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方法論記事

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

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DOI：

10.3791/54440

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2016年9月19日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Zaragoza

この記事について

サマリー

ここでは、マウスモデルにおけるBCGによる鼻腔内および皮下免疫によって誘発される防御効果と肺免疫応答を比較するための方法論について詳しく説明します。私たちの結果は、肺ワクチン接種の利点を示しており、ワクチン誘発性防御におけるIL17媒介反応の役割を示唆しています。

要約

皮内BCGワクチン接種が世界的に報道されているにもかかわらず、結核は依然として世界で最も蔓延している感染症の一つです。前臨床データでは、肺結核ワクチンは、感染の原因である肺疾患を予防するための有望な戦略として推奨されています。この研究では、マウスモデルで経鼻内BCGワクチン接種の利点を皮下と比較した場合に実証するために使用された方法論について説明します。私たちのデータは、鼻腔内BCG投与後により大きな保護効果を明らかにしました。さらに、私たちの結果は、肺ワクチン接種がTh1およびTh17応答を含む肺の免疫応答の増加、および呼吸器気道の免疫グロブリンA(IgA)濃度の増加を引き起こすことを示しています。私たちのデータは、結核菌チャレンジ後の肺における防御効果とIL17産生細胞の存在との間に相関関係があることを示しており、肺ワクチン接種によってもたらされる防御反応におけるこのサイトカインの役割を示唆しています。最後に、マウスモデルでの呼吸器ワクチン接種を研究するために開発したグローバルなワークフローについて詳しく説明します。これは、BCG以外の他の結核ワクチンに外挿でき、粘膜反応または気管内投与やエアロゾルなどの他の肺投与経路を標的としています。

概要

結核（TB）は、結核驚くべき世界的な健康問題が1になり、世界のHIVよりも関連の死亡を引き起こし大手感染症の一つであり、多剤耐性株の上昇を高めることと組み合わせています。新しい診断ツール、より効果的かつ毒性の少ない薬、新たな安全かつ効果的な結核ワクチンは、特に発展途上国では、緊急の必要性です。

弱毒生カルメット・ゲラン桿菌（BCG）は、現在、全世界で1970年代以降、出生時に皮内投与された結核に対する唯一の認可ワクチンです。 BCGは、子供の病気（髄膜炎や粟粒結核）の重症型の予防に有効であると考えられるが、病気の伝染2の責任肺結核に対する矛盾した有効性を示しています。

結核感染の自然経路を模倣肺ワクチン接種は、ローカルホストの免疫応答をプライミングするための魅力的なアプローチを表し秒。この点において、異なる関連するTBの動物モデルにおいて、様々な前臨床作品は、皮下または皮内経路3-6と比較して、肺の免疫後の大きいワクチンの有効性を実証しています。それにもかかわらず、肺のワクチン接種によってトリガ保護メカニズムはよく理解されていません。 IL17粘膜ワクチンによって誘導される防御効力欠損マウスモデルで7,8を損なわれているように最後の年では、いくつかの作品は、TB-特有の粘膜免疫応答の重要な要因として、IL17が媒介する応答に向かって指摘しています。

最近では、BCGの投与は、DBA / 2マウス、皮下BCGの予防接種9後の保護の欠如によって特徴づけられるマウス系統を保護鼻腔内を初めて実証しました。これらの結果は、皮内BCGをpulmonに対して効果がないとみなされる場合、呼吸TBワクチンは流行国でTBの速度を低下させる、より効果的であることが示唆しました進TB。

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プロトコル

全てのマウスは、制御された条件下で維持し、疾患の徴候について観察しました。実験研究は、実験動物の保護のためのヨーロッパと国家の指令と一致し、有能な地元の倫理委員会から承認を得て実施しました。

BCGデンマークの定量化グリセロールストックと結核菌 H37Rvの調製

注：記載のすべてのプロトコルは、BSL3の条件下で行いました。

  1. BCGデンマークまたは菌H37Rv株の凍結グリセロールストックを融解し、トゥイーン80 0.05％（V / V）およびADC（アルブミン、ブドウ糖、カタラーゼ）を10％（v / v）を補充した7H9培地10 10mlに100μlの接種。
  2. 培養物が対数増殖期になるまで、37℃で1週間の静的な条件下でインキュベートします。
  3. 新鮮な培地の200ミリリットルに10 mlの文化を転送することにより、細菌培養をスケールアップ。さらに20インキュベートします静的な条件下での日。
  4. グラムのx 2500で15分間、50-ml遠心チューブと遠心分離機に移します。
  5. 上清を捨て、残留量に細菌ペレットを再懸濁します。 （ - チューブ当たり15 10）を各チューブ無菌3 mmの直径のガラスビーズに追加します。
  6. 細菌の塊を解離するために、1分の間に激しくボルテックス。トゥイーン80 0.05％を含むPBS 10ml中の各ペレットを再懸濁（v / v）です。
  7. 最大の細菌の集合体とガラスビーズがダウンして沈降させ、10分間チューブを残します。
  8. 単一の新鮮な50-ml遠心チューブ（最終回復容量38ミリリットル）に小さな塊と、単一の細菌や転送量を含む4のチューブのそれぞれからの上清の9.5ミリリットルを回復します。 400×gで10分間遠心分離します。
  9. 単一の新鮮な50mlの遠心管に（主に単一の細菌を含む）上清の35ミリリットルを回復し、（v / v）のグリセロールを50％含むPBSの15ミリリットルを追加し、（v / v）で15％の最終グリセロール濃度を得ました。
  10. 穏やかに混合そして凍結するための適切なチューブに1mlのアリコートで配布しています。 -80℃で保存（1ロットは約50アリコートのグリセロールストックを提供します）。
  11. グリセロールストックを定量化するために、凍結後にグリセロール1日を解凍し、PBSの900μLを含む別の1.5 mlチューブに7 10倍連続希釈を行います。
  12. プレート55 mmの直径のペトリ皿中で調製ADCの10％（v / v）を補充した7H10固体寒天培地10の各希釈液100μl。
  13. 慎重に3ミリメートル径のガラスビーズ（プレート当たり約10）を追加し、穏やかに均等に寒天プレート上にボリュームを配布するためにプレートを振ります。ビーズを破棄し、パラフィルムで寒天プレートをシール。
  14. 37℃で21日間培養し、単一コロニーを正確に区別することができる希釈でコロニー形成単位（CFU）をカウントすることにより、細菌濃度を決定します。

2.マウスのワクチン接種

  1. 事前に定量BCGグリセロールを解凍し、分取にPBSでそれを希釈2懸濁液があります。動物当たりの投与量を考慮し、最終的な体積を計算すると、皮下投与のため、100μlの（皮下ワクチン接種のために、1mlあたり10 7 CFU）と鼻腔内投与（鼻腔内ワクチン接種のための2.5×10 7 CFU）のために40μlのです。
  2. イソフルランと酸素の混合物をマウスに麻酔する齧歯類のための専門の麻酔ワークステーションを使用してください。麻酔室でマウスを維持するために麻酔と2％を誘導するためにイソフルランに5％を使用してください。 （他の一般に認められた麻酔法を使用することができます）。
  3. 皮下ワクチン投与のために細菌懸濁液の1ミリリットル（10 7 CFU / ml）で26 G針を1-mlの注射器を埋めます。気泡を除去。
  4. 層流フードの内側腹臥位で平らな面に麻酔をかけたマウスを置き、バックマウスの脇腹にワクチンの皮下に100μlの（10 6 CFU /用量）を接種します。ケージにマウスを返し、それがプロペことを確認するために、それを監視しますRLY麻酔から回復します。
  5. 各マウスの投与の間注射針を変更します。上記のように空気の泡を削除しました。
  6. 鼻腔内投与のために、フードの内側仰臥位で麻酔をかけたマウスを置きます。
  7. マイクロピペットで2.5×10 7 CFU / mlの懸濁液20μLを取ります。マウスは、ボリュームを呼吸できるようにする液滴間の時間を残して、接種滴ずつのボリューム全体が堆積されるまで2鼻孔の間を置き注：マウスは、この手順の間に呼吸困難に苦しむことができ、それらはに委ねられる必要がありますので、できるだけそれを防ぐために、次のいずれかを管理する前に、各ドロップを同化。
  8. 別の20μlのマイクロピペットを再充填し、操作を繰り返してください。マウスは最初の接種後麻酔から覚ますために起動した場合は、前第1に麻酔室に入れてください。ケージにマウスを返し、それが正常に回復していることを確認麻酔から。

菌H37Rv株3.マウスの鼻腔内チャレンジ

  1. 事前に定量菌H37Rvグリセロールを解凍し、1mlあたり2,500 CFUの細菌懸濁液を調製し、PBSでそれを希釈します。動物当たりの投与量を考慮し計算し最終容量は40μlのです。
  2. 2.7から2.5に記載されているように菌H37Rvを鼻腔内接種します。マウス当たりファイナルチャレンジ用量は10 2 CFU /40μlのです。

肺で誘導される免疫応答の4解析

  1. 肺細胞懸濁液
    注：肺におけるワクチン誘導適応免疫応答の評価は、単一細胞懸濁液の生成を必要とします。この目的のために、我々はそのようなGentleMACSなどの組織解離を使用します。
    1. 頸椎脱臼（または他の許容人道的な方法論）によってマウスを犠牲にし、マウスが瞬目反射の不在を確認するために、眼球に触れて死んでいることを確認します。
    2. 層流フードの内部に、Lを抽出します滅菌はさみやピンセットを用いてungs、清潔な表面上に置きます。きれいな肺気管および結合組織を除去し、（処理まで氷上で維持）をPBSで1.5 mlチューブに肺を転送します。
    3. pH7.4の、150mMのNaCl、5mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、1.8mMのCaCl 2を10 mMのHEPES-NaOHを5 mlを含む臓器解離（C-解離管）のために適切なチューブに肺を置き、細胞懸濁液を生成しますバッファ。
    4. コラゲナーゼD 100 mg / mlで100μlの（2ミリグラム/ mlの最終濃度）、およびDNAse I2万IU / mlを40μlの（160 IU / mlの最終濃度を追加します。
      NOTE：コラゲナーゼDまたはDNアーゼIのストック溶液は、PBSまたはグリセロールで凍結乾燥された酵素を50％（v / v）を、20mMのトリス塩酸pH7.5でのyのMgCl 2、それぞれ1ミリメートル、溶解調製されます。
    5. 組織解離にチューブを置き、肺の断片化のための事前定義されたプログラムm_lung_01を使用しています。 30分間、水浴中で37℃でチューブをインキュベートします。
    6. 目を配置します解離の電子管及び単一の細胞懸濁液中に完全な肺の均質化のための事前定義されたプログラムm_lung_02を使用しています。
    7. 50mlの遠心管に取り付けられた70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。 RPMI 1640培地10mlでストレーナーを洗浄します。
    8. 400×gで5分間遠心分離細胞と上清を捨てます。
    9. 、バッファを溶解赤血球の1ミリリットルを加えボルテックスで混和し、室温で1分間インキュベートします。
    10. 400×gで5分間、RPMI 1640培地遠心細胞を10mlを加えます。
    11. 完全RPMI 1640培地0.5mlに再懸濁細胞を、10％熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）、2mMのL - グルタミン、100μg/ mlのストレプトマイシンを有する100 IU / mlペニシリンおよび50μMの2-メルカプトエタノールを補充しました。
      注：FCS、30分間56℃でインキュベートすることにより不活性化されます。
    12. 細胞を計数し、10 7細胞/ mlの最終細胞密度に到達するために、完全RPMI 1640培地を加えます。
      注：細胞数のために、我々は、自動細胞カウンターを使用します。
    13. U底96ウェル滅菌プレート中の細胞懸濁液100μlを配布します（10 6細胞/ウェル）。
    14. 商業菌H37Rv精製タンパク質誘導体の15μgの/ mlの（PPD）（5μg/ mlの最終濃度）で完全RPMI 1640培地の50μl/ウェルを追加します。
  2. ELISAによるサイトカイン決意のために上清を収集
    1. 4.1.14から37℃で48時間、5％CO 2静置します。
    2. 400×gで5分間遠心プレート100μlの上清を回収します。
    3. -80℃で保管してください。
    4. それぞれ、IFNγおよびIL17A決意のためのアッセイ緩​​衝液中の上清1/10と1/2に希釈します。メーカーの説明書（ELISA開発キット）によると、市販のELISAキットを用いてサイトカイン濃度を決定します。
  3. サイトカインの決意のための細胞内染色フローサイトメトリーにより、CD4 +細胞を産生
    1. 4.1.14から37℃で18時間、5％CO 2静置します。
    2. 各ウェル（10 / mlの最終濃度）にブレフェルジンA 1mg / mlの（DMSOに溶解した株）の1.5μlを添加して、6つの追加時間インキュベート。
    3. 3200×gで1分間4.3.2から、プレートを遠心し、上清を捨てます。
    4. 抗マウスCD4-FITC50μlの再懸濁細胞を、10％FCS（1/500）を含むRPMI 1640に希釈し、4℃で10分間インキュベートします。
    5. 、3200×gで1分間4.3.4から、プレートを遠心上清を廃棄し、100μl/ウェルの固定液を追加します。 4℃で20分間インキュベートします。
    6. 透過性溶液150μL/洗浄で細胞を2回洗浄します。
      注：10倍濃縮ストックを1×作業溶液を調製し、脱イオン水で希釈されます。
    7. 抗マウスIFNγ-APCとpermeabilで希釈した抗マウスIL17A-APC.Cy750μlの再懸濁細胞化ソリューション（1/250両抗体）。
    8. RTで1時間インキュベートします。
    9. 透過性溶液150μL/洗浄で細胞を2回洗浄します。
    10. フローサイトメトリー取得のため200μlのPBSで細胞を再懸濁し。

気管支肺胞洗浄中の免疫グロブリンの5分析（BAL）

  1. BALサンプルの取得
    1. 頸椎脱臼（または他の許容人道的な方法論）によってマウスを犠牲にし、マウスが瞬目反射の不在を確認するために、眼球に触れて死んでいることを確認します。
    2. 適切な精度滅菌ピンセットやハサミを使って気管を露出させ、気管に小さなカットを行い、それを完全に切除しないように確認すること。 BALサンプルを汚染する可能性の出血を引き起こすことがないように注意してください。
    3. 気管内に氷冷PBS800μlの滅菌1 mlシリンジに接続されたカニューレをご紹介します。
    4. 肺にゆっくりPBSを接種してからR肺の崩壊を避けるために、非常にゆっくりと注射器のピストンを引き戻すエコベールBALのボリューム。
      注：500〜600μlと回復が良好です。
    5. 1.5-mlチューブにBALボリュームを転送し、それは血液（処理まで氷上で維持）で汚染されていない示し、BALは無色のままであることを確認します。
    6. 遠心分離機BALは、400×gで5分間のサンプル、および上清を新しいチューブに移します。
    7. -80℃で保存上清。
  2. BAL上清中のIgAの決意
    注：使用するすべての試薬は室温です。
    1. コート高タンパク質はM.ため（の10μg/ mlで）をPBSで希釈したPPD100μlのポリスチレン平底96ウェルプレートに結合結核特異的なIgA決意、または合計のIgA決意をPBSで10倍に希釈したBAL上清100μlを持ちます。
    2. 4℃で一晩インキュベートします。
    3. 上清を捨て、Dにペーパータオル上でプレートをタップRY。 200μlのPBS /ウェルで洗浄します。
    4. 200μL/ウェルのウシ血清アルブミン（BSA）、1％（v / v）の（ブロッキング緩衝液）PBS-ツイーン80 0.05％で（V / W）でブロック。
    5. RTで1時間インキュベートします。
    6. 200μlのPBS /トゥイーン80 0.05％（v / v）の（洗浄バッファー）のウェルで一回洗浄します。
    7. PPD被覆ウェルに希釈されていないBALの上清100μlを加えます。室温で2時間インキュベートします。
      注：合計のIgA決意はPPD特異的IgAと並行して行われた場合、このインキュベーション中に100μlの洗浄緩衝液で総IgAの井戸を残します。
    8. 200μL/ウェルの洗浄buffer.0170004で3回洗浄
    9. 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の100μLを加えるには、バッファ（1 / 10,000）をブロックに希釈した抗マウスのIgAを抱合しました。
    10. 1時間RTをインキュベートします。
    11. 200μl/ウェルの洗浄緩衝液で5回洗浄します。
    12. 3,3の100μl/ウェルを追加 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）。 Tで室温で20分間インキュベートします彼は暗いです。
    13. 100μl/ウェルのH 2 SO 4 0.5Nを追加します。波長450nmで分光光度計でプレートを読みます。

肺6.細菌負荷の決意

  1. 肺の均質化およびメッキ
    1. チャレンジの4週間後、頸椎脱臼（または他の許容人道的な方法論）によってマウスを犠牲にし、マウスが瞬目反射の不在を確認するための眼球に触れて死んでいることを確認します。
    2. 層流フードの内側に平坦な消毒表面上に固定された仰臥位でマウスを置きます。
    3. 胸部領域を可視残すために切開を行い、胸部から肌を削除します。
    4. リブを切り出し、滅菌ハサミやピンセットを用いて、肺と心臓を収穫。きれいな表面に臓器を置きます。
    5. 心臓、気管および結合組織を除去することにより、肺をきれいにし、脱イオン水1ミリリットルと1.5 mlチューブに肺を転送します（処理まで氷上で維持します）。
    6. 脱イオン水1ミリリットルを含む、 - 臓器均質化（解離チューブM）のための適切なチューブに各マウスの肺を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。
    7. 組織解離にチューブを置き、肺を均質化するために事前に定義されたプログラムRNA_1を使用しています。
    8. 900μlの希釈された肺ホモジネートの100μlで始まる、1.5 mlチューブに5〜10倍連続希釈液を作ります。
    9. 1.11から1.14に記載されているようにプレート希釈液。
  2. PCRによるBCGと菌H37Rvの区別
    注：鼻腔内経路によってBCGでワクチン接種したグループに対応する6.1.6からのプレートでは、我々はワクチン付与防御効力を評価するために考えCFUが対応することを保証するために、BCGと菌H37Rvの間に目の肥えたPCRによってコロニーの代表的な数を分析しました一意菌H37Rvへ。 BCGおよびM. TUでRD9のこのPCR標的増幅、異なるゲノム領域berculosis、菌H37Rvのための2618塩基対、およびBCG 11のための465塩基対の断片を与えます。
    1. 示されるように、サンプルあたりのボリュームを持つすべてのサンプルについてマスターミックスの株式を準備し、その後、PCRチューブ（9μL/サンプル）で配布しています。
      注：バッファ5X：2μlの。フォワードプライマー、25μM（GTGTAGGTCAGCCCCATCC）：0.32μlを、Taqポリメラーゼμlの5単位/：：0.04μlを、脱イオンH 2 O：6.32μlの0.32μlを、プライマー、25μM（GCCCAACAGCTCGACATC）を逆にします。
    2. 滅菌爪楊枝でコロニーをタッチして、マスターミックスを含むPCRチューブ内のサンプルと爪楊枝を浸します。
    3. 10分95℃（このステップは、細菌の破壊をトリガーするためである）、10分95℃（このステップは、細菌の破壊をトリガーするためである）、35サイクル（95℃で30秒、1分：以下のプログラムでPCRを実行します。 58°Cと72°Cで4分）で。
    4. 断片を可視化するために、臭化エチジウムおよび実行サンプルを1％アガロースゲルでPCRサンプルをロードします。

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結果

皮下および鼻腔内：この作品は、BCGの投与の2ルートの比較を説明します。皮下経路は、世界中のBCGのための現在の臨床経路である皮内、に匹敵します。ワクチン接種の鼻腔内経路は、Mの感染の自然経路を模倣することを目指して肺に直接免疫応答を誘導することを目的に、この病原体の主要な標的臓器と結核 、。

図1は 、その後のワークフローについて説明します。 / 2マウス8〜10週齢の雌のDBAは、投与の皮下または鼻腔内経路によってBCGデンマークの10 6 CFUでワクチン接種されています。 8週間後、マウスの群は、ワクチン接種によって誘導された肺の免疫応答を分析するために犠牲にされます。 BALサンプルは、最初に取得され、その後、我々は肺を収穫します。ワクチン付与防御効果を研究するために、我々はdiffereに接種しますM.の低用量の鼻腔内チャレンジに...

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ディスカッション

現在の結核ワクチンであるBCGは、歴史上最も広く投与されているワクチンですが、結核は依然として世界中の感染症による死亡および罹患の主な原因の1つです。このパラドックスは、感染の原因となる肺結核に対するこのワクチンの保護の欠如によって説明されます。肺の病気に対して効果的な新しいワクチン接種アプローチは、世界的に病気の伝播に最も大きな影響を与えるため、緊急に必要とされています。

私たちのデータは、自然な感染経路を模倣するために BCG の投与経路を変更することが、肺結核を予防するための成功した戦略である可能性があることを明確に示しています。私たちの結果は、モルモットや非ヒト霊長類(NHP) 6、9、12を含むさまざまな動物モデルで同等のデータを示す他の著者と一致しています。

驚くべきことに、私たちの未発表のデータは、鼻腔内経路による投与量がプロトコルの重要なステップであることを示しました。これらの結果から、100μlに再懸濁した37Rv菌100個を鼻腔内送達した後(40μlではなく)、約20%の動物から肺CF...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は「スペイン経済競争力省」[認可番号BIO2014-5258P]、H2020プログラム[認可番号TBVAC2020 643381]によって「欧州委員会」によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ミドルブルック 7H9 ブロスBD271310
ミドルブルック ADC エンリッチメントBD211887
トゥイーン 80シャーラウTW00800250
直径 3 mm ガラスビーズシャーラウ038-138003
ミドルブルック 7H10 寒天BD262710
1 ml シリンジ 26GA 0.45 x 10mm BD301358
GentleMACS 解離器Miltenyi Biotec130-093-235
C チューブMiltenyi Biotec130-093-237
M チューブMiltenyi Biotec130-093-236
コラゲナーゼ Dロシュ11088882001
DNaseIApplichemA3778,0100
ファルコン 70 & マイクロ;m セルストレーナーコーニング352350
RPMI 1640シグマR0883
赤血球溶解バッファーシグマR7757
グルタマックスサプリメントギブコ35050-061100倍濃縮
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液シグマP4333100倍濃縮
子牛胎児血清生物学的インダストリーズ04-001-1A
2-メルカプトエタノールSigmaM3148-25ML
Scepter 2.0 ハンドヘルド自動セルカウンターミリポアPHCC20040
セプター セル カウンター センサー、40 & マイクロ;mMilliporePHCC40050
Mycobacterium Tuberculosis - ツベルクリンPPDStatens Serum Institut (SSI)2390
マウス IFN-γELISA開発キット Mabtech3321-1H
マウス IL17A ELISA 開発キット Mabtech3521-1H
Brefeldin AΣB7651
FITC ラット抗マウス CD4BD553047
BD Cytofix/Cytoperm KitBD555028
APC-Cy7 ラット抗マウス IL-17ABD560821
APC マウス 抗マウス IFNgBD554413
LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30mm. 23G x 1 1/4インチUNIMED27.134の気管カニューレとして使用されます
MAXISORPNUNC430341
アルブミン、ウシ血清SigmaA4503
ヤギ抗マウスIgA(&α;-鎖特異的)から−ペルオキシダーゼ抗体SigmaA4789
3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(TMB) SigmaT0440
MyTaq DNA ポリメラーゼバイオラインBIO-21107キットにはバッファー 5x が含まれています
BAL高タンパク質結合ポリスチレン平底96ウェルプレート

参考文献

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