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方法論記事

微細と3D微小血管の組立

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DOI：

10.3791/54457

⸱

2016年9月9日

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。

要約

インビトロプラットフォームでは 、内皮細胞および血管生物学の大部分は、2D内皮細胞培養物に限定されている研究するポリマー又はガラスベースの基板、及びヒドロゲルベース管形成アッセイを用いてチャンバを流れます。これらのアッセイは、有益ながら、血管機能の調節に重要な役割を果たしルーメンジオメトリ、適切な細胞外マトリックス、および多細胞近接性を、再現しません。この原稿は、100ミクロンのオーダーの直径を有する操作された血管を生成するための射出成形方法を説明します。微小血管は、私は、ヒドロゲルコラーゲンネイティブ型内に埋め込まれたマイクロ流体チャネルに内皮細胞を播種することによって作製されます。形成チャネルの前に、コラーゲンマトリックス中で実質細胞を組み込むことによって、特定の組織の微小環境をモデル化し、研究することができます。流体力学的特性および培地組成の追加の変調は、所望の微小環境内での複雑な血管機能の制御を可能にします。このプラットフォームは、血管周囲細胞動員、血液 - 内皮相互作用、フロー応答、および組織微小血管相互作用の研究を可能にします。操作された微小血管は、血管ニッチの個々の成分の影響を単離する能力を提供し、正確に健康と病気の両方に血管生物学を研究するために、その化学的、機械的、および生物学的特性を制御します。

概要

各器官における微小血管系は、組織微小環境を定義する組織の恒常性を維持し、炎症、透過性、血栓症、および線維素溶解1,2を制御するのに役立ちます。 5 -微小血管内皮細胞は、特に、従って血流と周辺組織との間の界面は、流体力及び循環サイトカインおよびホルモン3などの刺激に応答した血管および臓器機能の調節において重要な役割を果たしています。内皮、血液、および周囲の組織の微小環境との間の詳細な相互作用を理解することは、血管生物学と疾患の進行の研究のために重要です。しかし、これらの相互作用を研究の進展は、 生体内微小血管構造に再現し、6,7を機能しない試験管ツールに制限することによって妨げられてきました。その結果、フィールドと治療の進歩は、高価で、時間に大きく依存してきました10 -しばしば人間8の成功に変換することができない動物モデルを消費します。 in vivoモデルは、病気のメカニズムと血管機能の研究に貴重であるが、それらは複雑であり、多くの場合、携帯個々の生化学的、および生物物理学的手がかりの正確な制御を欠いています。

体全体の血管系は、同時に11を最適化灌流および栄養素の輸送を提供し、広大な毛細血管床と一緒に成熟した階層構造を有しています。最初は、初期の開発12,13の間に階層的に分枝状のネットワークに再編成し、プリミティブ叢などの血管系が形成されます。これらのプロセスに関与するシグナルの多くはウェル14に理解されていますが- 16を 、そのような血管のパターニングは15どのように決定されるかとらえどころのないままになります。ターンでは、組織化血管ネットワークを設計するためにインビトロでこのプロセスを反復することは蜂を持っていますnは難しい。多くの既存のin vitroでのプラットフォームは、このような2次元の内皮細胞培養物として、このような多細胞近接、3次元管腔ジオメトリ、流れ、および細胞外マトリックスのような重要な特性を欠いている、血管系をモデル化します。 3Dハイドロゲル（コラーゲンまたはフィブリン）における管形成アッセイ17から19または浸潤アッセイ20,21は、他の血管17,22または組織細胞型23と3Dとの相互作用における内皮機能を研究するために使用されてきました。しかし、これらのアッセイにおいてルーメン相互接続性、血行動態の流れ、および適切な灌流を欠いて組み立てました。さらに、これらのチューブ形成アッセイ24における血管退行の傾向を行うことができる機能的研究の程度を制限する長期培養および成熟を ​​妨げます。このように、適切にモデル化することができる微小血管ネットワーク専用のin vitroでのプラットフォームを設計する急成長が必要です特性をdothelialし、長期培養が可能です。

血管工学技術の様々な血管疾患を有する患者で交換する医療用途やバイパス影響を受けた船舶のために年間で浮上しています。ポリエチレンテレフタレート（PET）、およびポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）などの合成材料から作製された大径の容器は、長期開存性（平均95％開通5年以上）25と、かなりの治療成功を収めています。小径合成移植片（<6ミリメートル）は、典型的には、内膜過形成および血小板新生26などの合併症に直面するが- 28を 、生物学的材料で作られた組織工学小径移植片は大きな進展29,30を行っています。この種の進歩にもかかわらず、マイクロスケールに設計された血管は、チャレンジを続けています。適切微小血管系をモデル化するために、SUFで複雑なネットワークパターンを生成する必要がありますficient機械的強度が開通し、実質細胞および細胞リモデリングのための両方の栄養浸透を可能にするマトリックス組成物を維持します。

34 -このプロトコルは、調整可能かつ制御可能な微小環境31に設定し、in vivoでのネイティブを模倣小説人工灌流血管ネットワークを提供します。記載されている方法は、100ミクロンのオーダーの直径を有する操作された微小血管を生成します。操作された微小血管は、私は、ヒドロゲルコラーゲンソフトタイプ内に埋め込まれたマイクロ流体チャネルを介して内皮細胞を灌流することによって作製されます。このシステムは、開いた管腔構造のパターニングされたネットワークを生成する多細胞相互作用を複製する細胞外マトリックス組成物を調節する、および生理学的に関連する血行力学的力を適用する能力を有します。

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プロトコル

ネットワークデザインとパターン化ポリジメチルシロキサン（PDMS）の1微細加工

  1. ネットワーク設計の負のテンプレートを作成するためのウェハ製造
    1. 任意のコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、ネットワークのパターンを作成します。 （2.1.1を参照）入口と出口との間の対角寸法は、将来のステップの住宅デバイスの入口と出口の貯水池の間の距離と一致していることを確認してください。
      注：パターン自体の設計は、カスタム（例えばパターンについては図1を参照）、ユーザの特定の研究の目標に依存します。
    2. 高解像度印刷を使用して、ネットワークのパターンのマ​​スクを生成したり、商業的供給業者からクロムフォトマスクを注文。フォトリソグラフィ工程のより詳細なプロトコルは、他の場所で35入手可能です。
    3. 酸素プラズマ処理と、100Wで5分間、8 "シリコンウェハを清掃してください。
    4. 十分なネガ型フォトレジスト（SU-8を注ぎ2100は直径2.5cmでフォーム塗るに抵抗するようにウエハ上に）うまく動作します。スピンコーターを用いて、100回転/秒の勾配で500rpmでウエハを回転し、10秒間維持します。その後、300回転数/秒で1600回転まで上昇し、30秒間維持します。注：速度及び150μmのレジスト厚を得るために、各実験室の条件のために最適化される必要があるランプ。
    5. ソフトベーク7分間65℃でウエハ、360℃/時間で95℃まで上昇し、45分間維持します。ゆっくりとホットプレート上で室温まで冷却。トリプルそのメーカーの推奨（約150ミクロンのSU-8の厚さのためには350mJ / cm 2）での暴露で、クロムフォトマスクの下で365 nmのUV光への曝露によって塗布されたウェハ上に血管パターンをインプリント。
      注：SU-8は、ネガ型レジストであるので、露光領域（パターン設計を除くすべてが）ステップ1.1.7で開発者に不溶となります。
    6. ハードベーク65で露光されたウェハ°5分間Cと、それはゆっく​​りとホットプレート上で室温まで冷却することができ、その後、360℃/時間で95℃まで上昇し、25分間維持します。
    7. 未露光は、圧縮窒素気流下でイソプロピルアルコールで清浄で乾燥した後、レジストを洗い流すために15分 - 10用のSU-8現像液にウェハを浸し。 SU-8レジストを確実にするために、光学顕微鏡下でパターンを検査することは、十分にウエハ（不要な剥がれや気泡を探してください）​​に接合されています。
    8. パターンの厚さを測定し、製造元の指示36に従ってプロフィルを使用しています。測定の取得時には、ウエハ上にパターン化機能の構造的完全性を損なう可能性接触ベースのプロフィルなどのネットワーク機能（ すなわち、入口と出口導管）のために不可欠な構造の領域を避けます。また、完全にこの問題を回避するために、非接触方式（ すなわち、光学プロフィルメータ）を使用します。
  2. Geのコラーゲン成形のためのパターン化とフラット金型のneration
    注：化学ヒュームフード内にシランを処理します。
    1. 表面をsilanizeする2時間トリクロロ（3,3,3-トリフルオロプロピル）シランを100μlとデシケーターにウェハを置きます。
    2. 120×120ミリメートルの正方形のペトリ皿にシラン化ウェハを転送します。 6ミリメートルの厚さ - 4を達成するために、ウェハ上：（1ワット/ワット比10）を混合注ぎ、脱気したPDMSエラストマーと硬化剤。パターンのない平坦な金型を生成するために、独立した120×120ミリメートルの正方形のペトリ皿に追加PDMSを注ぎます。 2時間65℃で硬化します。
    3. オーブンから取り出して、PDMSを室温に戻します。メスを用いて慎重にSU-8の周りの正方形をカットし、ゆっくりとウエハからPDMSモールドを剥がします。 X 30ミリメートル30ミリメートルの縁をトリミングします。平らな金型の場合、カットは、x 40ミリメートル40ミリメートル程度の正方形片にインプリントされたパターンなしPDMSを硬化させました。

2.住宅機器

  1. Fabricatトップとボトム住宅個のイオン
    1. ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）を使用して容器ハウジングを製作。製造するために、コンピュータ数値制御（CNC）フライス機能を備えた標準的な機械工場から部品を注文。トップとボトムピースの概略については、 図 1を参照してください。
    2. 隅に位置デバイスの上に、1mmの深さで装置の下側ウェル×20から20mmミリメートル含むように上部ハウジング部（ 図1D）を設計2のコラーゲン注入口（4ミリメートル直径）正方形のウェル6ミリメートルの直径を有する2つの入口と出口リザーバ、及び装置の四隅に4つのネジ穴（直径3mm）。
      注意：追加の穴は、目的を処理するための部品の周囲に穿孔されてもよいです。
    3. 周囲25ミリメートル×25 mmの真ん中に四角い穴が含まれるように底部ハウジング片（ 図1E）を設計（寸法は15ミリメートル×15 mm）の0.25ミリメートルの深さに棚。 4-40糸で4ネジ穴を開けます。底部にあるネジ穴を確認し、トップピースは、将来の組み立て工程に一緒に配置されます。

3.微小血管デバイスの製造

  1. 材料の調整
    1. ウォッシュとピンセットのオートクレーブ2セット、ステンレス製のへら、小さな平らなスクリュードライバー、ステンレス鋼製ねじ、およびいくつかのステンレス鋼ダウエルピン。容器の製造のために、また、マイクロパターンPDMS金型をオートクレーブ、平らな正方形、ガラスカバースリップ（22×22 mm）で、綿片をPDMS。
    2. 2回組織培養フード中でオートクレーブ滅菌水ですすいで、少なくとも1時間、漂白剤でPMMAハウジング片を滅菌し、無菌の組織培養皿で空気乾燥（150ミリメートル×25ミリメートル）に許可します。
  2. 無菌のポリエチレンイミン-グルタルアルデヒド（PEI - GA）コーティング
    1. 滅菌乾燥PMMA片の内側の井戸を扱います約1分間のプラズマで。 10分間のPMMA個の（上部と下部に25ミリメートルの正方形の棚の上の正方形も20ミリメートル）の内側ウェルに1％ポリエチレンイミン（PEI）を追加します。滅菌H 2 Oで洗浄し、組織培養フード内で乾燥させます。
      注：プラズマ処理に必要な時間は、使用するデバイスに応じて可変である - PEIは、親水性表面を示す容易に広がる必要があります。そうでない場合、追加のプラズマ処理を必要とすることができます。
    2. PEIを30分間PMMA片の表面を処理した上で、0.1％グルタルアルデヒド（GA）を適用します。滅菌水で2回すすぎ、乾燥させます。
      注：将来のステップでは、コラーゲンは、コラーゲン、グルタルアルデヒド架橋により被覆された表面に付着します。これは、将来の組み立て工程には、デバイスの培養期間を通して装置内の所定の位置にゲルを固定するのに役立ちます。
  3. コラーゲンゲルの準備
    1. 0.6％を使用して血管を作製 - 1％のコラーゲンソリューション。水酸化ナトリウム（NaOH）、10倍メディアサプリメント（M199）、および細胞培養培地を用いて- （単離されたラットから37をテール1.5％）容器の製造のための0.75％コラーゲンを作るために、私は原液型コラーゲンを混ぜます。氷の上のすべてのソリューションをしてください。
    2. Vのƒinal必要なゲルの最終容量で、次式、により、コラーゲンの量を決定する（典型的には、デバイスごとにコラーゲン1mlのが十分である）、V ストックコラーゲンが必要な在庫コラーゲンの量は、C ストックコラーゲン濃度であります在庫コラーゲン、およびCƒinalコラーゲンは血管内のコラーゲンの所望の濃度です。
      figure-protocol-1
    3. 新しい30ミリリットルコニカルチューブに株式コラーゲンの適切な量を転送するために1ミリリットル注射器を使用してください。中和のNaOH（V のNaOH）、M199 10倍メディアサプリメントのボリュームを決定（V 10 X）、および細胞培養培地（V 1 X）は、以下のように、そして15mlのコニカルチューブに別々に混合します。
      figure-protocol-2
    4. 中和試薬等分コラーゲン（V 1 X V 10 X、V のNaOH）の混合物を追加し、均一なゲルが得られるまで溶液を穏やかに混合するために、小さなへらを使用しています。ゆっくりと穏やかに攪拌することにより気泡を導入することは避けてください。
    5. 、 - （20万細胞/ mlで、例えば、0.5）は、中和試薬と混合した後、コラーゲン溶液に細胞を加え、細胞を均一に分散されるまで攪拌し続け、所望の濃度でマトリックスに細胞を組み込みます。
    6. セルが追加されると、以下の式、V 細胞によって決定されるように、追加のボリュームを収容するために細胞培養培地の体積を調整</サブ>細胞懸濁液の必要量であり、Cƒinal細胞密度は、容器内の細胞の所望の密度であり、C 懸濁細胞密度は、ストック溶液中の細胞の密度です。
      figure-protocol-3
  4. コラーゲン注射-トップワンピース
    1. 100ミリメートル×20 mmディッシュにマイクロパターンPDMSモールドを配置します。 1分間PDMSモールドをプラズマ洗浄。
    2. モールド上の正方形貯水池は、入口と出口の貯水池の直下にあるように、（ -破線図1Dを参照）PDMSモールドの上にトップPMMAピースを合わせます。入口にステンレス製のノックピンを配置し、パターンに貯水池から明らかなアクセスを維持するために、トップPMMA片に貯留穴出口。
    3. 0.6ミリリットルのコラーゲン - 〜0.5を抽出するために、1ミリリットル注射器を使用してください。気泡がシリンジ内に残っていないことを確認してください。
    4. リットルダウンプレスightly上部筐体にピンセットでトップピースとPDMSモールド間のフラッシュの接触を確実にします。トップPMMAピース上の注入口からゆっくりとコラーゲンを注入します。そのコラーゲンがパターンの上20ミリメートル×20ミリメートルのドメインに記入し、漏れないか確認してください。
    5. ノックピンを目白押しずに料理を閉じて、30分間37℃のインキュベーターでゲル化することを可能にします。
  5. コラーゲン注射-ボトムワンピース
    1. 底部片の中央に22×22ミリメートルのガラスカバースリップを置きます。スライドガラス上に均等〜0.25ミリリットルのコラーゲンを分配するために1ミリリットル注射器を使用してください。静かにPDMSは、PMMAに対して平らであり、トラップされた気泡が存在しない確実に、コラーゲンの上にPDMS平らな正方形を下げます。 30分間37℃でゲル化することを可能にします。
  6. デバイス組立
    1. ゲル化後、PDMS（約1ml）を囲むように底部片の上に平らにPDMSピースの周りに十分なPBSを追加します。任意の電子メールを削除するためにピンセットを使用して、エクセスのエッジの周りのコラーゲン、およびゆっくりはPDMSピースをはがします。水和を維持するために、コラーゲンの上に複数のPBSを追加します。
    2. トップ片を作成するには、トップPMMAピースをピックアップし、PDMSモールドが上になるようにそれを裏返しするためにピンセットを使用しています。その後すぐに、インターフェイスにPBSの数滴を追加し、しっかりとトップPMMAピースからPDMSモールドを削除します。
    3. 静かにピンセットの別のペアを使用して、PMMAハウジングの反対側からステンレス製のノックピンを削除します。マイクロパターンコラーゲン上にPBSのより多くの数滴を追加します。コラーゲンはダウン向くようにPMMAトップピースを裏返し、コーナーの穴に4本のネジを配置します。
    4. 静かに底部片の角穴にネジを合わせて、底部片の上にトップピースを置きます。 2個が互いに摺動することはできません。優しいタッチを使用してネジを締めドライバを使用します。締めすぎないようにしてください。
    5. PMMA表面を囲むPBSを吸引し、小さなパイを配置デバイスの一方の縁の下に綿のECE。ピペットを用いて、貯水池から任意のPBSを除去し、細胞培養培地と交換してください。デバイスは、少なくとも1時間、37℃のインキュベーター中で一緒にゲル化することを可能にします。
  7. 細胞播種
    1. 37℃での内皮細胞増殖培地中で培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）（CO 2、O ​​2）コンフルエント38。可能な限り、通路4と7の間で使用しています。
    2. PBSを6 mlの培養フラスコを洗浄した後、細胞を解離するために37℃で、0.05％トリプシンを2mlを添加することによって、内皮細胞をトリプシン処理。接着斑の大部分が剥離しており、細胞が切り上げされるまで、（ - 3分これは典型的には約2かかります）、トリプシンで細胞を残します。ウシ胎児血清（FBS）を含有する内皮増殖培地を4mlを添加することによりトリプシン化反応を停止させます。細胞がフラスコから分離されていることを確認し、収集するメディア数回フラスコを洗いますコニカルチューブインチ
    3. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、1mlあたり1000万個の細胞の密度で再懸濁します。入口と出口の貯水池からのすべての細胞培養培地を除去します。 200μlのゲルローディングチップを使用して、入口リザーバの中央に10μlの細胞懸濁液を追加します。細胞は、直ちにネットワークとコートのネットワークに流入を開始する必要があります。
    4. 均等に両方の貯水池に200μlの培地を加え、細胞が付着し、少なくとも1時間、ネットワーク内で広がってみましょう。
  8. デバイスの文化
    1. 入口リザーバと出口リザーバ50μlに細胞培養培地を200μlを添加することによって、ネットワークを通る流れを駆動重力とともに培養装置。文化のこの方法では、内皮生存率を維持するために12時間毎にメディアを交換してください。
      注：連続流培養条件が望ましい場合（一定のせん断応力を維持出口等でメディアを収集する）SYRインゲポンプの代わりに重力駆動の培養を用いてもよいです。
    2. 少なくとも24時間播種された内皮細胞が連続した流れを適用する前に添付して安定させます。連続フローの設定に先立ち、重力駆動流の条件を備えたデバイスを維持します。
      注：適用されたフローのための培地条件は、重力駆動の文化とは異なります。メディアへのデキストランのような血漿増量の添加は、操作された微小血管を安定化し、持続的な潅流39中の血管虚脱を防止します。
    3. 連続フローのセットアップのためのメディアを作成するには、最適な血管培養用の内皮増殖培地に3.5％のデキストラン（70 kDaの）を溶解。無菌技術を用いて、3.5％デキストランと内皮増殖培地で10ミリリットル注射器を埋めます。
    4. はんだごてを使用して、ペトリ皿の側壁に穴を溶融することにより、フローのための無菌培養皿を準備します。
    5. ルアーロックカップリング（メス、1月16日「ID）に12 "シリコンチューブ（1/32" ID）を取り付け、1 /もう一方の端にチューブのセグメント16」1との直管・ツー・チューブコネクタ」。セグメント「1の自由端に（針ハブから取り外さ）20Gブラント針」の1/4を挿入します。また、（ハウジング入口に嵌合する）。その後の工程では、より長いチューブが準備皿に通されると3に取り付けたチューブ対チューブ90°エルボコネクタージョイントに取り付けられたチューブの3」のセグメントを準備20 Gの針を介して、「セグメント。アウトレットチューブではなく、ルアーロックカップリングの自由端と、入口チューブを反映する必要があります。使用前にすべてのセグメントをオートクレーブ。
    6. スレッドは、準備された皿の中の穴を通って入口と出口チューブをオートクレーブ処理します。インナー20 Gの針に3」のセグメントを接続します。メディアフィルドシリンジにルアーロックカップリングを取り付け、高流量に設定し、シリンジポンプを使用して、チューブを介してメディアを灌流。チューブやコネクター内に気泡がないことを確認し、このような容器への流れを妨げるであろう。
    7. Cを挿入onnectorハウジング入口にジョイント。所望の流量にシリンジポンプを設定し、灌流を開始します。
      注：これは、容器の形状と、印加剪断応力の実験条件に応じて調整することができます。 100μmの直径のチャネルについて、3μL/分の流速をうまく働きます。
    8. 必要であれば、メディアの500μLを含む滅菌5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに挿入準備出口チューブと灌流液を収集します。
      注：メディアの少量の流れを遮断することができ、気泡の形成を防止するために、収集管に添加します。
    9. 流量に応じて、注射器は、24〜36時間後に再充填する必要があるかもしれません。これは、ハウジングの入口からコネクタを取り外し、シリンジを交換し、メディアは、いくつかの分の高流速で灌流させることによって行われます。このシーケンスは、気泡がチューブに導入されることはありません。 、培養のための所望の流量にポンプをリセットハウジング入口にコネクタを挿入し、インキュベーターに戻します。

4.デバイスの解析

  1. 透過性の分析
    1. その場で 、血管の透過性を可視化するために、40kDaのFITC-デキストランを使用してください。共焦点顕微鏡で血管ハウジングを置き、容器の面に焦点を合わせます。 、4倍の倍率で入口と画像に25ミリ秒の露光時間を5μM40kDaのFITC-デキストランを追加し、10分間、毎秒1フレームで。
    2. 鄭らによって発表されたモデルに基づいて、コラーゲン（ミクロン/秒）に血管壁を横切ってデキストランの透過性を推定するために、解析コードの画像シリーズを分析します。アル 。31。
  2. 免疫染色＆共焦点イメージング解析
    1. 血管を修正するには、PBSを3回（1回の洗浄あたり20分）を灌流することにより、20分および洗浄のための入口を通って3.7％ホルムアルデヒドで灌流。 2％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.5％トリトンX-100、PEとの結合をブロック非特異的抗体1時間、ネットワークを介してrfused。 4℃で一晩、一次抗体溶液を灌流し、PBSで3回洗浄します。 1ための二次抗体溶液を潅流 - 2時間、および同様にPBSで再び洗浄します。
    2. 1ミクロンのzステップと共焦点顕微鏡を用いてその場で微小血管の免疫蛍光画像を撮ります。画像4X、10X、または20Xの倍率で微小血管。
      注：10Xと20X拡大画像は、このような等伸び、接合形成、などの細胞の詳細を提供する一方4Xの倍率は、グローバルネットワークの構成情報を提供します。
    3. Z投影（画像/スタック/ Z-プロジェクト）、断面（画像/スタック/直交ビュー）、および3D再構成（画像/スタック/ 3Dプロジェクト）でのImageJを用いて、画像スタックを分析します。
  3. 走査電子顕微鏡イメージング
    1. 電子顕微鏡分析のために、カルノフスキーのゾル半強度を灌流することによってその場で修正しますution（2％パラホルムアルデヒド/ 0.2 Mカコジル酸緩衝液中の2.5％グルタルアルデヒド）で一晩。容器を分解、慎重に2つに分解。縁をトリミングして、完全に数日間固定液に浸します。
    2. （各2分）を20分間25％グルタルアルデヒド中の容器の厚さの上部を浸し、PBSで3回すすいでください。 50％、70％、85％（2分毎）および100％エタノールで2回洗浄し（各5分）の連続エタノール洗浄で脱水。
    3. 製造業者のプロトコル40次の臨界点乾燥によってさらに脱水による分析のためのサンプルを準備します。金 - パラジウム（7 nm）を用いてコートに容器をスパッタし、5 kVで、スポットサイズ3の加速電圧と走査型電子顕微鏡で分析します。

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結果

操作された容器プラットフォームは、私はマトリックスの天然型コラーゲンの中に埋め込 ​​まれた機能的な微小血管系を作成し、in vitroで 、細胞の生物物理学的および生化学的環境の厳密な制御を可能にします。操作された微小血管を作製するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、それらが特許ルーメンとコンフルエント内皮を形成する添付コラーゲン包埋マイクロ流体ネットワークを介して灌流します。 図1A-Cに示すように、容器の幾何学的形状は、具体的には、とりわけ、流量、ねじれ、および角度を分岐、に関する質問に答えるように設計することができます。微小血管を通る流量を調節することは、内皮細胞のせん断応力応答への洞察を提供します。以前に、製造の焦点は、主に100ミクロンのサイズ範囲の血管に、しかし500ミクロンまでの微小血管されているか、ある場合には、直径が50μmだけ小さくSUCCされていますessfully製培養しました。長期開存の例としては、重力駆動流（ 図2A）と連続印加された流れ（

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ディスカッション

操作された微小血管は、管腔の幾何学、流体力学的な力、および多細胞相互作用などの生理的特徴が存在して調整可能でin vitroモデルです。プラットフォームのこのタイプは、それがモデル化し、in vitroでの培養条件は、問題の微小環境のそれに一致させることができる様々な状況下で内皮挙動を研究する能力を提供することで強力です。例えば、このような血管新生などの内皮のプロセスを、駆動機構は、異なる器官で、そのような健康と病気44など、さまざまな病理学的状態、で異なって発生することが知られています。このため、平面内皮細胞培養物は、一貫して6不十分であり、そのようなフィールドは、コストと時間がかかる動物モデルに大きく依存しているように。

動物モデルは、生物学的研究の進展のために有益で不可欠ながら、常に診療所にうまく変換されません。これは主に、特に9,45を刺激するそれらの応答について、マウスおよびヒトの生物学との間の差に起因しています。動物モデルから収集された情報を補完する追加のヒト特異的デー...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者らは、幹細胞および再生医学だけでなく、ワシントン大学のワシントンナノファブリケーション施設のための研究所のリンとマイク・ガーベイイメージング研究所を承認したいと思います。彼らはまた、国立衛生研究所の財政支援は、（YZへ）DP2DK102258を付与し、訓練助成金（SSKとMARへ）T32EB001650とT32HL007312（MAR）は認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Wafer Fabrication
AutoGlow プラズマシステムAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc. PWM32 スピンコーター 
ABM コンタクト アライナーAB-M
Alpha ステップ形状測定機TencorAlpha Step 200
SU-8 DeveloperMicrochemY020100
SU-8 レジストMicrochemSU-8 2000
8" シリコンウェーハWafer World Inc.
卓上マイクロパターンジェネレータハイデルベルグインスツルメンツμPG 101フォトマスクの生成用
ホットプレートVWR97042-646
イスプロピルアルコールアバンター パフォーマンス マテリアルズ 9088
ペトリ皿 (120 x 120 mm、正方形)シグマ・アルドリッチZ617679
トリクロロ (3,3,3-トリフルオロプロピル) シランシグマ・アルドリッチMKBG3805V
ポリジメチルシロキサン (PDMS) エラストマーベース硬化剤ダウコーニングシルガード184110:1(w / w)
真空デシケーターシグマアルドリッチZ119024-1EA
オーブンVWR9120976
デバイス製造と培養
poly(メチルメタクリレート)(PMMA)プレキシガラス
コロナトリーターエレクトロテクニックプロダクツ株式会社BD-20PMMA装置・PDMS金型のプラズマ処理用ハンディタイプ
はんだごてウェラー WTCPS
ステンレス鋼トラスヘッド長付き小ねじMcMaster-Carr 91785A096
ステンレス鋼ダウエルピンMcMaster-Carr 93600A060
セット ミルテックス24-572同様のピンセットを使用することができます
へら(マイクロスプーン)電子顕微鏡サービス62410-01
ドライバー任意のマイナスドライバーを使用することができます、オートクレーブ
ガラスカバースリップ(22 x 22 mm)フィッシャーサイエンティフィック12-542B
漂白剤クロロックス4460030966
ペトリ皿(150 x25 mm)Corning430599
ペトリ皿 (100 x 20 mm)Corning2909
コットン、1 cm x 3 cm ピースオートクレーブ処理ポリエチレン
イミン (PEI)Sigma-AldrichP3143細胞培養グレードの水で 1% に希釈
グルタルアルデヒドSigma-AldrichG6257細胞培養グレードの水
で 0.1% に希釈滅菌済み H2Oオートクレーブ DI H2O
I型コラーゲン、0.1% 酢酸Rajan et. al. 2006 (ref #37)1
ml シリンジBD309659
10 ml シリンジBD309604
15 ml コニカルチューブCorning352097
30 mlコニカルチューブCorning352098
M199 10xメディア Life Technologies11825-015
1 N NaOH (滅菌)Sigma-Aldrich415413細胞培養グレードの水で 1 N に希釈
HUVECsロンザ
内皮増殖培地ロンザCC-3124
トリプシンコーニング25-052-CI
ウシ胎児血清 (FBS)サーモフィッシャー サイエンティフィック10082147
Leuconostoc属のデキストラン(70 kDa)Sigma-Aldrich31390
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Corning21-031-CV
血球計算盤Hausser Scientific Co.3200
ゲルローディングチップVWR37001-152
18 GブラントフィルニードルBD 305180
20 Gステンレス鋼の分配の針McMaster-Carr75165A123
タイゴン1/32 "ID、3/32 "ODシリコンチューブコールパーマーEW-95702-00
1/16 "チューブ間カップリングMcMaster-Carr5116K165
90°エルボーコネクター、チューブ間McMaster-Carr5121K901
ルアーロックカップリング(メス、1/16インチ内径)McMaster-Carr51525K211
プラスチック鉗子、ジョーグリップ付き電子顕微鏡サービス72971
デュアルシリンジポンプハーバード装置70-4505
5 ml ポリスチレン丸底チューブフィッシャーサイエンティフィック14-959-2A
Device Analysis
ホルムアルデヒドSigma-AldrichF8775
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA8806-5G
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Rabbit anti-hCD31Abcamab324571:25 作業希釈
FITC 結合抗フォンWillebrand 因子抗体Abcamab88221:100 作業希釈液
ヤギ抗ウサギ 568 二次抗体Thermofisher ScientificA-110111:100 作業希釈液
HoeschtThermofisher ScientificH1399DMSO
カコジル酸ナトリウムに再Sigma-AldrichC02500.2 Mカコジル酸緩衝液を作るには
エタノールVWRインターナショナルBDH1164-4LP
40 kDa FITC標識デキストランSigma-AldrichFD40S 
<ストロング>追加の培養試薬 
CHIR-99021Selleck ChemS2924低分子GSK-3阻害剤
ヒト組換えVEGFPeprotech100-20
ヒト組換えbFGFPeprotechAF-100-18B
ピン任意のにカット に溶解 懸濁 

参考文献

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