この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。
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この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。
インビトロプラットフォームでは 、内皮細胞および血管生物学の大部分は、2D内皮細胞培養物に限定されている研究するポリマー又はガラスベースの基板、及びヒドロゲルベース管形成アッセイを用いてチャンバを流れます。これらのアッセイは、有益ながら、血管機能の調節に重要な役割を果たしルーメンジオメトリ、適切な細胞外マトリックス、および多細胞近接性を、再現しません。この原稿は、100ミクロンのオーダーの直径を有する操作された血管を生成するための射出成形方法を説明します。微小血管は、私は、ヒドロゲルコラーゲンネイティブ型内に埋め込まれたマイクロ流体チャネルに内皮細胞を播種することによって作製されます。形成チャネルの前に、コラーゲンマトリックス中で実質細胞を組み込むことによって、特定の組織の微小環境をモデル化し、研究することができます。流体力学的特性および培地組成の追加の変調は、所望の微小環境内での複雑な血管機能の制御を可能にします。このプラットフォームは、血管周囲細胞動員、血液 - 内皮相互作用、フロー応答、および組織微小血管相互作用の研究を可能にします。操作された微小血管は、血管ニッチの個々の成分の影響を単離する能力を提供し、正確に健康と病気の両方に血管生物学を研究するために、その化学的、機械的、および生物学的特性を制御します。
各器官における微小血管系は、組織微小環境を定義する組織の恒常性を維持し、炎症、透過性、血栓症、および線維素溶解1,2を制御するのに役立ちます。 5 -微小血管内皮細胞は、特に、従って血流と周辺組織との間の界面は、流体力及び循環サイトカインおよびホルモン3などの刺激に応答した血管および臓器機能の調節において重要な役割を果たしています。内皮、血液、および周囲の組織の微小環境との間の詳細な相互作用を理解することは、血管生物学と疾患の進行の研究のために重要です。しかし、これらの相互作用を研究の進展は、 生体内微小血管構造に再現し、6,7を機能しない試験管ツールに制限することによって妨げられてきました。その結果、フィールドと治療の進歩は、高価で、時間に大きく依存してきました10 -しばしば人間8の成功に変換することができない動物モデルを消費します。 in vivoモデルは、病気のメカニズムと血管機能の研究に貴重であるが、それらは複雑であり、多くの場合、携帯個々の生化学的、および生物物理学的手がかりの正確な制御を欠いています。
体全体の血管系は、同時に11を最適化灌流および栄養素の輸送を提供し、広大な毛細血管床と一緒に成熟....
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ネットワークデザインとパターン化ポリジメチルシロキサン(PDMS)の1微細加工
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操作された容器プラットフォームは、私はマトリックスの天然型コラーゲンの中に埋め込 まれた機能的な微小血管系を作成し、in vitroで 、細胞の生物物理学的および生化学的環境の厳密な制御を可能にします。操作された微小血管を作製するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、それらが特許ルーメンとコンフルエント内皮を形成する添付コラーゲン包埋マイクロ流体ネットワークを介して灌流します。 図1A-Cに示すように、容器の幾何学的形状は、具体的には、とりわけ、流量、ねじれ、および角度を分岐、に関する質問に答えるように設計することができます。微小血管を通る流量を調節することは、内皮細胞のせん断応力応答への洞察を提供します。以前に、製造の焦点は、主に100ミクロンのサイズ範囲の血管に、しかし500ミクロンまでの微小血管されているか、ある場合には、直径が50μmだけ小さくSUCCされていますessfully製培養しました。長期開存の例としては、重力駆動流( 図2A)と連続印加された流れ(
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操作された微小血管は、管腔の幾何学、流体力学的な力、および多細胞相互作用などの生理的特徴が存在して調整可能でin vitroモデルです。プラットフォームのこのタイプは、それがモデル化し、in vitroでの培養条件は、問題の微小環境のそれに一致させることができる様々な状況下で内皮挙動を研究する能力を提供することで強力です。例えば、このような血管新生などの内皮のプロセスを、駆動機構は、異なる器官で、そのような健康と病気44など、さまざまな病理学的状態、で異なって発生することが知られています。このため、平面内皮細胞培養物は、一貫して6不十分であり、そのようなフィールドは、コストと時間がかかる動物モデルに大きく依存しているように。
動物モデルは、生物学的研究の進展のために有益で不可欠ながら、常に診療所にうまく変換されません。これは主に、特に9,45を刺激するそれらの応答について、マウスおよびヒトの生物学との間の差に起因しています。動物モデルから収集された情報を補完する追加のヒト特異的デー.......
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著者らは、開示することは何もありません。
著者らは、幹細胞および再生医学だけでなく、ワシントン大学のワシントンナノファブリケーション施設のための研究所のリンとマイク・ガーベイイメージング研究所を承認したいと思います。彼らはまた、国立衛生研究所の財政支援は、(YZへ)DP2DK102258を付与し、訓練助成金(SSKとMARへ)T32EB001650とT32HL007312(MAR)は認めます。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow プラズマシステム | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32 スピンコーター | |
| ABM コンタクト アライナー | AB-M | ||
| Alpha ステップ形状測定機 | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 レジスト | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" シリコンウェーハ | Wafer World Inc. | ||
| 卓上マイクロパターンジェネレータ | ハイデルベルグインスツルメンツ | μPG 101 | フォトマスクの生成用 |
| ホットプレート | VWR | 97042-646 | |
| イスプロピルアルコール | アバンター パフォーマンス マテリアル | ズ 9088 | |
| ペトリ皿 (120 x 120 mm、正方形) | シグマ・アルドリッチ | Z617679 | |
| トリクロロ (3,3,3-トリフルオロプロピル) シラン | シグマ・アルドリッチ | MKBG3805V | |
| ポリジメチルシロキサン (PDMS) エラストマーベース硬化剤 | ダウコーニング | シルガード184110 | :1(w / w) |
| 真空デシケーター | シグマアルドリッチ | Z119024-1EA | |
| オーブン | VWR | 9120976 | |
| デバイス製造と培養 | |||
| poly(メチルメタクリレート)(PMMA) | プレキシガラス | ||
| コロナトリーター | エレクトロテクニックプロダクツ株式会社 | BD-20 | PMMA装置・PDMS金型のプラズマ処理用ハンディタイプ |
| はんだごて | ウェラー | WTCPS | |
| ステンレス鋼トラスヘッド長付き小ねじ | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| ステンレス鋼ダウエルピン | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| セット | ミルテックス | 24-572 | 同様のピンセットを使用することができます |
| へら(マイクロスプーン) | 電子顕微鏡サービス | 62410-01 | |
| ドライバー | 任意のマイナスドライバーを使用することができます、オートクレーブ | ||
| ガラスカバースリップ(22 x 22 mm) | フィッシャーサイエンティフィック | 12-542B | |
| 漂白剤 | クロロックス | 4460030966 | |
| ペトリ皿(150 x25 mm) | Corning | 430599 | |
| ペトリ皿 (100 x 20 mm) | Corning | 2909 | |
| コットン、1 cm x 3 cm ピース | オートクレーブ処理ポリエチレン | ||
| イミン (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 細胞培養グレードの水で 1% に希釈 |
| グルタルアルデヒド | Sigma-Aldrich | G6257 | 細胞培養グレードの水 |
| で 0.1% に希釈滅菌済み H2O | オートクレーブ DI H2O | ||
| I型コラーゲン、0.1% 酢酸 | Rajan et. al. 2006 (ref #37)1 | ||
| ml シリンジ | BD | 309659 | |
| 10 ml シリンジ | BD | 309604 | |
| 15 ml コニカルチューブ | Corning | 352097 | |
| 30 mlコニカルチューブCorning | 352098 | ||
| M199 10xメディア | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1 N NaOH (滅菌) | Sigma-Aldrich | 415413 | 細胞培養グレードの水で 1 N に希釈 |
| HUVECs | ロンザ | ||
| 内皮増殖培地 | ロンザ | CC-3124 | |
| トリプシン | コーニング | 25-052-CI | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 10082147 | |
| Leuconostoc属のデキストラン(70 kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 血球計算盤 | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| ゲルローディングチップ | VWR | 37001-152 | |
| 18 Gブラントフィルニードル | BD | 305180 | |
| 20 Gステンレス鋼の分配の針 | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| タイゴン1/32 "ID、3/32 "ODシリコンチューブ | コールパー | マーEW-95702-00 | |
| 1/16 "チューブ間カップリング | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90°エルボーコネクター、チューブ間 | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| ルアーロックカップリング(メス、1/16インチ内径) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| プラスチック鉗子、ジョーグリップ付き | 電子顕微鏡サービス | 72971 | |
| デュアルシリンジポンプ | ハーバード装置 | 70-4505 | |
| 5 ml ポリスチレン丸底チューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| ホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 作業希釈 |
| FITC 結合抗フォンWillebrand 因子抗体 | Abcam | ab8822 | 1:100 作業希釈液 |
| ヤギ抗ウサギ 568 二次抗体 | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 作業希釈液 |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | DMSO |
| カコジル酸ナトリウムに再 | Sigma-Aldrich | C0250 | 0.2 Mカコジル酸緩衝液を作るには |
| エタノール | VWRインターナショナル | BDH1164-4LP | |
| 40 kDa FITC標識デキストラン | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| <ストロング>追加の培養試薬 | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | 低分子GSK-3阻害剤 |
| ヒト組換えVEGF | Peprotech | 100-20 | |
| ヒト組換えbFGF | Peprotech | AF-100-18B |
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