小動物モデルにおける尿路感染症: 雌雄マウスの尿道カテーテル

サマリー

マウスの尿道カテーテル法の確立されたモデルなど尿路感染症、膀胱の病理の研究をできますが、女性でのみ実行することができます。今回紹介した男性の尿道注入の新しいモデルは、男女間の厳密な臨床的および疫学的違いでマークされたエリアの研究を有効になります。

要約

尿路感染症 (UTI)、非常に一般的な世界、重大な合併症と医療関連費用を負うことです。正確に病気の確立との進行を反映して、小型の動物モデルは、宿主-病原体相互作用の郭清と感染症への免疫の生成を許可します。マウスで尿路エシェリヒア属大腸菌、コミュニティの 85% 以上の原因となるエージェントの膀胱内注入は尿路感染症を取得し、感染人間観察の段階の多くを繰り返します。最近まで、ただし、UTI がメスでモデル化されるだけでした。この制限は、癌のような他の膀胱疾患として尿路感染症、セックスに関連した差異の研究を阻害しています。ここでは、女性と男性の動物間の直接比較を可能にする男性マウスを植え付けるし、フローサイトメトリーによる感染に対する宿主の反応をよりよく理解するための手段として膀胱組織を評価するために詳細なプロトコルを提供する方法をについて説明します。一緒に、これらのアプローチは、尿路感染症や膀胱疾患にみられるセックス バイアスに貢献する宿主因子の同定に役立ちます。

概要

尿路感染症 (UTI)、先進国¹の最も一般的な感染症の 1 つです。感染率は女性と新生児や高齢者の²の間で男性の間と似ています。閉経前の成人女性、ただし、男性^2,3と比較して市中の尿路感染症の発生率の大幅増加があります。この病気主に女性に影響を与える、ことを考える基礎研究と臨床研究が圧倒的に焦点を当てて UTI 女性。しかし、男性の尿路感染症は重要かつ流医療課題⁴です。確かに、男性の尿路感染症は高い罹患率に関連付けられて、ためこれらの感染症は複雑な^4,5として定義されます定期的に。

生理学および病理学のセックス先入観の中心的な役割の私達の理解の拡大に伴って、新しいメソッドがこの以前無視された病気の側面を探索する必要です。性差は免疫と感染で重要な役割を再生します。女性が男性は特定の感染症、結核、マラリア、HIV^6,7などになりやすい自己免疫疾患の発症率が高いがあります。別の泌尿器科病理膀胱癌は大幅、女性よりも男性においてより一般的、いくつかの研究は、悪性腫瘍^{8,9,10,11 の開発でアンドロゲンの役割を示しています。 ,12}。特に、ただし、膀胱癌の膀胱内注入療法の検討、繰り返し男性マウス¹³カテーテルを入れて下さいできないのため、雌の動物でのみ実行されます。

尿路感染症の病態の研究は、感染 (例えば、マウスおよびラット) の齧歯動物モデルに大きく依存します。尿路感染症のマウスモデルを用いるかもしれない uropathogens もともとクレブシエラ属や腸球菌、ブドウ球菌、プロテウス¹⁴尿路エシェリヒア属大腸菌(UPEC) など人間の感染症から分離されました。通常、細菌は尿道カテーテルで膀胱に導入されます。次の感染症、膀胱、腎臓は、感染症、細菌の植民地化、組織の損傷、またはホストの免疫反応^15,16などの特定のパラメーターを評価するために削除できます。普遍的に、ただし、女性動物だけは、尿路感染症研究のために使用されます。確かに、多くの研究は、解剖学的な理由により男性マウスのカテーテルはない可能な^13,17,18,19を指摘しています。最近では、男性の注入する外科的アプローチが記載されている、腹部を開く膀胱は腹部の開口部に穏やかな圧力を適用することによって転置される外部および²⁰膀胱に細菌を注入します。このアプローチにより、外科的介入を犠牲にして、男性の感染症です。したがって、このアプローチの主要な警告には、切開²¹に抗炎症創傷治癒応答を誘導する可能性など感染の結果に炎症の影響が含まれています。老舗非外科的経尿道的アプローチ女性齧歯動物^{22 で使用により近い男性マウスの細菌の膀胱内注入の手法を開発した我々 の利益が病気への応答における性差の理解として、}.

私たちのモデルは、確立された方法論に基づいて構築し、直接女性と男性の動物でウチに宿主免疫応答を比較する機能を提供します。このメソッドは感染、セックスによる違いの解剖を許可し、感受性の発音の違いを分子・細胞の手がかりと男女間感染への応答を提供する可能性があります。さらに、このモデルは、膀胱癌、前立腺炎の下で- またはオーバーな膀胱症候群、間質性膀胱炎など、他の膀胱関連疾患を調べるためのモデルの確立を許可する UTI 研究を超えて値を持ちます。

プロトコル

Comité d プロトコル番号 2012-0024 の承認に従ってマウス実験を行った ' éthique アン expérimentation animale パリ中心部 et シュッド (動物実験倫理委員会)、欧州指令 2010年/63 のアプリケーションでEU。

1. カテーテルの準備

1. 感染マウスのグループごとに 1 つの小児静脈アクセス カニューレを準備します。製造元の指示に従って、その針の各カニューレを売却作り付けのバネ機構を使用して。プラスチックの静脈カニューレだけを保持する、針を破棄します。
2. 1 つ紫外 (紫外線) サイクル、通常 25-30 分の層流フードのカテーテルを滅菌します。
   メモ: カテーテルは実験グループ、男女、または細菌の緊張の間新しいカテーテルを使用しかし、1 つ以上のマウスに使用できます。

2. 尿路エシェリヒア属大腸菌の感染症のための準備

1. 適切な場合、感染、滅菌接種ループ、ルリア スープ (LB) 寒天プレートの上に冷凍の細菌の在庫から連勝 UPEC を使用する前に、少なくとも 2 日間は抗生物質を含みます。37 ° C で一晩インキュベートします。プレートは、4 ° C で 1 週間保存できます。
2. 100 ml 滅菌エルレンマイヤー フラスコ 10 ml 場合 LB プレートから単一のコロニー、適切な抗生物質を含む LB を接種して立っている 37 ° c 一晩 (約 16-18 時間) を孵化させなさい。
   注: 立っている文化は 1 ピリ pili、感染症²³に必要な型の式を許可します。文化揺れ栽培は効率の pili 式を持っているため、感染率が矛盾。
3. 一晩かけて培養の光学濃度 (OD)₆₀₀を測定し、あらかじめ決められた成長曲線を用いた ml 当たりの細菌数を計算します。たとえば、UPEC ひずみ UTI89、外径₆₀₀ = 0.35 は 2 × 10⁸ CFU ml、したがって、外径₆₀₀一晩文化あたりに相当 = 2.4 13.7 x 10 に相当する⁸ CFU/ml 経験的判断との関係、外径₆₀₀と細菌感染症のために用いられるすべての新しいひずみと。
4. 50 μ l の PBS で感染している動物の数を考慮した必要な細菌の量と各マウスが約 10⁷コロニー形成単位 (CFU) を受信する必要がありますを決定します。カテーテルと注射器の要点と接種を決定に必要な 100 μ l の ~ 130 μ l のデッド ボリュームを計算に含めます。
   1. 1 分 17,000 x g で卓上遠心機で細菌懸濁液を回し、2 x 10⁸ CFU PBS で ml あたりで結果細菌ペレットを再懸濁します。この懸濁液と抗生物質に応じて、各感染症の正確な接種を決定すると、LB 寒天プレートの因数を連続希釈します。
5. 1 ml 注射器に、菌を描画し、注射器の端にカテーテルを接続します。任意の空気を除去し、注入を開始する前にカテーテルでデッドエアを領域にプランジャーを押し下げるにシリンジをタップします。

3. マウスの作製

1. 100 mg/kg のケタミン 5 mg/kg とキシラジンの腹腔内投与によるマウスを麻酔します。補足熱を提供することができます。
2. 各マウスが中型圧力の足蹠を絞ることによって完全に鎮静させられたことを確認します。マウスは、彼らは反応してこの状態に到達する 3-5 分を必要とするときに完全に鎮静されています。
3. 仰臥位マウスを配置し、中圧を尿の膀胱を空に下腹部に適用します。完全に膀胱はイレウスの紋章の間の皮膚下に豆粒のような感じ。
   注: イソフルレンの吸入はカテーテルを入れて下さい雌マウス^15,22に使用されています、しかし、それはテストされていない雄マウスはこのプロシージャの吸入のイソフルラン麻酔十分にかどうか。

4. 尿道注入雌マウスの

1. 非利き手を使用すると、尾とマウスの腹部に同じ手の指に親指を置くし、場所でマウスをしっかりと保持する方向を反対に穏やかな圧力を適用します。
2. 尿道口にカテーテルの先端をマウスに垂直に配置します。穏やかな圧力とハブが作業面に平行になるので、同時に注射器を削減しながら尿道口を満たすまで、尿道にカテーテルをスライドします。カテーテルに潤滑が必要がありません。プッシュしたり、尿道にカテーテルを強制しないでください。カテーテルは、ほとんど抵抗せずに、尿道にスムーズかつ簡単にスライドするが。
   1. 1 回接種 (ステップ 4.3) を浸透させる前にカテーテルは非常に優しく非利き手から指でマウスの頭に向かって腹部の皮膚に手がプルは既に (手順 4.1) マウスの腹部の上の場所では。場合は尿道カテーテルは、カテーテルを膣内挿入することはなく、組織が移動、カテーテルからに対し、尿道の開口部を構成する組織は移動しません。この急速なテストは、それぞれのマウスの実行必要があります。
3. カテーテルのハブには、尿道口が満たしている、ゆっくりと、菌の 50 μ l を分配します。低速注入率は、腎臓に膀胱尿管逆流を最小限に抑えます。数 5 以上の漏れを防ぐためにカテーテルをゆっくり取り外します。仰臥位で檻の中でマウスを配置します。

5 雄マウスの経尿道的注入

1. マウスの性器に頭側と尾側 2 つ親指鉗子を配置します。亀頭を完全に公開する包皮を撤回します。外部の陰茎を配置すると、一度親指鉗子をリリースします。
2. 動物に優しく、緊張して臓器を保持する垂直な突出のペニスを安定させるために鉗子の位置を変更します。尿道口を視覚化し、器官の先端に小さな開口部にカテーテルを慎重に導入します。鉗子と穏やかな緊張感を維持する、マウスの体に向かって、ペニスにカテーテルをゆっくりとガイドします。カテーテルに潤滑が必要がありません。ペニスにカテーテルを押し込まないでください。カテーテル尿道に、適切な配置を示すにスムーズにスライドしてください。
3. カテーテルのハブには、陰茎の先端が満たしている、一度、非常にゆっくりとペニスの位置を維持しながら、菌の 50 μ l を分配する必要があります。この時点であらかじめ決められた注入の品質スコアは、図 2に示すようによると、注入の品質を明記します。
4. 5 接種の漏れを防ぐために数をゆっくりとカテーテルを撤回します。仰臥位で檻の中でマウスを配置します。動物は、麻酔薬の投与 30-45 分を回復し始める必要があります。

6. 感染した臓器に CFU の定量

1. 所定の時点では、犠牲のマウスを使用しては、標準操作手順書 (例えば、頚部転位または二酸化炭素の過剰摂取) を承認しました。毛皮による汚染を最小限に抑えるための 70% のエタノールで十分に腹部を湿らせます。
2. 2 cm 以上のはさみを使用してマウスの腹部のより低い三番目の間で切開を行い、無菌 5 ml に膀胱とその他を含むが、これらに限定されない目的の臓器、腎臓、精巣、精嚢、または包皮腺を削除ポリプロピレン製スナップ キャップ チューブ 1 ml 滅菌 PBS を含みます。氷の上のすべてのサンプルを保ちます。
3. 固体組織にほぼないまま、臓器によって異なります約 15 60 秒までハンドヘルド ホモジナイザーを用いた臓器をホモジナイズしてください。脂肪がないまあ、均質化、光沢のあるベージュ ホワイト組織としてわかりやすいです。脂肪を前または次の均質化を破棄します。PBS の間続いてエタノールで、ホモジナイザーを洗う各実験または臓器グループ。
   注: 通常、ハンドヘルド ホモジナイザーまたはビード ミル ホモジナイザーを使用します。細菌生存率を維持しながらホスト組織を均質化するための最適の条件必要があります前に経験的に定められる一方、これらすべてのシステムが、24 時間後の感染症で細菌 CFU の直接の比較によって決定されると、同様の結果を得られています。日常的にこのプロトコルを実行します。
4. 均質化器官の懸濁液のシリアル希薄を実行します。プレートのとき、適切な抗生物質を含む LB 寒天プレートに希釈し, 37 ° C で一晩 (~ 15 時間)UPEC 系統倍加時間が非常に高速があるなど注意が必要ないこれは個々 のコロニーをカウントする機能を低下させるため長すぎる寒天をインキュベートします。

7. 膀胱組織のフローサイトメトリーによる解析

1. 34 単位/ml でコラゲナーゼと 100 μ g/mL、PBS で DNase を含む消化バッファーを準備します。氷の上を保ちます。動物を分析するのにあたり 1 つの 15 ml の円錐管と管ごとに分注 1 ml 消化バッファーを準備します。
2. あらかじめ決められた縦長犠牲マウスを使用して標準操作手順書 (例えば、頚部転位または二酸化炭素の過剰摂取) を承認しました。毛皮による汚染を最小限に抑えるための 70% のエタノールで十分に腹部を湿らせます。
3. 2 cm 以上のはさみを使用してマウスの腹部のより低い三番目の間で切開し全体の膀胱を外します。ミンチも、はさみで 2 〜 3 mm にサイズ²個、通常は約 8 個の膀胱を切断します。
   1. 消化バッファーを含むチューブあたり 1 つのみじん切りにした膀胱を追加します。消化バッファーにみじん切りにした膀胱組織を洗浄するために振る。氷すべて膀胱を切除し、みじん切りまで続けます。
4. 5 手で活発な動揺と、37 ° C で 60-75 分のみじん切りにした膀胱を孵化させなさい s 15 分毎。ティッシュ、ティッシュ ペーパーのようなガラスの透明な外観消化は完了です。長時間消化識別に必要な細胞の表面蛋白質を削除され、避けるべきであります。
5. 2-3 mL の冷たい流れ cytometry バッファー (PBS 2% ウシ胎児血清 (FBS)、0.2 mM EDTA を含む) を追加することで消化酵素を不活性化、軽く混ぜます。氷の上の管を配置します。
6. 単一細胞懸濁液を確認し、任意の結合組織を削除するは、管の内容を 15 mL の円錐管に 100 μ m フィルターを通過します。シリンジのプランジャーの最後がフィルターを任意の残りのティッシュを軽く押してください。追加 2 mL 流れ cytometry バッファーが付いているフィルターを洗います。氷の上のサンプルを保ちます。
7. 200 x g、4 ° C で 7 分間の遠心分離によってサンプルを洗う100 μ L 流れ cytometry バッファー含む Fc ブロック、96 ウェル底板ラウンドに 5 μ g/mL に希釈でペレットを再懸濁します。10-15 分後に、各サンプルに 100 μ L 必要な抗体カクテルを追加します。30-45 分、氷、光から保護のためのサンプルをインキュベートします。
   注: Fc ブロックは Fc 受容体を発現する細胞に抗体の Fc 部分の結合を防ぐために使用される試薬です。その目的は、非特異的な抗体の結合を最小限に抑えることです。使用する抗体の定量実験でテストされている仮説に依存するが、文献からの入力で選択する必要があります。図 3、全体的な免疫細胞の浸潤を測定する抗 CD45 抗体を用いて、パン免疫細胞タンパク質であります。
8. 200 x g、4 ° C で 7 分間の遠心分離によってサンプルを洗う200 μ L 流れ cytometry バッファーで細胞ペレットを再懸濁します、40 μ m の細胞のストレーナーを直前の流れの cytometer によるポリスチレン 5 ml チューブにサンプルを通過します。
9. 流れの cytometer で全体のサンプルを収集します。良い消化になります 200,000 400,000 セル、8,000-10,000 CD45⁺素朴なマウス膀胱、感染臓器が含まれている以上中から免疫細胞細胞¹⁶ (図 3)。
   注: フローサイトメトリー解析用試料は、CFU を評価する使用できません。その UPEC 植民地化を実証する証拠が存在しないなどの免疫細胞の浸潤が組織全体に均一な膀胱を 2 つの部分に分割することはお勧めしません。

結果

このプロトコルの開発、女性と男性の c57bl/6 マウスのコホートは 6 ~ 8 週間 1 時間から 30 日までの時点で膀胱の評価、植え付けや細菌の負担をされた高齢者。これらの研究からの結果は、他の場所で詳細な (Zychlinsky · シャーフら、保留中)。24 時間感染から代表的なデータを紹介します。特に、細菌負荷は感染後 24 時間 (図 1) でオスとメスのマウスとの間に相当します。細菌負荷の小さな変化認められた各グループ 24 hr 後感染雌マウス^15,16に報告されているものに似ています。

感染前に尿の膀胱を十分に空に注意は、雌マウスに接種の重要な漏れはめったに観察されます。しかし、雄マウスに注入は、このプロトコルの開発段階で特に漏れ、尿道から菌が大量につながった。菌...

ディスカッション

雄マウスの尿道注入にセックスが膀胱粘膜病に与える影響の多くの新しい研究の機会を提供していますが、いくつかの課題について述べる。第一に、1 つの制限は、注入がカテーテル挿入時に過剰な炎症の結果、技術的に困難であると最初に証明するかもしれない。エバンス ブルー色素などの着色溶液で死んだマウスの点眼による技術の向上を実現できます。点眼が成功したことを確認するため膀胱を視覚的に調べる必要があり、ツベルクリン注射器で抽出して浸透させた液体の量を評価できます。ゆっくりとした穏やかな動きの重要性を誇張することはできません: 抵抗なし、これが過剰な炎症や組織の損傷で起因するので、カテーテルを挿入するために使用力がない必要があります。正しく実行されると、カテーテルは尿道に楽々 スライドされます。閉塞、または抵抗が感じられる場合、カテーテルを削除し、挿入を再試行することをお勧めします。

示しましたが、細菌負荷 24 時間感染後に注入の質を関連付けることによって、細菌の菌量が少ないが、感染症の時に失われた、不完全な技術はまだ堅牢な植民地化の結果、膀胱。このプロトコルを利用したで調査官は漏れのない注入を達...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BD Insyte Autoguard シールド IV カテーテル 24 G、外径 0.7 mm、長さ 14 mM	BD Medical	381811 または 381411*	* カタログ番号は国によって異なります
接種ループ	Greiner Bio-One	731171
LB Miller broth	Difco	244620
LB Miller agar	Difco	244520
Cuvettes	Bio-rad	223-9955
シリンジ	B Braun	9166017V
親指(アドソン)鉗子	Fine Science Tools	11006-12
5 ml チューブ、ポリプロピレン	Falcon	352063
Tissue Ruptor 使い捨てプローブ	Qiagen	990890
15 ml フリップキャップチューブ	Thermo Scientific	362694
DNAse	Invitrogen	18047019
Liberase TM	Sigma-Aldrich	5401119001	、-20 °Cで分注して保存する必要があります。Cは、凍結融解の繰り返しを避けるための
100µM MACS スマートストレーナー	Miltenyi	130-098-463	15mlチューブと互換性があり、
100 & microが推奨されます。mセルストレーナー	Falcon	352360	50mlチューブと互換性があり、MACSスマートストレーナーが利用できない場合
96ウェルプレート	Falcon	353077
Fcブロック	BD Pharmingen	553142	抗CD16/CD32
抗マウスCD45抗体	BD Biosciences	561487	多くの異なる蛍光標識オプションが利用可能です
5mlチューブ フィルターキャップ付きポリスチレン	ファルコン
インスリン用シリンジ	テルモ	BS05M2913
ハンドヘルドホモジナイザー	Qiagen	9001272	TissueRuptor
フローサイトメーター	BD Biosciences	N/A	Fortessa SORP
フローサイトメトリーソフト	BD Biosciences	N/A	Diva

ははは352235