してください：色の変化を制御します。解決策は非常に暗くなる場合は、10分の標準的な開発時間の前に反応を停止。
      6. STOPソリューションを追加することの30分以内に450 nmの吸光度を読みます。
4. 細胞毒性
   注：許容条件（P-HEI-OC1）で成長したHEI-OC1細胞は、これらの研究のために推奨されています。
   1. 細胞培養培地単独（対照）または培地プラス興味のある薬で、24〜48時間、通常、許容条件下でHEI-OC1細胞をインキュベートします。
   2. 処置の終わりにPBSで細胞を3回洗浄し、3分間の非酵素的細胞解離溶液の表面積25cm ²のごとに1 mlで使用切り離します。
   3. 5分間3000×gの遠心分離により細胞を回収し、ペレット化し、取り外した後、上清を除去し、細胞毒性アッセイに含まれる試薬と暗闇の中で15分間細胞を染色。
   4. フローサイトメーターの製造業者によって示さサイトメトリーのように流れによって生HEI-OC1細胞の数を決定します。
5. 老化
   1. 細胞培養培地単独（対照）または培地プラス興味のある薬で、24〜48時間、通常、許容条件下でHEI-OC1細胞をインキュベートします。
   2. 信頼性の高い結果を提供することが知られてDebacq-Chainiaux ら ¹⁵またはその他の方法により、記載されたプロトコルで、フローサイトメトリーを用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ陽性細胞の数を決定します。フローサイトメトリーのための簡単​​なプロトコルは次のとおりです。
      <実験処理の終了時にLI>、PBSで細胞を3回洗浄した後、許容条件で1時間、細胞培養培地中で100nMのバフィロマイシンA1でそれらをインキュベートします。
      1. 〜33μMの最終濃度でC12FDGを追加し、1〜2時間細胞をインキュベート続けます。
      2. 3分間の非酵素的細胞解離溶液の表面積25cm ²のごとに1 mlで使用して収穫、PBSで細胞を2回洗浄し、5分間、3,000×gで遠心分離することによってそれらをペレット。
      3. 氷冷PBSで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターの製造業者によって示されるように、フローサイトメトリーによって正のHEI-OC1細胞の数を決定します。
6. 自食作用
   1. HEI-OC1細胞が制御集め、飢餓状態（48時間血清を奪わ）1.2に記載された手順に従うことにより、標準的なプロトコル以下のウェスタンブロットのためにそれらを処理します。一般的には、ウェスタンブロットのためのプロトコルは、以下の目を持っていますEPS：
      1. 1.0×10 ⁵細胞/ mlの濃度で6ウェルプレート中の種子HEI-OC1細胞。 24および/または48時間後に、氷冷PBSで細胞を洗浄します。
      2. 氷上で5分間、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび1mM PMSFとTNESV緩衝液200μlで溶解（1％NP40、50mMのトリス塩酸pH7.5の、100mMのNaCl、2mMのEDTA、1 mMののNa ₃ VO _4）。
      3. 4℃で5分間、16,800×gでマイクロ遠心チューブと遠心分離機に転送し、（各ウェルの底をこすることによって）細胞を収集します。
      4. 上清を収集し、BCAアッセイを用いてタンパク質濃度を定量化します。
      5. 5×ローディング緩衝液および1mMのDTTを各試料に添​​加し、タンパク質を変性させ、5分間沸騰させます。
      6. 4〜12％ゲル上でSDS-PAGEを使用してサンプルを実行し、PVDF膜に移します。
      7. RTで60分間、0.1％のTween 20を含むTBS-T中の5％脱脂粉乳で膜をブロックします。
      8. プライマリアリで4℃で一晩、膜をインキュベートibodies。
      9. 翌日、TBS-Tで十分に膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（1：1,500）にコンジュゲート二次IgG抗体とインキュベートし、1時間。
      10. 増強化学発光（ECL）検出システムとの免疫反応性を検出します。標準として：（10％脱脂粉乳を含むTBS-Tで2000 1）GAPDHを用いたタンパク質の発現レベルを正規化します。
   2. ウェスタンブロットでは、の発現を調査し、少なくとも、そのようなベクリン-1およびLC3Bとしてオートファジーの二つの異なるマーカー（通常は1：2.5％BSAを含むTBS-T 1,000希釈）。 GAPDHまたはアクチンなどのタンパク質発現の制御を探すことを忘れないでください。
   3. このようなパブリックドメインNIHイメージまたはImageJの（http://rsb.info.nih.gov/nih-image/）などのデジタルブロットスキャナやコンピュータソフトウェアを使用してデンシトメトリーにより目的のタンパク質の発現を評価します。

HEI-OC1細胞3.電気生理学実験

1. 収穫細胞
   注：使用した細胞は、50％-80％の集密度で直径100mmの培養皿中で増殖します。トリプシン、のAccutase、酵素を含まない溶液、またはpの hosphate- uffered のアリーン+ E B thylene D iamine トンクジラの酸（PBS-EDTA）はgigasealsの数と質に重大な影響を与えることなく細胞を持ち上げるために使用することができるETRA 。しかし、場合によっては、トリプシン処理細胞はより脆くなります。これらの場合において、細胞は、実験を開始する前に、約30分間回復させます。
   1. ^{2+ の} Ca ²⁺及びMgずに10mlのPBSで細胞を2回洗浄します。
   2. このような非酵素的細胞解離溶液として、無酵素デタッチャ溶液2mlを追加し、5％CO ₂で37℃で3分間の料理をインキュベートします。
   3. 細胞の剥離を確認するために倒立顕微鏡を使用してください。必要であれば、セルを移動させますより多くの細胞を剥離するが、静かにそれを行うにはリットルの培養皿。
      注：料理を振らないでください。
   4. DMEM + 10％FBSの10ミリリットルを加え、穏やかに上昇し、10 mlのピ​​ペットで5回上下細胞をピペット。
   5. 顕微鏡下で細胞を見てください。細胞の> 80％が既に（シングル）分離されている場合、それ以上のピペット操作は必要ありません。細胞は、クラスタに残っている場合は80％以上の細胞が単一になるまで、穏やかにピペッティングを繰り返します。
   6. 、15ミリリットルコニカルチューブに懸濁された細胞の〜10ミリリットルを置き、100×gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。
   7. 細胞を再懸濁するために - 外部記録溶液（蒸留水で310 mOsmで305に調整ライボビッツL-15培地）の〜200μLを使用してください。細胞の光制御は、滑らかな膜のエッジを持つ多くの単一、丸い細胞を示すべきです。
2. パッチクランプとNLC測定
   1. 使用して電圧依存非線形容量（NLC）のパッチクランプおよび測定を行いますdequateアンプとソフトウェアだけでなく、標準的な電気生理学的な技術。内部（intrapipette）溶液を150mMのKCl、1mMのMgCl _2、0.1mMのEGTA、2mMのATP-Mgを、0.1 mMのGTP-Na、及び10mMのHEPESを使用するように。トリスでpHを7.2に調整します。
   2. 顕微鏡下で、ラウンドと滑らかな膜のエッジと、単一、健康な細胞を選択します。細胞表面にガラスピペットの先端を取り付け、膜抵抗を確認してください。これは〜2μmのピペットの先端の内径（ID）に対応する、周りに3-6メガオームである必要があります。
   3. 静か細胞原形質膜に対するマイクロピペットの先端を押してから吸引を適用します。 100 gigaOhms（ギガシール） - 細胞膜の部分は、10の順に、電気抵抗を発生させる、ピペット内に吸引されます。
   4. 吸引パルスで細胞膜を破壊することによって、全細胞の状態を確立します。
   5. このようなHEK-293、制御⁹のようにプレスチンを発現しない細胞を、使用してください。
      注：現在の応答は5kHzでフィルタリングする必要があり、修正は、残留直列抵抗の影響のために作られました。すべてのデータの収集と分析は最も通常のロックイン増幅器に付属するソフトウェアを用いて行うことができます。容量関数は、膜電圧¹⁶に非線形電荷に関する2状態ボルツマン関数の一次導関数に適合させることができます。
      
      

結果

最近の出版物のカップルで、私たちはいくつかの一般的に使用される薬理学的薬剤へのHEI-OC1細胞の応答を評価するだけでなく、プレスチン機能^8,9を調査することを目的とした研究の包括的なセットを報告しました。これらの研究において、我々は、前のセクションで説明したすべてのプロトコルを利用しました。

これらの先行研究の結果の一つは、非許容条件下で培養HEI-OC1細胞を、（39℃/ 10％CO ₂ = NP-HEI-OC1）は細胞生存率の非常に有意な減少、および同様に有意な増加を示したことでした細胞死で、許容条件下で培養した細胞に対して、（33℃/ 10％のCO ₂ = P-HEI-OC1）（ 図1）。したがって、任意の細胞毒性試験は、培養条件の影響から識別薬物効果にかなりの努力を捧げべきNP-HEI-OC1細胞上で行いました。 additioで細胞に対する薬...

ディスカッション

このレポートでは、どのように文化HEI-OC1細胞をに説明し、薬剤誘発性細胞毒性のメカニズムを評価するためにそれらを使用し、プレスチン、蝸牛OHCSの分子モーターの機能特性を調査します。技術的手順は、しかしながら、容易に別の試験に適合することが十分に一般的です。

ここで説明するすべてのプロトコルは、十分に確立された細胞培養技術¹⁰の正しい使用を必要とします。ただ、他の細胞株と同様に、HEI-OC1細胞での作業は認定生物学的安全キャビネット、冷却遠心機、水浴、および細胞培養物の検査のための1つの倒立顕微鏡を用いてカウントを細胞について適切に装備した細胞培養施設を必要とし、 hemocytometric技術を使用している場合。固有の要件は、しかしながら、NP-HEI-OC1細胞39℃/ 5％CO ₂でのP-HEI-OC1細胞を33℃/ 10％CO ₂で2加湿インキュベータ、一組の利用可能性およびその他であります秒。計画された研究のみがP-HEI-OC1細胞を含む場合、第二のインキュベータを37℃/ 5異なるアッセイについ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HEI-OC1細胞			すべてのアッセイキット、機器
クラスII 生物学的安全キャビネット	Baker Company	Sterilgard III	と
冷蔵遠心分離機	Eppendorf	5810R	PREVIOUS 2 COLUMNSに示されている企業は、
倒立顕微鏡	Zeiss	Axiovert 25	EXAMPLESのみであり、他の同様の
Waterbath	Stovall	HWB115	製品を使用することができます。
セルカウンター	Nexcelom	Cellometer Auto T4
2つのセルインキュベーター、1つは33°C;C/10% CO2 およびその他 39°C;C/5% CO2	Forma Scientific	3110
細胞培養ディッシュ、PS、100 mm x 20 mm ベント付き	Greinier Bio-One	664-160
細胞培養ディッシュ、PS,  60 mm x 15 mm ベント付き	Greiner Bio-One	628160
Cellstar組織培養フラスコ  250 ml	Greiner Bio-One	658-175
Cellstar組織培養フラスコ550 ml	Greiner Bio-One	660-175
6ウェル細胞培養プレート、蓋付き-Cellstar	Greiner Bio-One	657-160
Microtest 組織培養プレート、96ウェル、蓋付き平底	Becton Dickinson	353072
Micro-Assay-Plate、チミー、96ウェル白、クリアボトム	Greiner Bio-One	655098
50 ml キャップ付きポリプロピレン円錐管 Cellstars	Becton Dickinson	352070
15 ml ポリプロピレン コニカル チューブ キャップ付き-Cellstars	Greiner Bio-One	188-271
PBS pH 7.4 (1x)	ライフテクノロジーズ	10010-023
ダルベッコのモディファイドイーグル」s Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-084
ウシ胎児血清 (FBS)	Hyclone	SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco/Invitrogen	21083-027
Trypsin, 0.25%	Life Technologies	25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  キット	Promega	G8091
BrdU細胞増殖アッセイキット	Cell Signaling	6813
非酵素的細胞解離溶液	Sigma-Aldrich	C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit	Promega	G8741
FACSAriaIII機器	BDバイオサイエンス	FACSAriaIII	488 nm励起(青色レーザー)
デジタルブロットスキャナー	LI-COR	C-DiGit
電気泳動およびブロッティングユニット	Hoefer	SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software	Molecular Devices	SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Puller for preparationパッチ電極	Sutter Instruments	P-97