微細と3D微小血管の組立

サマリー

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。

要約

インビトロプラットフォームでは 、内皮細胞および血管生物学の大部分は、2D内皮細胞培養物に限定されている研究するポリマー又はガラスベースの基板、及びヒドロゲルベース管形成アッセイを用いてチャンバを流れます。これらのアッセイは、有益ながら、血管機能の調節に重要な役割を果たしルーメンジオメトリ、適切な細胞外マトリックス、および多細胞近接性を、再現しません。この原稿は、100ミクロンのオーダーの直径を有する操作された血管を生成するための射出成形方法を説明します。微小血管は、私は、ヒドロゲルコラーゲンネイティブ型内に埋め込まれたマイクロ流体チャネルに内皮細胞を播種することによって作製されます。形成チャネルの前に、コラーゲンマトリックス中で実質細胞を組み込むことによって、特定の組織の微小環境をモデル化し、研究することができます。流体力学的特性および培地組成の追加の変調は、所望の微小環境内での複雑な血管機能の制御を可能にします。このプラットフォームは、血管周囲細胞動員、血液 - 内皮相互作用、フロー応答、および組織微小血管相互作用の研究を可能にします。操作された微小血管は、血管ニッチの個々の成分の影響を単離する能力を提供し、正確に健康と病気の両方に血管生物学を研究するために、その化学的、機械的、および生物学的特性を制御します。

概要

各器官における微小血管系は、組織微小環境を定義する組織の恒常性を維持し、炎症、透過性、血栓症、および線維素溶解^1,2を制御するのに役立ちます。 ^{5 -}微小血管内皮細胞は、特に、従って血流と周辺組織との間の界面は、流体力及び循環サイトカインおよびホルモン³などの刺激に応答した血管および臓器機能の調節において重要な役割を果たしています。内皮、血液、および周囲の組織の微小環境との間の詳細な相互作用を理解することは、血管生物学と疾患の進行の研究のために重要です。しかし、これらの相互作用を研究の進展は、 生体内微小血管構造に再現し^、6,7を機能しない試験管ツールに制限することによって妨げられてきました。その結果、フィールドと治療の進歩は、高価で、時間に大きく依存してきました^{10 -}しばしば人間⁸の成功に変換することができない動物モデルを消費します。 in vivoモデルは、病気のメカニズムと血管機能の研究に貴重であるが、それらは複雑であり、多くの場合、携帯個々の生化学的、および生物物理学的手がかりの正確な制御を欠いています。

体全体の血管系は、同時に^11を最適化灌流および栄養素の輸送を提供し、広大な毛細血管床と一緒に成熟....

プロトコル

ネットワークデザインとパターン化ポリジメチルシロキサン（PDMS）の1微細加工

1. ネットワーク設計の負のテンプレートを作成するためのウェハ製造
   1. 任意のコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、ネットワークのパターンを作成します。 （2.1.1を参照）入口と出口との間の対角寸法は、将来のステップの住宅デバイスの入口と出口の貯水池の間の距離と一致していることを確認してください。
      注：パターン自体の設計は、カスタム（例えばパターンについては図1を参照）、ユーザの特定の研究の目標に依存します。
   2. 高解像度印刷を使用して、ネットワークのパターンのマ​​スクを生成したり、商業的供給業者からクロムフォトマスクを注文。フォトリソグラフィ工程のより詳細なプロトコルは、他の場所で³⁵入手可能です。
   3. 酸素プラズマ処理と、100Wで5分間、8 "シリコンウェハを清掃してください。
   4. 十分なネガ型フォトレジスト（SU-8を注ぎ2100は直径2.5cmでフォーム塗るに抵抗するようにウエハ上に）うまく動作します。スピンコーターを用いて、100回転/秒の勾配で500rpmでウエハを回転し、10秒間維持します。その後、300回転数/秒で1600回転まで上昇し、30秒間維持します。注：速度及び150μmのレジスト厚を得るために、各実験室の条件のために最適化される必要がある....

結果

操作された容器プラットフォームは、私はマトリックスの天然型コラーゲンの中に埋め込 ​​まれた機能的な微小血管系を作成し、in vitroで 、細胞の生物物理学的および生化学的環境の厳密な制御を可能にします。操作された微小血管を作製するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、それらが特許ルーメンとコンフルエント内皮を形成する添付コラーゲン包埋マイクロ流体ネットワークを介して灌流します。 図1A-Cに示すように、容器の幾何学的形状は、具体的には、とりわけ、流量、ねじれ、および角度を分岐、に関する質問に答えるように設計することができます。微小血管を通る流量を調節することは、内皮細胞のせん断応力応答への洞察を提供します。以前に、製造の焦点は、主に100ミクロンのサイズ範囲の血管に、しかし500ミクロンまでの微小血管されているか、ある場合には、直径が50μmだけ小さくSUCCされていますessfully製培養しました。長期開存の例としては、重力駆動流（ 図2A）と連続印加された流れ（

ディスカッション

操作された微小血管は、管腔の幾何学、流体力学的な力、および多細胞相互作用などの生理的特徴が存在して調整可能でin vitroモデルです。プラットフォームのこのタイプは、それがモデル化し、in vitroでの培養条件は、問題の微小環境のそれに一致させることができる様々な状況下で内皮挙動を研究する能力を提供することで強力です。例えば、このような血管新生などの内皮のプロセスを、駆動機構は、異なる器官で、そのような健康と病気⁴⁴など、さまざまな病理学的状態、で異なって発生することが知られています。このため、平面内皮細胞培養物は、一貫して⁶不十分であり、そのようなフィールドは、コストと時間がかかる動物モデルに大きく依存しているように。

動物モデルは、生物学的研究の進展のために有益で不可欠ながら、常に診療所にうまく変換されません。これは主に、特に^9,45を刺激するそれらの応答について、マウスおよびヒトの生物学との間の差に起因しています。動物モデルから収集された情報を補完する追加のヒト特異的デー.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Wafer Fabrication
AutoGlow プラズマシステム	AutoGlow
Headway Spin Coater	Headway Research, Inc.	PWM32 スピンコーター
ABM コンタクト アライナー	AB-M
Alpha ステップ形状測定機	Tencor	Alpha Step 200
SU-8 Developer	Microchem	Y020100
SU-8 レジスト	Microchem	SU-8 2000
8" シリコンウェーハ	Wafer World Inc.
卓上マイクロパターンジェネレータ	ハイデルベルグインスツルメンツ	μPG 101	フォトマスクの生成用
ホットプレート	VWR	97042-646
イスプロピルアルコール	アバンター パフォーマンス マテリアル	ズ 9088
ペトリ皿 (120 x 120 mm、正方形)	シグマ・アルドリッチ	Z617679
トリクロロ (3,3,3-トリフルオロプロピル) シラン	シグマ・アルドリッチ	MKBG3805V
ポリジメチルシロキサン (PDMS) エラストマーベース硬化剤	ダウコーニング	シルガード184110	:1(w / w)
真空デシケーター	シグマアルドリッチ	Z119024-1EA
オーブン	VWR	9120976
デバイス製造と培養
poly(メチルメタクリレート)(PMMA)	プレキシガラス
コロナトリーター	エレクトロテクニックプロダクツ株式会社	BD-20	PMMA装置・PDMS金型のプラズマ処理用ハンディタイプ
はんだごて	ウェラー	WTCPS
ステンレス鋼トラスヘッド長付き小ねじ	McMaster-Carr	91785A096
ステンレス鋼ダウエルピン	McMaster-Carr	93600A060
セット	ミルテックス	24-572	同様のピンセットを使用することができます
へら(マイクロスプーン)	電子顕微鏡サービス	62410-01
ドライバー			任意のマイナスドライバーを使用することができます、オートクレーブ
ガラスカバースリップ(22 x 22 mm)	フィッシャーサイエンティフィック	12-542B
漂白剤	クロロックス	4460030966
ペトリ皿(150 x25 mm)	Corning	430599
ペトリ皿 (100 x 20 mm)	Corning	2909
コットン、1 cm x 3 cm ピース			オートクレーブ処理ポリエチレン
イミン (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	細胞培養グレードの水で 1% に希釈
グルタルアルデヒド	Sigma-Aldrich	G6257	細胞培養グレードの水
で 0.1% に希釈滅菌済み H2O			オートクレーブ DI H2O
I型コラーゲン、0.1% 酢酸			Rajan et. al. 2006 (ref #37)1
ml シリンジ	BD	309659
10 ml シリンジ	BD	309604
15 ml コニカルチューブ	Corning	352097
30 mlコニカルチューブCorning		352098
M199 10xメディア	Life Technologies	11825-015
1 N NaOH (滅菌)	Sigma-Aldrich	415413	細胞培養グレードの水で 1 N に希釈
HUVECs	ロンザ
内皮増殖培地	ロンザ	CC-3124
トリプシン	コーニング	25-052-CI
ウシ胎児血清 (FBS)	サーモフィッシャー サイエンティフィック	10082147
Leuconostoc属のデキストラン(70 kDa)	Sigma-Aldrich	31390
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Corning	21-031-CV
血球計算盤	Hausser Scientific Co.	3200
ゲルローディングチップ	VWR	37001-152
18 Gブラントフィルニードル	BD	305180
20 Gステンレス鋼の分配の針	McMaster-Carr	75165A123
タイゴン1/32 "ID、3/32 "ODシリコンチューブ	コールパー	マーEW-95702-00
1/16 "チューブ間カップリング	McMaster-Carr	5116K165
90°エルボーコネクター、チューブ間	McMaster-Carr	5121K901
ルアーロックカップリング(メス、1/16インチ内径)	McMaster-Carr	51525K211
プラスチック鉗子、ジョーグリップ付き	電子顕微鏡サービス	72971
デュアルシリンジポンプ	ハーバード装置	70-4505
5 ml ポリスチレン丸底チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-2A
Device Analysis
ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	F8775
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A8806-5G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
Rabbit anti-hCD31	Abcam	ab32457	1:25 作業希釈
FITC 結合抗フォンWillebrand 因子抗体	Abcam	ab8822	1:100 作業希釈液
ヤギ抗ウサギ 568 二次抗体	Thermofisher Scientific	A-11011	1:100 作業希釈液
Hoescht	Thermofisher Scientific	H1399	DMSO
カコジル酸ナトリウムに再	Sigma-Aldrich	C0250	0.2 Mカコジル酸緩衝液を作るには
エタノール	VWRインターナショナル	BDH1164-4LP
40 kDa FITC標識デキストラン	Sigma-Aldrich	FD40S
<ストロング>追加の培養試薬
CHIR-99021	Selleck Chem	S2924	低分子GSK-3阻害剤
ヒト組換えVEGF	Peprotech	100-20
ヒト組換えbFGF	Peprotech	AF-100-18B

ピン任意のにカット に溶解 懸濁