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方法論記事

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

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DOI:

10.3791/54465

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2016年10月5日

 ,  , 
1Department of Animal Science, University of California, Davis

この記事について

サマリー

このプロトコルは、家畜の受精卵における細胞質マイクロインジェクションの方法を示しています。この技術は、ノックアウト動物を生成するためのゲノム編集ツールなど、あらゆる溶液を1細胞胚に導入するために使用できます。

要約

細胞質マイクロインジェクションは、非常に強力な技術です。一例として、成体生物のすべての細胞に存在する遺伝子改変を作成できるゲノム編集ツールの提供が可能になります。また、siRNA、mRNA、またはブロッキング抗体の送達にも使用でき、着床前胚の遺伝子機能を研究することができます。従来のげっ歯類の胚へのマイクロインジェクション技術は、非常に細いマイクロピペットを用いており、胚に進入すると原形質膜に直接浸透します。この手法を家畜に適用すると、通常は効率が低下します。これは主に、マウスやラットとは対照的に、ウシ、ヒツジ、ブタの受精卵は非常に暗い細胞質と非常に弾力性のある原形質膜を持っているため、注射中の可視化や原形質膜の浸透が困難であるためです。このプロトコルでは、ヒツジおよびブタの胚に対しても成功することが証明されている、ウシの接合子の細胞質への溶液の送達に適したマイクロインジェクション法について説明します。まず、レーザーを使用して透明帯に穴を開けます。次に、鈍い端のガラスマイクロピペットを穴から導入し、針の先端が胚の約3/4に達するまで進めます。次に、針の内側の細胞質内容物の吸引により、原形質膜が破壊されます。最後に、吸引された細胞質内容物に続いて目的の溶液が胚の細胞質に戻されます。このプロトコルは、ウシおよびヒツジの受精卵にさまざまな溶液を100%の効率で、溶解を最小限に抑え、正常な胚盤胞の発生速度で成功裏に使用されています。

概要

1細胞胚の細胞質マイクロインジェクションは非常に強力な手法です。これは、例えば、遺伝子機能を研究するために、または遺伝子編集動物を生成するために遺伝子ノックアウトを生成するために胚に任意の溶液を送達するために使用することができます。ほとんどの農学関連の農場の動物の接合体は、それらの細胞質が不透明と1ダークになり、非常に高い脂肪酸組成を有します。彼らはまた、かなり弾性原形質膜（PM）を有します。これらの特性は、挑戦的で、しばしば不正確なげっ歯類で使用されるような従来の前核/細胞質の注入を使用して、マイクロインジェクションを行います。

実行が容易であり、また、より高い生存率を2で、その結果、注入された胚にはあまりダメージを引き起こすため、細胞質マイクロインジェクションは、前核マイクロインジェクションを超える利点を有しています。このプロトコルの全体的な目標は、農場の動物の接合体の細胞質にソリューションを提供するための成功した方法を実証することです。実行できるようにするには家畜の胚に高い効率で細胞質マイクロインジェクション、レーザは透明帯（ZP）に穴を生成するために使用され、その後、平滑末端ガラス針をマイクロインジェクションのために使用されます。この戦略は、注入中の胚に刻印機械的損傷を軽減することを目指しています。その後、注射針の内側の細胞質内容物の吸引は、溶液は、胚の細胞質に送達されることを確実にPMを効率的かつ自信を持って破損することができます。

この技術はすでに正常接合体の細胞質3,4へのsiRNAを送達するようにし、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）/ CRISPR関連するシステム9（Cas9）システム5を用いて、突然変異を生成するために、ウシの胚で使用されてきました。また、ウシ卵丘に囲まれた卵母細胞6を注入する（若干修正済み）が適しています。ここでは、色素を提供我々の注入プロトコルを説明し、それは任意のDESの注入に適用することができますIRED接合子への溶液、およびこの技術を使用して最小限の溶解を引き起こし、初期胚の発育に影響を及ぼさないことを示しています。

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プロトコル

1.マイクロピペット生産

  1. インジェクションマイクロピペット
    1. ホウケイ酸ガラスキャピラリー（：1.0ミリメートル、内径（ID）：外径（OD）0.75ミリメートル）を配置（左右キャピラリーホルダーの中央に）マイクロピペットプラーでは、それをロックします。
    2. それは長いタッパーと細い先端になるようにガラスキャピラリーを引っ張って適切なプログラムを使用してください。 （例：熱：825;プル：30;速度：120;時間：200;圧力：500）。
    3. 慎重にデバイスからプルピペットを削除して、水平位置にマイクロフォージの上に置きます。
    4. 焦点にそのガラスビーズと引っ張らピペットおよびマイクロフォージヒーターフィラメントを持参してください。所望の厚さを測定し、ヒーターフィラメントが目標内径（5ミクロン）まで水平にピペットを移動するために接眼レンズのレチクルを使用してください。
    5. 約45％に熱を調整し、それがフィラメントに触れるようにそっとピペットをもたらします。簡単にヒーターをアクティブにします。このワット病気少しそれがフィラメントに付着するように、ピペットを溶融し、冷却時に、ピペットは、ストレートカットを生成する接触点で壊れます。
      注：適切な温度を設定すると、ピペット曲げを行いますので、ストレートカットができなくなりますし、温度が低すぎるピペット（ 図1A）を溶融するのに十分ではない、あまりにも高温以来、この段階で鍵となります。
    6. ヒーターフィラメントから約10μm離れて、それを配置することにより、ピペットチップの近くに約30°の角度を作ります。 60％まで温度を設定し、ヒーターを作動させます。
      注：これはフィラメントの上にピペットを曲げます。この角度は、インジェクタ（ 図1B）に取り付けられたときに、針の先端が注入板の面と平行になるように求められています。
    7. 彼らは非常に鋭く、壊れやすいよう慎重にマイクロインジェクションピペットを扱います。
  2. ホールディングマイクロピペット
    1. borosilicを配置（左右のキャピラリーホルダーの中央に）マイクロピペットプラーで、それをロックガラスキャピラリー（0.75ミリメートル：1.0ミリメートル、ID OD）を食べました。
    2. （200;プル815：20;速度：140;：：;時間圧力175：ヒート例）、それは長くても先細りと平行な壁の薄い先端になるようにガラスキャピラリーを引っ張って適切なプログラムを使用してください。
    3. 慎重プラー装置から引き出さピペットを削除して、水平位置にマイクロフォージホルダーの上に置きます。ヒーターフィラメントとピペットにフォーカスを調整します。
    4. ピペットの直径を測定し、フィラメントの上に、その直径は180μmでになるまでピペットを移動するために接眼レンズのレチクルを使用してください。
    5. 指示されたサイズで、ダイヤモンドチップペンでガラスキャピラリーをマークしてから、そっとガラスを破るために引っ張っ先端に押してください。これは、ストレートカット（ 図1C）をもたらすはずです。
    6. フィラメントに近いその先端が垂直位置にピペットを移動します。温度を設定 60％のマイクロフォージの。
    7. ファイアーポリッシュそれが40μmのIDに到達するまでの標準的な技術7を使用してピペットの先端。 ID（ 図1D）を確認するために接眼レンズのレチクルを使用してください。
    8. ピペットの角度を作ります。
      1. 約10μm離れたフィラメントと離れてその先端から5mmから戻って水平位置にピペットを持参してください。約60％に温度を設定し、フィラメントの上にピペットを曲げるためにヒーターを作動させます。 （約30 Oの）所望の角度に達するまで加熱を続けます。視覚角度（ 図1E）を確認してください。
        注：ピペットは、通常、注射皿の底部に対して60 Oのおおよその角度でマイクロインジェクターに取り付けられています。それは、その中間面における胚の正確な注入に必要な皿の底に平行になるようにピペットの先端が折り曲げられています。
ル "> 2。マイクロマニピュレータのセットアップ

  1. microinjectorsが完全に油がロードされていることを、システム内に気泡が存在しないこと（マイクロインジェクター内の気泡が注射の細かな制御を防ぐ）を確認してください。
  2. マイクロマニピュレーターは、中心位置にあることを確認してください。これは、ピペットの動きの広い範囲を可能にします。
  3. 右顕微ホルダーに左マイクロマニピュレーターホルダーとインジェクションピペットにホールディングピペットを挿入します。
  4. 油が毛細管現象によりピペットに入ると、システムはマイクロインジェクターのコントロールを使用してピペットの内側に上下に油を移動させることにより、正常に動作していることを確認することができます。
    注意：針内のオイルの動きがない場合は、詰まりがあるかもしれません。この場合、新しい針を使用しています。
  5. ビューの顕微鏡の視野の中心にピペットをもたらすためにマイクロマニピュレーターコントロールを使用します。 4Xの倍率を使用して、マイクロピペットの先端が正しい角度（Pであることを確認してください皿の底にarallel）。
    注意：針の正しいセットアップが成功した注射のため、結果の一貫性のためのキーです。
  6. メーカーのキャリブレーション・マニュアルに従ってレーザーシステムのキャリブレーションを行います。

注射皿の調製（図2）

  1. 100ミリメートルのペトリ皿の蓋の中央に20％ウシ胎児血清（FBS）を補充温め（37℃）SOF-HEPES（材料セクションの詳細構成）の50μlのドロップを置きます。噴射ドロップの近くに注入される溶液2μlのドロップ - 1を配置します。胚はRT下に冷却しないことを確認してください。
    注：このプロトコルでは、注射部位を可視化し、後でそれを追跡することができるように注入溶液にデキストラン - レッド染料を追加します。
  2. 鉱物油の約10 mlで用いて射出プレートの低下をカバーします。
  3. 倒立顕微鏡のステージ上に注入皿を置き、ピップをもたらします注射ドロップにettes。針がドロップ内部焦点になっていることを確認してください。マイクロマニピュレーターコントロールを使用して、必要に応じてその高さを調整します。
  4. 噴射ドロップの上側に - （20時間後に受精（HPF）17）30接合体 - マイクロディスペンサーを用いて、約20をロードします。注射降下の胚の数は、人はそれらを注入することができる速度によって決定されるように室温で注入を実行します。 30分で注入することができるものよりも多くの胚をロードしないでください。
    1. マイクロディスペンサへの胚をロードするには、完全にプランジャーを押し下げると胚を含む溶液に先端を浸します。胚が（一度に1つずつ）ガラスキャピラリーの先端でピックアップされるタッチすると、ゆっくりと各胚がキャピラリーに入るように、プランジャーを解放します。すべての胚がピックアップされているか、マイクロディスペンサの容量がいっぱいになるまでこれを繰り返します。
    2. 、ロードされた胚を解放し、ボリューム全体の共同まで静かにプランジャーを押し下げるために、胚をntainingは毛細血管から解放されます。

4.マイクロインジェクション

  1. 4X対物レンズを使用して、負圧（吸引）を適用することによって、注入ピペット内に注入される溶液を読み込みます。 3接合体 - 2を注入するのに十分なソリューションをロードします。そして、射出ドロップに移動します。
  2. 先端が受精卵に近づくように、注射ドロップ内では、保持ピペットを移動します。接合体は、保持ピペットに固定され、20X対物レンズに変更されますので、保持マイクロインジェクターで負圧（吸引）を適用します。
  3. 受精卵をホールディングピペットに装着された後、静かにそれを取り外すことなく、周りの胚を移動するために注入ピペットを用いてその品質を確認してください。良質な受精卵は2極体（時には唯一の1が見られますが）、均質な細胞質を持っている必要があります。異常な接合体（ 図3A）を注入しないでください。
  4. 必要であれば、適切な注射用の胚を再配置ロケーション。良いポジショニングとは、ZPとPMの間にいくつかのスペースがあるので、PMは、レーザーによって損傷されないということでしょう。
  5. インジェクションピペットを穏やかに注射部位に受精卵をタッチすることにより、胚のミッドプレーン上に配置されていることを確認してください。それは、その中央平面上にない場合、針が胚ではなく、穿刺回転させる傾向があります。必要に応じてインジェクションピペットの高さを調整します。
  6. レーザー（ 図3B）を使用して、ZPに穴を作ります。
    1. レーザーのソフトウェア場所穴（胚は、ホールディングピペットに装着されている場所の反対側に）行われますZPにおけるレーザーレチクルを使用。発射ボタン上のレーザ制御ウィンドウのクリックを使用しました。穴の大きさはPM損傷させずに通過する針のためのZPに開口部を作成するのに十分な大きさであることを確認します（例：0.662ミリ秒パルス幅/ 6.9μmの穴の大きさ）。
  7. 注射針を渡しますZPの穴に通し、PMと接触します。針は胚（ 図3C）への道の3/4になるまで前方にピペットを押し続けます。
  8. これは一貫して注入量を制御するために使用されるように、溶液を油相間でのメニスカスの位置を観察します。
  9. PMと細胞質が注射針に吸引されることになりインジェクションピペット、上の負圧（吸引）を適用します。針への質の動きが加速または注射液と取り違え、細胞質の内容を見ることができるときまで継続します。これらは、PM（ 図3D）の破損を示します。
  10. ソリューション油相間でのメニスカスが出発点過去1受精卵の直径相当を進んでいるまで、正圧（注入）を適用することにより、接合体の細胞質への溶液、続いて細胞質コンテンツをバック注入します。
    注意：私たちの条件の下では、このrepresents注入した溶液（ 図3E）の約7 plの。
  11. 4X目的に変更し、噴射ドロップの下側に/ sの注入された胚を移動します。保持マイクロインジェクターに正の圧力を加えることによって胚をリリース。注入/非注入胚を追跡し、効率的に作業を助けるために、上側の非注入胚とドロップの下側に注入されたものを保管してください。

5.胚の回復と注入結果

  1. 予熱したSOF-HEPESで新しい皿に約200μlの3滴を加えます。 （上記のように）マイクロディスペンサーを用いて注入された胚を収集します。 SOF-HEPESが低下3を介してそれらを移動することにより、注入された胚を洗います。
  2. マイクロインジェクション中に溶解した胚をカウントし、それらを捨てます。
    第1は、全体ZPを記入し、半透明表示されますので、溶解した接合体が無傷の1から容易に区別することができる、そしてそれは通常、細胞質を持っています注意してください胚の外部に漏れるコンテンツ。
  3. 必要に応じて、蛍光顕微鏡を用いて、マイクロインジェクション効率を確認してください。紫外線曝露がその後の発展に影響を与えることができる胚の損傷を引き起こすことがあるので注意してください。
  4. 38.5℃で鉱物油の下で4 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）を補充したカリウムシンプレックス最適化培地の50μlの液滴（KSOM）25注入胚の培養基、飽和5％の空気中のCO 2、湿度。
  5. 2日目の注射後、5％FBSを含む培地を補います。
  6. 注射の7日後に胚盤胞（BL）料金をチェック。胚盤胞の胚/そのドロップで培養した胚の合計数の総数としてBL率を計算します。

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結果

レーザーアシスト細胞質マイクロインジェクションは、家畜の接合体の細胞質にソリューションを提供する、強力で信頼性の高いプロトコルである。 図3は、接合体の概要前と注射後だけでなく、技術の全体的な概要を示しています。デキストラン赤注射および注入効率と精度の追跡サイトを可能にするために溶液を注入するように使用されます。溶液の成功した送達は、色素が均一細胞質に分布している最近注入胚を示す。図4に示されています。この技術を用いて胚の100％が、それらの細胞質に注入されます。

このプロトコルは、ウシやヒツジ接合体で最小の溶解速度を有することが示されました。注入された胚の唯一の15.6±5および5.8±3.9％は、マイクロインジェクションの結果として、それぞれ、牛や羊に溶解しました（図5）。 図6に示すように、また、ウシ（32.8±6.6％制御...

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ディスカッション

接合体のマイクロインジェクションは、哺乳動物の胚にソリューションを導入するための十分に確立された方法です。種および実験の目的に応じていくつかのバリエーションでは、この技術は、広く使用することができます。私たちは、平滑末端マイクロピペットの入り口を支援するためにレーザーを使用して細胞質内マイクロインジェクションを実行する方法を示しています。 （例えばウシ、ヒツジ、およびブタなど）いくつかの家畜種の接合体は、胚の内部に一度注入ピペットの可視化を妨げ、暗い細胞質を持っています。また、それらの形質膜は、非常に弾性で達成することは難しい（通常はげっ歯類の接合体を注入するために使用）面取りスパイク針で自分の浸透を作ります。これらの制限を克服するために、我々は、原形質膜および胚の細胞質内の溶液の放出の破損を確実にするために、透明帯と細胞質の内容の後続の吸引を介して平滑末端針の通過を可能にするためにレーザを使用します。また、injectiによって針の入り口の反対側のサイトでngの（約3/4胚の内部）我々はPNを置換し、従って、それらの吸引/注入を回避することを目指しています。さらに、このは、このように低い溶解速度が得られ、癒すために壊れた膜のための接触...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この技術に関連する作業は、NIH/NICHD RO1 HD070044およびUSDA/NIFA HatchプロジェクトW-3171およびW-2112によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マイクロピペットプーラーサッターインスツルメントP-97
ガラスキャピラリーサッターインスツルメントB100-75-10これらのキャピラリーは、ピペットの保持と注入に使用されます。フィラメントのない厚肉/標準壁のホウケイ酸チューブであれば、どれでも使用できます。
MicroforgeNarishigeMF-910倍倍レンズ搭載。
マイクロマニピュレーターニコン/成重NT88-V3
倒立顕微鏡ニコンTE2000-U4倍、20倍、レーザーシステムを搭載。
レーザー研究機器7-47-500土星5号 アクティブレーザー。
マイクロディスペンサードラモンド3-000-105マイクロディスペンサーは、胚を移動させるために使用されます。p10ピペットも使用できますが、負荷はできるだけ少なくなります。
100 x 15 mm 培養皿ファルコン351029皿の蓋を使用して注入プレートを作ると、壁が低くなり、マイクロマニピュレーターの位置決めと移動が容易になります。60mmの培養皿の蓋も使用できます。
35 mm培養皿コーニング430165これらの皿は、50 μl滴は鉱物油で覆われています。あるいは、4ウェルディッシュも使用できます。胚を培養するために選択した皿に関係なく、胚を培養する前に、常にインキュベーター内で少なくとも4時間平衡化する必要があります。
インキュベーター三洋電MCO-19AIC38.5°Cに設定できるインキュベーター。C、5%CO2条件が使用可能です。
実体顕微鏡ニコンSMZ800培養液滴中の胚の可視化や洗浄に使用されます。倍率10倍の実体顕微鏡であれば、どれでも使用できます。
コントロールユニットHTミニチューブ12055/0400実体顕微鏡に取り付けられた加熱システム。
加熱顕微鏡ステージミニチューブ12055/0003実体顕微鏡に取り付けられた加熱システム。
デキストランレッドThermo ScientificD1828滅菌済みの10 mg/ml溶液を使用して注入します。
ミネラルオイルシグマM8410ミネラルオイルを室温に保ち、ホイル紙を使用して光から保護します。
KSOMaa Evolve BovineZenitZEBV-100mg/ml BSAを添加。胚培養用のKSOMプレートは、使用前に少なくとも4時間インキュベーターで平衡化する必要があります。
FBSGemini-Bio100-525幹細胞認定のFBSを使用してください。
受精卵受精卵は17〜20 hpfで注入され、in-vitro-またはin-vivo-誘導することができます。
NaClSigmaS5886最終濃度:107.7 mMSOF-HEPES培地の成分。
KClSigmaP5405最終濃度:7.16 mMSOF-HEPES培地の成分。
KH2PO4SigmaP5655最終濃度:1.19 mM。SOF-HEPES培地の成分。
MgCl2 6H2OSigmaM2393最終濃度:0.49 mM。SOF-HEPES培地の成分。
DL-乳酸ナトリウムΣL4263最終濃度:5.3 mM。SOF-HEPES培地の成分。
CaCl<サブ>2-2H<サブ>2O シグマC7902最終濃度:1.71 mMSOF-HEPES培地の成分。
D-(&マイナス;)-フルクトース シグマF3510最終濃度:0.5 mM。SOF-HEPES培地の成分。
HEPES シグマH4034最終濃度:21 mM。SOF-HEPES培地の成分。
MEM-NEAASigmaM7145最終濃度:1x. SOF-HEPES培地の成分。
BME-EAASigmaB6766最終濃度:1x. SOF-HEPES媒体の成分。
NaHCO3SigmaS5761最終濃度:4 mMSOF-HEPES培地の成分。
ピルビン酸ナトリウムΣP4562最終濃度:0.33 mM。SOF-HEPES培地の成分。
GlutamaxGibco35050最終濃度:1 mM。SOF-HEPES培地の成分。
BSASigmaA-3311最終濃度:1 mg/ml. SOF-HEPES培地の成分。
ゲンタマイシンSigmaG-1397最終濃度: 5 μg / mlです。SOF-HEPES培地の成分。
胚移植用水SigmaW1503SOF-HEPES培地の成分。
SOF-HEPES培地ラボpH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs.フィルターは22μを介して滅菌されました。mフィルターは冷蔵庫に4°Cで保管できます。Cは1ヶ月間。37°Cで暖かい。使用前のCウォーターバス。
機 4 で製造

参考文献

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