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Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

1細胞胚の細胞質マイクロインジェクションは非常に強力な手法です。これは、例えば、遺伝子機能を研究するために、または遺伝子編集動物を生成するために遺伝子ノックアウトを生成するために胚に任意の溶液を送達するために使用することができます。ほとんどの農学関連の農場の動物の接合体は、それらの細胞質が不透明と¹ダークになり、非常に高い脂肪酸組成を有します。彼らはまた、かなり弾性原形質膜（PM）を有します。これらの特性は、挑戦的で、しばしば不正確なげっ歯類で使用されるような従来の前核/細胞質の注入を使用して、マイクロインジェクションを行います。

実行が容易であり、また、より高い生存率を²で、その結果、注入された胚にはあまりダメージを引き起こすため、細胞質マイクロインジェクションは、前核マイクロインジェクションを超える利点を有しています。このプロトコルの全体的な目標は、農場の動物の接合体の細胞質にソリューションを提供するための成功した方法を実証することです。実行できるようにするには家畜の胚に高い効率で細胞質マイクロインジェクション、レーザは透明帯（ZP）に穴を生成するために使用され、その後、平滑末端ガラス針をマイクロインジェクションのために使用されます。この戦略は、注入中の胚に刻印機械的損傷を軽減することを目指しています。その後、注射針の内側の細胞質内容物の吸引は、溶液は、胚の細胞質に送達されることを確実にPMを効率的かつ自信を持って破損することができます。

この技術はすでに正常接合体の細胞質^3,4へのsiRNAを送達するようにし、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）/ CRISPR関連するシステム9（Cas9）システム^5を用いて^、突然変異を生成するために、ウシの胚で使用されてきました。また、ウシ卵丘に囲まれた卵母細胞^6を注入する（若干修正済み）が適しています。ここでは、色素を提供我々の注入プロトコルを説明し、それは任意のDESの注入に適用することができますIRED接合子への溶液、およびこの技術を使用して最小限の溶解を引き起こし、初期胚の発育に影響を及ぼさないことを示しています。

Protocol

1.マイクロピペット生産インジェクションマイクロピペットホウケイ酸ガラスキャピラリー（：1.0ミリメートル、内径（ID）：外径（OD）0.75ミリメートル）を配置（左右キャピラリーホルダーの中央に）マイクロピペットプラーでは、それをロックします。 それは長いタッパーと細い先端になるようにガラスキャピラリーを引っ張って適切なプログラムを使用してください。 （例：熱：825;プル：30;速度：120;時間：200;圧力：500）。 慎重にデバイスからプルピペットを削除して、水平位置にマイクロフォージの上に置きます。 焦点にそのガラスビーズと引っ張らピペットおよびマイクロフォージヒーターフィラメントを持参してください。所望の厚さを測定し、ヒーターフィラメントが目標内径（5ミクロン）まで水平にピペットを移動するために接眼レンズのレチクルを使用してください。 約45％に熱を調整し、それがフィラメントに触れるようにそっとピペットをもたらします。簡単にヒーターをアクティブにします。このワット病気少しそれがフィラメントに付着するように、ピペットを溶融し、冷却時に、ピペットは、ストレートカットを生成する接触点で壊れます。 注：適切な温度を設定すると、ピペット曲げを行いますので、ストレートカットができなくなりますし、温度が低すぎるピペット（ 図1A）を溶融するのに十分ではない、あまりにも高温以来、この段階で鍵となります。 ヒーターフィラメントから約10μm離れて、それを配置することにより、ピペットチップの近くに約30°の角度を作ります。 60％まで温度を設定し、ヒーターを作動させます。 注：これはフィラメントの上にピペットを曲げます。この角度は、インジェクタ（ 図1B）に取り付けられたときに、針の先端が注入板の面と平行になるように求められています。 彼らは非常に鋭く、壊れやすいよう慎重にマイクロインジェクションピペットを扱います。 ホールディングマイクロピペット borosilicを配置（左右のキャピラリーホルダーの中央に）マイクロピペットプラーで、それをロックガラスキャピラリー（0.75ミリメートル：1.0ミリメートル、ID OD）を食べました。 （200;プル815：20;速度：140;：：;時間圧力175：ヒート例）、それは長くても先細りと平行な壁の薄い先端になるようにガラスキャピラリーを引っ張って適切なプログラムを使用してください。 慎重プラー装置から引き出さピペットを削除して、水平位置にマイクロフォージホルダーの上に置きます。ヒーターフィラメントとピペットにフォーカスを調整します。 ピペットの直径を測定し、フィラメントの上に、その直径は180μmでになるまでピペットを移動するために接眼レンズのレチクルを使用してください。 指示されたサイズで、ダイヤモンドチップペンでガラスキャピラリーをマークしてから、そっとガラスを破るために引っ張っ先端に押してください。これは、ストレートカット（ 図1C）をもたらすはずです。 フィラメントに近いその先端が垂直位置にピペットを移動します。温度を設定 60％のマイクロフォージの。 ファイアーポリッシュそれが40μmのIDに到達するまでの標準的な技術7を使用してピペットの先端。 ID（ 図1D）を確認するために接眼レンズのレチクルを使用してください。 ピペットの角度を作ります。 約10μm離れたフィラメントと離れてその先端から5mmから戻って水平位置にピペットを持参してください。約60％に温度を設定し、フィラメントの上にピペットを曲げるためにヒーターを作動させます。 （約30 Oの）所望の角度に達するまで加熱を続けます。視覚角度（ 図1E）を確認してください。 注：ピペットは、通常、注射皿の底部に対して60 Oのおおよその角度でマイクロインジェクターに取り付けられています。それは、その中間面における胚の正確な注入に必要な皿の底に平行になるようにピペットの先端が折り曲げられています。 ル "> 2。マイクロマニピュレータのセットアップ microinjectorsが完全に油がロードされていることを、システム内に気泡が存在しないこと（マイクロインジェクター内の気泡が注射の細かな制御を防ぐ）を確認してください。 マイクロマニピュレーターは、中心位置にあることを確認してください。これは、ピペットの動きの広い範囲を可能にします。 右顕微ホルダーに左マイクロマニピュレーターホルダーとインジェクションピペットにホールディングピペットを挿入します。 油が毛細管現象によりピペットに入ると、システムはマイクロインジェクターのコントロールを使用してピペットの内側に上下に油を移動させることにより、正常に動作していることを確認することができます。 注意：針内のオイルの動きがない場合は、詰まりがあるかもしれません。この場合、新しい針を使用しています。 ビューの顕微鏡の視野の中心にピペットをもたらすためにマイクロマニピュレーターコントロールを使用します。 4Xの倍率を使用して、マイクロピペットの先端が正しい角度（Pであることを確認してください皿の底にarallel）。 注意：針の正しいセットアップが成功した注射のため、結果の一貫性のためのキーです。 メーカーのキャリブレーション・マニュアルに従ってレーザーシステムのキャリブレーションを行います。 注射皿の調製（図2） 100ミリメートルのペトリ皿の蓋の中央に20％ウシ胎児血清（FBS）を補充温め（37℃）SOF-HEPES（材料セクションの詳細構成）の50μlのドロップを置きます。噴射ドロップの近くに注入される溶液2μlのドロップ – 1を配置します。胚はRT下に冷却しないことを確認してください。 注：このプロトコルでは、注射部位を可視化し、後でそれを追跡することができるように注入溶液にデキストラン – レッド染料を追加します。 鉱物油の約10 mlで用いて射出プレートの低下をカバーします。 倒立顕微鏡のステージ上に注入皿を置き、ピップをもたらします注射ドロップにettes。針がドロップ内部焦点になっていることを確認してください。マイクロマニピュレーターコントロールを使用して、必要に応じてその高さを調整します。 噴射ドロップの上側に – （20時間後に受精（HPF）17）30接合体 – マイクロディスペンサーを用いて、約20をロードします。注射降下の胚の数は、人はそれらを注入することができる速度によって決定されるように室温で注入を実行します。 30分で注入することができるものよりも多くの胚をロードしないでください。 マイクロディスペンサへの胚をロードするには、完全にプランジャーを押し下げると胚を含む溶液に先端を浸します。胚が（一度に1つずつ）ガラスキャピラリーの先端でピックアップされるタッチすると、ゆっくりと各胚がキャピラリーに入るように、プランジャーを解放します。すべての胚がピックアップされているか、マイクロディスペンサの容量がいっぱいになるまでこれを繰り返します。 、ロードされた胚を解放し、ボリューム全体の共同まで静かにプランジャーを押し下げるために、胚をntainingは毛細血管から解放されます。 4.マイクロインジェクション 4X対物レンズを使用して、負圧（吸引）を適用することによって、注入ピペット内に注入される溶液を読み込みます。 3接合体 – 2を注入するのに十分なソリューションをロードします。そして、射出ドロップに移動します。 先端が受精卵に近づくように、注射ドロップ内では、保持ピペットを移動します。接合体は、保持ピペットに固定され、20X対物レンズに変更されますので、保持マイクロインジェクターで負圧（吸引）を適用します。 受精卵をホールディングピペットに装着された後、静かにそれを取り外すことなく、周りの胚を移動するために注入ピペットを用いてその品質を確認してください。良質な受精卵は2極体（時には唯一の1が見られますが）、均質な細胞質を持っている必要があります。異常な接合体（ 図3A）を注入しないでください。 必要であれば、適切な注射用の胚を再配置ロケーション。良いポジショニングとは、ZPとPMの間にいくつかのスペースがあるので、PMは、レーザーによって損傷されないということでしょう。 インジェクションピペットを穏やかに注射部位に受精卵をタッチすることにより、胚のミッドプレーン上に配置されていることを確認してください。それは、その中央平面上にない場合、針が胚ではなく、穿刺回転させる傾向があります。必要に応じてインジェクションピペットの高さを調整します。 レーザー（ 図3B）を使用して、ZPに穴を作ります。 レーザーのソフトウェア場所穴（胚は、ホールディングピペットに装着されている場所の反対側に）行われますZPにおけるレーザーレチクルを使用。発射ボタン上のレーザ制御ウィンドウのクリックを使用しました。穴の大きさはPM損傷させずに通過する針のためのZPに開口部を作成するのに十分な大きさであることを確認します（例：0.662ミリ秒パルス幅/ 6.9μmの穴の大きさ）。 注射針を渡しますZPの穴に通し、PMと接触します。針は胚（ 図3C）への道の3/4になるまで前方にピペットを押し続けます。 これは一貫して注入量を制御するために使用されるように、溶液を油相間でのメニスカスの位置を観察します。 PMと細胞質が注射針に吸引されることになりインジェクションピペット、上の負圧（吸引）を適用します。針への質の動きが加速または注射液と取り違え、細胞質の内容を見ることができるときまで継続します。これらは、PM（ 図3D）の破損を示します。 ソリューション油相間でのメニスカスが出発点過去1受精卵の直径相当を進んでいるまで、正圧（注入）を適用することにより、接合体の細胞質への溶液、続いて細胞質コンテンツをバック注入します。 注意：私たちの条件の下では、このrepresents注入した溶液（ 図3E）の約7 plの。 4X目的に変更し、噴射ドロップの下側に/ sの注入された胚を移動します。保持マイクロインジェクターに正の圧力を加えることによって胚をリリース。注入/非注入胚を追跡し、効率的に作業を助けるために、上側の非注入胚とドロップの下側に注入されたものを保管してください。 5.胚の回復と注入結果予熱したSOF-HEPESで新しい皿に約200μlの3滴を加えます。 （上記のように）マイクロディスペンサーを用いて注入された胚を収集します。 SOF-HEPESが低下3を介してそれらを移動することにより、注入された胚を洗います。 マイクロインジェクション中に溶解した胚をカウントし、それらを捨てます。 第1は、全体ZPを記入し、半透明表示されますので、溶解した接合体が無傷の1から容易に区別することができる、そしてそれは通常、細胞質を持っています注意してください胚の外部に漏れるコンテンツ。 必要に応じて、蛍光顕微鏡を用いて、マイクロインジェクション効率を確認してください。紫外線曝露がその後の発展に影響を与えることができる胚の損傷を引き起こすことがあるので注意してください。 38.5℃で鉱物油の下で4 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）を補充したカリウムシンプレックス最適化培地の50μlの液滴（KSOM）25注入胚の培養基、飽和5％の空気中のCO 2、湿度。 2日目の注射後、5％FBSを含む培地を補います。 注射の7日後に胚盤胞（BL）料金をチェック。胚盤胞の胚/そのドロップで培養した胚の合計数の総数としてBL率を計算します。

Representative Results

レーザーアシスト細胞質マイクロインジェクションは、家畜の接合体の細胞質にソリューションを提供する、強力で信頼性の高いプロトコルである。 図3は、接合体の概要前と注射後だけでなく、技術の全体的な概要を示しています。デキストラン赤注射および注入効率と精度の追跡サイトを可能にするために溶液を注入するように使用されます。溶液の…

Discussion

接合体のマイクロインジェクションは、哺乳動物の胚にソリューションを導入するための十分に確立された方法です。種および実験の目的に応じていくつかのバリエーションでは、この技術は、広く使用することができます。私たちは、平滑末端マイクロピペットの入り口を支援するためにレーザーを使用して細胞質内マイクロインジェクションを実行する方法を示しています。 （例えばウ…

Materials

Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Inverted microscope	Nikon	TE2000-U	Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
60mm culture dish	Corning	430166	Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier.
35mm culture dish	Corning	430165	These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800	Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage	Minitube	12055/0003	Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	A sterile 10mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil	sigma	M8410	Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes			Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl	Sigma	S5886	Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCL2 6H2O	Sigma	M2393	Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate	Sigma	L4263	Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate	Sigma	P4562	Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin	Sigma	G-1397	Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer	Sigma	W1503	Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Made in the lab		pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.