プロトコルは、ポリ（N -iso-プロピル）効果的な捕獲、生存循環腫瘍細胞（CTC）の熱応答性放出のための（PIPAAm）コーティングされたマイクロフィルター提示さを利用します。この方法は、患者の血液と下流オフチップの文化のための実行可能なCTCの今後のリリースからのCTCの捕獲を可能に分析し、特性評価。
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この記事について
サマリー
要約
私たちは、下流の分析および/または培養のためのチップからのこれらの細胞のリリースに伴い、全血から実行可能な循環腫瘍細胞（CTC）のサイズベースの捕獲のための方法を示しています。戦略は、CTCと撮影しCTCの熱応答性実行可能なリリースのためのポリコーティング（N -ISO-プロピル）（PIPAAm）を取得するための新規なパリレンC膜のスロット孔のマイクロフィルターの使用を採用します。生きた細胞の捕獲は、典型的には、濾過プロセスに関連付けられたせん断応力を低減するために、特定の寸法を有するスロット細孔形状の設計を活用することで有効になっています。マイクロフィルターは、高い捕集効率を示すが、これらの細胞の放出は非自明です。そのような逆流または細胞掻爬などの技術が使用される場合、典型的には、細胞のわずかな割合が放出されます。パリレンC膜へのこれらの上皮癌細胞の強力な接着は、非特異的静電相互作用に起因します。目に対抗します効果がある、我々はPIPAAmのコーティングの使用を採用し、フィルターから細胞を解放するためにその熱応答性の界面特性を利用しました。血液は、最初に室温で濾過します。 32°C以下、PIPAAmは親水性です。その後、フィルターを培地またはPIPAAm旋回疎水性になる37℃に維持バッファのいずれかに配置され、続いて静電的に結合した細胞を放出します。
概要
転移性疾患は、ほとんどの癌死亡の原因です。転移するための予後とコンパニオン診断バイオマーカーを開発することは、がんの管理と治療に重要です。循環腫瘍細胞（CTC）は、腫瘍の播種および転移において中心的な役割を果たしています。また、「液体生検」のバイオマーカーとして簡単にアクセス可能で、CTCは、癌患者における癌バイオマーカー研究のための温床 ''末梢血のように上昇しています」。 3 - CTCはよく乳癌、前立腺癌および結腸直腸癌1を含む様々な癌の設定、で予後バイオマーカーとして検証されています。しかし、CTCの分野における最近の進歩は、介入臨床試験4に示すように、これらの希少細胞の単なる列挙は、臨床的有用性を制限していることが示されました。このように、CTCの分子および機能的特徴付けを可能にする技術の新興必要性があります。現在、わずか数技術がfoを可能にする存在しますrの非抗原バイアスされ、実行可能な捕捉およびCTCのリリース、堅牢な下流の分子と機能解析の5,6を可能にします。これらの微細加工装置の大半は、マイクロ流体プラットフォームに結合され、したがって、2〜4ミリリットル7の範囲であることを処理することができる血液の量、の制限要因持っている- 10。 CTCが大幅捕捉および目的のこれらの細胞を単離する可能性を妨げ、従って、さらに処理することができる血液の量を減少させる、採血（7.5 ml）を単一チューブで珍しい事象です。
我々は、より大きな腫瘍細胞およびより小さい正常な血液細胞11,12の間のサイズの違いを利用するCTCの捕獲のためのパリレンC膜マイクロデバイスの2種類を開発しました。我々は以前のラウンド細孔列挙フィルタに報告し、マイクロフィルタは、CTCの捕獲効率が優れていることが示されたFDA承認プラットフォームとそれを比較しました癌の患者の血液サンプル13,14。しかし、円形フィルタの制限は、濾過前に、ホルムアルデヒドベースの固定剤を使用する必要があります。このプロセスは、それらが濾過プロセスの間にせん断応力と圧力に耐えることができるようにしながら、細胞の形態を保持します。列挙及び分子的研究は、オンチップ13を行うことができるが、固定は、機能的特徴付けを実行する能力を損ないます。この制限に対処するために、我々は、濾過前（ 図1）に細胞を固定するための必要性を否定するスロット孔のフィルターを開発しました。スロット孔形状（6ミクロン幅×40μmの長スロット孔）部分的にしか細孔を閉塞するので、さらに他の血液細胞のための自由な通過を可能にし、細胞の損傷につながる圧力の上昇を緩和しながら、腫瘍細胞が捕捉することを可能にしますそして最終的に破裂15,16は、スロット孔のカートリッジはサンドイッチ2アクリル片で構成されています漏れ防止シール14,15（ 図1）を提供するために、ガスケットとしてポリジメチルシロキサン（PDMS）の演技でトップとボトムピース間のスロット孔フィルター。
スロット孔フィルタの捕捉効率が高いが、（ 表1）、捕捉CTC代わりに接着15を媒介し 、細胞外マトリックス（ECM）の強い非特異的静電相互作用によって、パリレンC膜に結合されています。そのような逆流または細胞スクレーパーを使用するなどの方法が効果的にフィルターから細胞を放出し、または細胞損傷および細胞死をもたらすことができません。私たちは、リリース戦略15を策定するPIPAAmの型破りな使用を検討しました。 PIPAAmは可逆下限臨界溶液温度（LCST）32°C 17の溶液温度で相転移を受けるポリマーです。伝統的に、PIPAAmのこの特性は、広く組織工学アプリケーションのために検討されています。典型的には、細胞でありますPIPAAmが疎水性である場合、37°CでPIPAAm被覆された表面上で培養しました。培養温度は、PIPAAm被覆された表面が水和17,18なる32°C以下に移行するときに、細胞は、次にシートとして取り外すことができます。我々は、（32℃未満）を室温で濾過処理を行い、その後37℃で維持培地にフィルタを配置することによって、細胞の放出を可能にすることによって、この熱的性質を利用しました。この温度で、PIPAAmのポリマー層は、それによって静電結合した細胞15（ 図1）を解放し、疎水性になります。
温度応答方法だけでなく、他の方法が成功し19キャプチャおよびリリースの実行可能なCTCを達成するために実装されているが- 21を 、報告されたこれらの技術によって共有される1つのキーの潜在的な欠点は、それらすべては、CTCの捕獲のための抗原依存性の原則を採用することです。抗原ベースのCTC捕獲、示すように、previously、バイアスされたCTC分析11,14につながる可能性があります。例えば、多くの親和性に基づく技術は、CTCの捕獲のためのEpCAMに特異的に結合する抗体を使用します。ただし、CTCは、これらの技術によってEpCAMの低EpCAMの負CTCの漏れにつながるのEpCAMの様々なレベルを発現することが示されています。非上皮起源からCTCは黒色腫および肉腫の設定で、このようなCTCとして、関心がある場合にも、制限が発生することがあります。したがって、抗原ベースのキャプチャーによって導入された潜在的なバイアスなしで実行可能なCTCの捕獲および放出を可能にする技術が非常に望ましいです。
重要なことは、マイクロキャプチャ装置は、純粋に基づく大きさと解放戦略は、特定の表面マーカーの存在に依存しないです。私たちは、PIPAAm被覆したマイクロフィルターの雇用が効果的かつ効率的に捕捉し、下流の分析のためにCTCを放出する能力を提供することを通じて、転移過程の理解を広げるのに役立つと確信しています。これは強力かもしれませんially小説は全身療法が向けだけでなく、容易に監視することができるバイオマーカーを提供し、がん患者管理に役立つ可能性があります対象とするための新たな分子を公開します。
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プロトコル
倫理文：ヒト被験者の権利を保護するために、血液試料をIRB 20150020下のマイアミ大学の治験審査委員会によって承認されたプロトコルの下にインフォームドコンセント後に得られました。
注：CTCの捕獲のためにフィルタリングされる血液が凝固を防ぐために、EDTAチューブに収集することができる必要があります。
1.ポリ（N-イソ - プロピル）（PIPAAm）を持つマイクロフィルタをコーティング
- ブタノール中10％重量/体積溶液を調製しPIPAAmを量ります。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合します。
- カットプラスチック顕微鏡は、ハサミや鋭利な刃のペアでおよそ12ミリメートル×12ミリメートルの正方形のいずれかにスライド。代わりにギロチンを使用します。
注：これらの正方形は、スピンコーティングプロセス中にフィルタのホルダーとして機能します。 - ストレートエッジのはさみの鋭いペアを使用して、8ミリメートル×8ミリの正方形にスロット孔のマイクロフィルターのウェハをカット。
- プラスチックsquaにカットフィルタを固定したポリイミドフィルムテープを使用して解像度以前にステップ1.3でカット。フィルタ領域の少なくとも7ミリメートルX 7ミリメートルをテープで未覆われるようにエッジのみとフィルタのコーナーにフィルムを適用します。
図2：PIPAAmコーティング 8ミリメートル×8ミリメートルのマイクロフィルターのためのマイクロフィルターセットアップの代表的なイラストは、プラスチック顕微鏡スライドから12ミリメートル×12ミリメートルのプラスチック正方形のカットの上に配置されています。ポリイミドテープは、基準15からの許可を得てコートにPIPAAm.Reproducedをスピンさせる代わりに、マイクロフィルターを固定するために使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- スピンコーターの真空チャック上に、プラスチック製の正方形の上に固定されたマイクロフィルタを配置します。
- プログラムの次のレシピへのスピンコーター：スタート、10秒間500rpmで、6000 R60秒、10秒間500 rpmで、停止のための午後。
- 完全に標準的なプラスチック製のトランスファーピペットを用いて、マイクロフィルターの表面を覆い、スピンコーターを開始する（1.1に調製した）ワット/ vのPIPAAm溶液を十分に10％を分配します。
- コーティングプロセスが完了した後、スピンコーターからPIPAAm被覆されたマイクロフィルタを削除します。保管中にプラスチック製の正方形に取り付けられたフィルターを残します。
注：コーティングされたフィルタは、最大3ヶ月間室温で保存することができます。
PIPAAmコーティングされたマイクロフィルターで濾過カセットの2組立
- まだペトリ皿にプラスチック製の正方形の上に固定マイクロフィルタを配置することによって、室温でPIPAAm被覆されたマイクロフィルターを再水和。マイクロフィルターが完全に水没するまで、1×PBSを加え、5分間放置しました。
- 水和工程の後、はさみのペアを使用してポリイミドフィルムテープを切断することにより、プラスチックの正方形からフィルタを解除します。
注：フィルタの側が持っているのをメモしておいてくださいPIPAAm被覆。 - 2ポリジメチルシロキサン（PDMS）の部分がガスケット/シールとして機能するとともに、上部と下部のアクリルピースとの間のマイクロフィルターを挟んで、ろ過カセットにマイクロフィルターを組み立てます。フィルタを確保し、気密シールを提供するために、クリップでアクリルカセットをクランプします。
注：サンプルはを通じて濾過されるようにPIPAAmコーティングは、上向きにする必要があり、細胞はフィルターのPIPAAm被覆された表面に捕捉されます（ 図1）。
マイクロフィルターからのキャプチャとCTCのリリースと血液サンプルの3ろ過
- 各シリンジポンプのブランドが独自のユーザーインタフェースを持っているように、75ミリリットル/時の速度で流れ、20ミリリットルにボリュームを設定するためにシリンジポンプポンプ、プログラムのマニュアルを参照してください。
- 37°Cまで（10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン及びストレプトマイシンで添加することにより調製した）マッコイ（市販の）細胞培養培地3mlの暖かいです。
注：これは培養細胞は、細胞が、通常培養されるメディアを使用し、健康なドナーの血液中にスパイクされるモデル系の実験である場合には、メディアの選択は、他の患者の癌の種類に基づいて、またはされますわからない場合は、参照してください。細胞がより購入した会社が提供するガイド/メソッドを培養します。 - 7.5ミリリットルの血液試料に市販のハンクス平衡塩溶液（HBSS）の7.5ミリリットルを追加し、25ミリリットルの注射器にこの希釈血液を吸引します。
1希釈：10mlの血液を使用する場合は、1を達成を10 mlのHBSSの等量混合HBSS 例えば 1：注：血液サンプルが1等量の希釈されるように、HBSSの音量を調整します。 - 注射器でろ過カセットをエンゲージし、シリンジポンプの上に置きます。フロースルーを収集し、ポンプを起動するために下部に50ミリリットルチューブを置きます。
注：濾過はおよそ10〜12分を取る必要があります。すべての濾過工程を実施することになっていますステップ3.8を含む通常の室温（20〜25℃）で実施 - ろ過が完了した後、側はPIPAAm被覆表面に引っ掛かっセルを有するトップでろ過カセット撮影ノートを外します。吸引し、新しい注射器への暖かい培養培地の1ミリリットル。
- メディアを含む注射器でろ過カセットを再従事するが、フィルターのPIPAAm被覆された面が離れて注射器から直面しているように、この時点で、カセットの底端部に係合します。
注：これは、穏やかな逆流を適用することにより、スロット孔の中に埋め込むことができる任意の細胞を放出するであろう。 - バックシリンジポンプへシリンジを置き、右ろ過カセットの下に小さなペトリ皿または6ウェルプレートを保持します。 100ミリリットル/時の流量を設定し、ポンプを起動します。
- フィルタを介してすべてのメディアをパスし、フロースルーシャーレ内を集めます。すべてのメディアが通過するのを待ってから、ポンプを停止し、シリンジaを削除しますポンプからの濾過カセットをND。
- 注射器からの濾過カセットを外し、カセットからフィルタを取得するために、それを開きます。 PIPAAm表面が毛穴から細胞を解放するときに逆流を収集するために使用したのと同じシャーレに下に向けてフィルタを配置します。暖かいメディアの残りの部分を追加し、37℃に設定した培養インキュベーターにペトリ皿を置きます。
- 30分後、すべての細胞がフィルターから解放されます。しかし、すべての細胞がデタッチ確保するために24時間までペトリ皿にフィルタを残します。
注：また、放出された細胞は、いくつか例を挙げると、このようなPCR、ELISA、ウェスタンブロットなどのさらに下流の分析を実行するためにマイクロチューブに回収することができます。 - 文化の中で24時間後、慎重にピンセットを用いてマイクロフィルターを削除します。
注：細胞はそれから解放されているように、フィルタは、この時点で廃棄することができます。 - 優しく千＆＃を使用して、上下の培地をピペット181; Lピペット、フィルター上に捕捉され、CTCでプレートに放出される再懸濁赤血球および末梢血単核細胞（PBMC）です。ゆるく付着した癌細胞を剥離避けるために、慎重に、ゆっくりと、このアクションを実行します。慎重に37℃に予熱した新鮮な培地で取り付けられ、癌細胞および代替を残しながら再懸濁した赤血球およびPBMCを含む媒体全体を削除します。
注：過剰な赤血球が1回の洗浄後に存在している場合、この手順は一回繰り返すことができます。
4. CTC生存率評価
- ライブ/デッドアッセイ8を用いて培養CTCの生存率を評価します。
注：多くのライブ/デッドアッセイが市販されています。製造元のプロトコルを、次のことを強くお勧めします。この実験のために使用される市販のアッセイキットのための材料/試薬のリストを参照してください。
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結果
（インフォームドコンセント次マイアミIRB 20150020の大学によって承認されたプロトコルで得られた）の健康なドナーの血液を培養癌細胞でスパイク使用して、実行可能な循環腫瘍細胞（CTC）を放出するための熱応答性技術は、キャプチャ、リリースと検索効率を達成しましたそれぞれ、94％±9％、82％±5％及び77％±5％（ 表1）15。比較すると、リリースおよびコーティングされていないフィルタの検索効率が有意に低かった（7％±1％放出効率と6％±1％の検索効率）（ 表1）15。フィルターから放出されたCTCの生存率を評価するために、〜千SK-BR-3細胞は、PIPAAm被覆されたスロットのフィルターを通して濾過し、上記の方法を使用して解放、健康なドナーの血液7.5mlの中にスパイクしました。生/死アッセイは、血液中にスパイクする前に、細胞生存率を評価しましたそしてリリース後。前スパイクの生存率は98％であった（カウント602細胞のうち592）および血液から捕獲され...
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ディスカッション
全血から生存CTCを捕捉し、マイクロフィルターからそれらを解放するプロセスは比較的簡単です。しかし、いくつかの重要なポイントは、言及する価値があります。これは、滅菌状態がプロセス全体を通じて維持されているすべての細胞培養と同様に、必須です。フィルタから細胞を放出させる技術の基礎は、PIPAAmの温度応答性界面特性を利用することに基づいているようPIPAAmでフィルタをコーティングする最初のステップは、非常に重要です。 、フィルタが効果的にコーティングされていることを確認コーティングする前に、顕微鏡下でフィルター上の孔（スロット孔の幅と長さ）のサイズを測定し、再度細孔サイズポストコーティングを測定しました。細孔サイズは、幅および長さ（ 図4）の両方で1μM減少されるべきです。述べたように、スロットフィルタ効率CTCを捕捉しながら、また、いくつかの大規模なPBMC細胞を捕捉するが、これらの細胞は、非接着性細胞であり、従ってドゥリNGステップ3.13付着癌細胞を残す培養（ 図5）から除去されます。
粘度が非常に高い場合、...
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開示事項
この作業の一部は、米国仮特許出願番号 62/219,808 で保護されています。Siddarth Rawal は、この記事で使用するフィルターとフィルター カセット/カートリッジを商業的に製造する Circulogix Inc. の株主です。
謝辞
この作業を支援するために血液サンプルを提供してくださったすべての患者に感謝します。臨床サンプル取得にご協力いただいたGuiseppe Giaconne博士、Ritesh Parajuli博士、Marc E. Lippmman博士、そして洞察に満ちた議論をいただいたCarmen Gomez博士、Ralf Landgraf博士、Stephan Züchner博士、Toumy Guettouche博士、Diana Lopez博士に感謝します。Zheng Aoは、シルベスター総合がんセンターのSheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biologyからの部分的な支援と支援に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| スロットフィルター | Circulogix Inc. | MSF-01 | 血液または尿からのCTCのろ過に基づいて利用可能な異なるサイズのフィルター (www.circulogixinc.com) |
| ポリ(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | 株式会社Ploysciences | 21458 | ノンハザード。室温で保管してください。 |
| 1-ブタノール | シグマ Aldrich | B7906 | 換気の良いエリアでの使用 |
| プラスチック顕微鏡スライド | コール・パーマー | 48510-30 | 任意のプラスチック スライドまたは任意の種類の正方形 (金属、アクリルなど) 8mmx8mmフィルター正方形を保持するためのベールになる場合、 |
| スピンコーター | 特殊コーティングシステム | SCS G3スピンコーター | 機器 |
| ポリイミドテープ | Uline | S-7595 | ポリイミドは、複数のベンダー(アマゾン、Kaptontape.com) |
| HBSS-ハンクのバランス塩溶液 | ギブコ | 14025-092 | |
| 1x PBS | ギブコ | 10010-023 | |
| ファルコンペトリ皿35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| マイクロフィルターカセット | Circulogix Inc. | FC-01 | カスタムカトリッジは、血液または尿からのCTCのろ過に基づいて利用可能です |
| シリンジ 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| シリンジポンプ | KD scientific | 78-0100V | 25mlのシリンジを保持できる任意のシリンジポンプを使用することができます |
| Cellstar 50 ml遠心分離管 | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6ウェルプレート | VWR | 89131-688 | 表面が細胞adesionに適合し、忌避剤SKBR3細胞である限り、任意のブランドを使用することができます |
| ATCC | HTB-30 | ||
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | 生細胞を評価するための合理的な分析を提供できるアッセイは、 |
| 細胞培養インキュベータ | ーVWR | 98000-368 | 細胞培養に使用できるインキュベーター |
参考文献
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