世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、チチュウカイミバエ

サマリー

地中海のショウジョウバエ(メドフライ)Ceratitis capitata(双翅目:Tephritidae)は、世界的な農業害虫です。その生物学をより深く理解することは、メドバエの個体数を制御し、経済的影響を減らすための鍵です。胚マイクロインジェクションは、この種の生殖細胞系の形質転換と逆遺伝学研究の両方を可能にする基本的なツールです。

要約

地中海ミバエ（チチュウカイミバエ）Ceratitis capitata（ヴィーデマン）（双翅目：ミバエ科）は非常に高い農業関連性を持つ害虫種です。これは、その生殖行動に起因している：彼らはパルプに卵や孵化した幼虫のフィードを置くとき、女性は果物や野菜の外表面に損傷を与えます。ワイルドC. capitata集団は、伝統的に噴霧および/または環境に優しいアプローチは、最も成功したが、無菌昆虫技術（SIT）である殺虫剤を介して制御されています。 SITは交尾する能力を保持するが、肥沃な子孫を生成することができません男性の大量飼育、放射線ベースの殺菌・フィールドリリースに依存しています。出現およびバイオテクノロジーのツールのその後の急速な発展は、一緒にチチュウカイミバエゲノム配列の可用性と、大幅にこの種の生物学の我々の理解を後押ししています。これは、ゲノム操作のための新しい戦略の増殖を支持しているCAnは集団制御に適用します。

この文脈では、胚のマイクロインジェクションは、チチュウカイミバエ制御のためのツールボックスの拡大に二重の役割を果たしています。キー生物学的プロセスを調節する遺伝子の機能を妨害する能力は、確かに、チチュウカイミバエ侵襲性の根底にある分子機構の理解を拡張します。さらに、生殖系列形質転換を達成する能力は、新規SIT設定将来フィールドアプリケーションについて試験することができる複数のトランスジェニック株の産生を促進します。実際、遺伝子操作は、例えば、フィールド内の滅菌男性パフォーマンスを監視するために使用することができる望ましい特性を付与するために使用することができ、またはそれは、初期の生命段階の致死をもたらすことができます。ここでは、これらの二つの主要な目標を達成するためにチチュウカイミバエ胚に核酸を顕微注入するための方法を記載します。

概要

地中海ミバエは（チチュウカイミバエ）Ceratitis capitataはコスモポリタン種広範囲に被害果物や栽培作物です。このような属BactroceraやAnastrephaに属するものなど、いくつかの害虫種を含み、ミバエ科のファミリーに属します。チチュウカイミバエは、このファミリーの最も研究の種であり、それは昆虫の侵略¹の研究のためだけでなく、害虫管理戦略^2を最適化^するためだけでなく、モデルとなっています。

チチュウカイミバエは野生と栽培植物^3,4の300以上の種を攻撃することができます多化の種です。損傷は大人と幼虫の両方によって引き起こされる：交配した雌は、微生物がそれらの商業的品質に影響を与えることができるように、産卵のために果物の表面に穴を開け、果肉上の幼虫フィード一方。 3幼虫期の後、幼虫は、ホストから出てくると土壌に蛹化。Ceratitiscapitataは、アフリカ、中東、西オーストラリア、中南米、欧州、米国⁵の領域を含む、ほぼ世界的な分布を表示します。

チチュウカイミバエ蔓延を制限するための最も一般的な戦略は、殺虫剤（ 例えば 、マラチオン、スピノサド）と環境に優しい滅菌昆虫技術^（SIT）6の使用を伴います。後者のアプローチは、電離放射線への暴露により無菌に男性の数十万の野生への放出を伴います。野生のメスのような滅菌男性の交配は、最終的に根絶につながる、人口規模の縮小を引き起こし、ノー子孫になります。 SITは、世界中の複数のキャンペーンに有効であることが証明されたが、その主な欠点がリリースされる昆虫の何百万人を飼育し、殺菌の高コストが含まれます。放出された個人のマーキング中にフィールドに入力された野生昆虫から無菌区別する必要があります活動を監視し、それが現在の蛍光粉を使用して達成されます。これらの手順は、高価であり、望ましくない副作用^7を持っています。

最適化するために、および/または、この害虫の制御のためのより効果的なアプローチを開発するためには、チチュウカイミバエ生物学と遺伝学は広く世界中で数多くの研究者によって検討されています。チチュウカイミバエゲノム配列^8,9の利用可能性は、遺伝子機能に関する新たな調査を容易にするであろう。 RNA干渉は、そのような研究のための強力なツールであり、それは、dsRNA（二本鎖RNA）又はsiRNA（低分子干渉RNA）の微量注入を介して達成することができます。この技術は、Cでその性別決意分子カスケードを実証するために、例えば、使用されていますcapitataは部分的にしかショウジョウバエ ¹⁰とに対して保存されています。

C.許可チチュウカイミバエ胚を顕微注入するためのプロトコルの開発最初の非すべきcapitata-Drosophilidフライ種は遺伝的に改変されます。その卵は、 ショウジョウバエと同様であり、両方の形態および乾燥¹¹への耐性の観点から、プレ胚盤葉の胚にプラスミドDNAを送達するためのプロトコルは、最初のDのために開発されたようにショウジョウバエ ^12,13 最初にCでの使用に適合しましたcapitata。これらの最初の実験は、転移因子ミノス¹¹に基づいて、チチュウカイミバエ生殖変換を可能にしました。その後、元のシステムは、他のトランスポゾンベースのアプローチを用いて^、14変更されました。これは、鱗翅目Trichoplusianiの ¹⁵からのpiggyBacの場合です。プロトコルは、以来、さらに最適化されており、これは他の多くの双翅目^22-31の他tephritid種^16-21の変換とを可能にしました。人工欠陥transpo：すべてのこれらのシステムは、一般的なバイナリーベクター/ヘルパープラスミドの形質転換系の使用に依存します所望の遺伝子を含有する息子は、プラスミドDNAに組み込まとトランスポザーゼ酵素^32を供給^することにより、昆虫のゲノムに組み込まれています。トランスジェニックチチュウカイミバエ行数は、精度を高める可能性がある、致死性を誘発する条件優性致死遺伝子を有する株、株の雄のみの子孫を生成するため、追加の雌雄鑑別戦略を必要としない、蛍光精子で株を含む複数の機能で、生成されましたSITの監視段階^33-37の。トランスジェニック生物の野生でのリリースのみ^38,39蚊に対するパイロットテストで発生したが、少なくとも一つの会社は、フィールド⁴⁰での使用のためのトランスジェニックチチュウカイミバエ株の数を評価しています。

胚のマイクロインジェクションは、（CRを、このような転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピートなどの新しいゲノム編集ツールの開発に有利に働くことができますISPR）/ CRISPR関連タンパク質小説進化論と発達研究を可能にするだけでなく、利用可能なバイオテクノロジーのツールボックスを展開します9ヌクレアーゼ（Cas9）とホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子（HEGs）、。ゲノム編集アプローチはすでに蚊⁴¹における遺伝子ドライブシステムの生成を可能にし、チチュウカイミバエへの転送が目前に迫っています。ここでは、上記のすべてのアプリケーションに有用であることができるチチュウカイミバエ胚に核酸を微量注入のための普遍的なプロトコルを記述します。

プロトコル

1.実験の設定

1. 昆虫館の要件
   1. すべてのC.を維持25℃、湿度65％および12/12時間の明/暗の光でcapitataのライフステージ。
   2. 6 Lケージには約1,500〜2,000チチュウカイミバエ蛹を置きます。産卵^42を刺激するのに十分に小さい穴を有する一方の側に真鍮メッシュでケージを使用してください。毛細管現象により水でハエを提供するために、ケージのベースにある小さい開口部からスポンジ片を挿入します。大人（ 図1A）のための食料源として酵母と砂糖（1:10）の混合物を使用してください。酵母の量を増やします（最大1：砂糖：3、酵母）メスは卵を産むために失敗する必要があります。
   3. メッシュを通して堆積卵を収集するために、ケージの下に水で満たされたプレートを置きます。処女雌が産卵することができるようにハエがマイクロインジェクション実験のために卵を収集する前に、少なくとも6〜7日間経過するまで、待ちます。これは、女性が交尾しているであろうことを保証しますそして卵が受精されているであろうこと。
   4. 細かいネットストレーナーで水を濾過することによって卵を収集します。標準の幼虫の食（1.5 LH ₂ O、100ミリリットルを1％HClを含有するプラスチック製の箱にストレーナから卵を移す広域スペクトル抗菌剤は50ミリリットルのエタノールに溶解した5グラム、400グラムの砂糖、175グラムの脱イオンビール酵母、1パスツールピペットを使用して）軟質小麦ふすまをkgです。
   5. 空気の循環を可能にするために、ネット蓋を透明容器内の各ボックスを配置し、ふすまの層を含有する蛹化（ 図1B）を有利にします。
   6. 約10日後に、幼虫の食物から出てくると蛹化のためのふすま層に飛び降りる^第3齢幼虫を確認してください。
   7. 24時間後、柔らかいブラシを使用して、小さなカップに蛹を収集し、新しい大人のケージに転送します。大人は通常10日蛹化後に出現します。新興フライはptilinum、目の上にその頭の上に位置して膨らませてポケットを使用していますアンテナの電子ベースは、蛹殻の終わりを強制的にオフにします。出現した後、ptilinumは恒久的に頭の中に戻って崩壊します。
2. マイクロインジェクション幼虫のため1 Lの食品の調製
   1. 300ミリリットルのH ₂ Oに2.5グラム寒天を溶かし
   2. ホット撹拌プレート上のウォーム500ミリリットルのH ₂ Oおよび4グラム安息香酸ナトリウム、4.5ミリリットル37％HClを、42グラムの酵母エキスと115グラム脱水ニンジン粉末を溶解します。
   3. 混合物に10ミリリットルの無水エタノールに溶解した2.86グラム広域スペクトル抗菌剤の溶液を加えます。
   4. 15センチメートルラウンドペトリ皿に培地を配布し、放冷します。必要に応じて、4℃で保存します。
3. スライドの準備
   1. 顕微鏡スライド（75×26ミリメートル^2）に両面テープの2cmのストリップを置き、油スプレッドと注入された胚の結果としての乾燥を防ぐために、中国のマーカーでエッジをマークします。
4. 核酸の準備
   1. 市販のキット^34を用いてプラスミドDNAを単離します。エタノールを用いてプラスミドを沈殿させ、所望の濃度で注射用緩衝液（0.1 mMリン酸緩衝液pH 7.4、5ミリモルのKCl）中に再懸濁します。
   2. フェノール-クロロホルムを使用して、長いdsRNAを合成し、in vitroで精製、イソプロパノールを用いて沈殿させ、注入バッファ⁴³に再懸濁します。

2.胚の準備

1. 6-7日齢の成人を含むケージの下に水で満たされたトレイを置きます。
2. 女性は30分間産卵した後、細かいストレーナーを用いて水を濾過することによって胚を収集することを許可します。常に胚の乾燥を避けるために、水にストレーナを保ちます。
3. 商業50％の漂白剤溶液中に5秒間ストレーナを浸すことにより、胚をDechorionate。
4. 少なくとも、（繰り返しきれいな超純水にストレーナを浸すことにより、慎重に胚を洗います4-5回）。最後に、きれいな超純水にストレーナを配置します。最大2時間以内に胚を使用してください。
   注：マイクロインジェクションのタイミングは、前細胞化の核分裂の段階の間に、前胚盤葉の胚に注入する必要性に関連しています。これは、注入されたDNAを採取アップする核に、具体的に配偶子を発信します始原生殖細胞核の中にできます。チチュウカイミバエ細胞化に9と12時間^45,46との間で行われるのに対し、 ショウジョウバエでは、極細胞で細胞化は、胚盤葉の形成は、約30分後に^44を発生すると、（25℃）受精後約90分で開始します。
5. 行の胚の向き
   1. 細かい絵筆を使用して、約50の胚を収集し、水に浸した黒濾紙ディスク上に置きます。
   2. 解剖実体顕微鏡下では、両面テープの上面の上の行の胚を手配細かい絵筆（000）を使用して、顕微鏡スライド（ 図1C）。
      注：注射は生殖系列の始点となる後極で行われているように、すべて同じ向きで胚を合わせます。後極は卵門領域に対向します。
   3. 油は（1.3を参照）中国のマーカーの境界線上にこぼれないことを確認してクロロトリフルオロエチレン油の層で胚をカバーしています。
      注：油で胚をカバーする前に、更なるステップを行うことができる：胚は、その液体の含有量を減らすため、注入されたDNA溶液の侵入を容易にするために、数分間乾燥させることができます。これは、高い液体圧力の結果として、注射または注入溶液の過度の漏洩時​​の胚の破裂を回避するのに役立つことがあります。

3.胚のマイクロインジェクション

1. マイクロピペットを用いてプラスミドDNAまたはdsRNA溶液（1-2μgの/μl）を用いて、針（1-2μl）を入力します。
2. が噴射時間（0.5秒）を制御するマイクロインジェクション装​​置に針を接続し、圧力（800ヘクトパスカル）と背圧（150ヘクトパスカル）。
3. 針（ 図1D）の動きを制御するためにマイクロマニピュレーターを使用して、実体顕微鏡下でマイクロインジェクションを実行します。スライドを移動するために顕微鏡ステージを使用してください。
   1. スコープのステージ上にスライドを置きます。
   2. 胚（ 図1E）の後極に針の先端を挿入します。
   3. ペダルとマイクロインジェクションシステムを作動させることによって溶液を注入します。注入された液体は、胚のわずかな動きで、その結果、内部圧力の増加を誘導します。
   4. ペダルを離すとすぐに、しかし優しく、胚から針を取り除きます。
   5. 注射部位のほとんどの細胞質の漏れを確認します。
      注：原因マイクロインジェクションプロにDNA / dsRNAは/ siRNAおよび死亡率の潜在的な致死効果とを区別するために、自身cedure、対照実験を実施しなければなりません。これらは、逆遺伝学実験の場合には、緩衝液のみの注入を含む、または、緑色蛍光タンパク質（GFP）の二本鎖RNA（dsRNA-GFP）、またはsiRNAの由来。
4. 注射後25℃で胚をインキュベートします。

4.注入後の手順

1. 注入の2日後、実体顕微鏡下で孵化した幼虫（ 図1F）のためのスライドを確認してください。幼虫は、油に移動するが、できるだけ早く幼虫食品に転送する必要があることができます。このため、スライドを数回日をご確認ください。
2. 細かい絵筆（000）を使用して、静かにニンジンベースの幼虫食品に孵化した幼虫を移します。各ペトリ皿当たり200幼虫の最大値まで転送します。
3. 湿度65％（25℃）で幼虫をインキュベートします。空気交換を損なう、蓋が皿に固執しないことを確認してください。
4. 蓋をペトリ皿にしてください幼虫への空気の流れがまだあるように、ほとんど閉じました。過度の乾燥を避けるために、必要に応じて、毎日の料理をチェックし、蒸発を補うために水を追加します。
5. ネット蓋と蛹化を有利に働くふすまの層を含むことにより、閉じた透明容器にペトリ皿を置きます。ルーチン昆虫館飼育については、 ^第3齢幼虫の幼虫の食のうち、ジャンプとはふすまで蛹になります。
6. （これは世代0、G0）で蛹を収集し、大人の飼育およびスクリーニングのための小さなケージに配置します。リア標準幼虫食品に子孫。
7. 注入された個人は、通常、キメラあるとして生殖形質転換実験の場合には、次の世代（G1）で可能な形質転換された個人のために確認してください。転位事象は、確かに、生殖細胞系または細胞体のいずれかを形成する胚の合胞体、核のいずれかに発生した可能性があります。
   1. まもなく出現した後、CO _2を使用して、G1の個人を麻酔し、TRANSFをチェック落射蛍光実体顕微鏡下でのイベントをormation。緑色蛍光のために画面にEYFPフィルタ（。。;エム30分の535内線500/20）を使用しながら、; DsRedwideフィルタ（EMM 75分の605。。内線12分の546）を使用し、赤色蛍光の存在をスクリーニングするために、 。
   2. 異性の野生型大人と小さなケージに変換された個人を置き、新しい、最初はヘテロ接合、歪みを発信。

結果

ここでは、それぞれ、目的の遺伝子の機能解析に向け胚のマイクロインジェクションの二つのアプリケーション（ケース1）を報告し、およびトランスジェニック株の世代（ケース2）で。

胚へのdsRNAの送達は、遺伝子機能を解明します。

innexin-5遺伝子は、昆虫では、男性と女性の生殖腺^43,47,48に特異的に発現しているギャップジャンクションをコードしています。近縁種のために利用可能な情報に基づいて、dsRNAを誘発性遺伝子サイレンシングは、チチュウカイミバエ雌と雄の生殖系列の切除をもたらすことが期待されていました。 2400胚の総数は548幼虫が孵化しと216大人が（未発表データ）生き残っているから、2μgの/μlのdsRNAの混合物、を注射しました。成人の約75％で、精巣および卵巣は下-de...

ディスカッション

昆虫の胚中の核酸のマイクロインジェクションは、遺伝子機能の解析とバイオテクノロジーのアプリケーションの両方を容易に普遍的な技術です。

昆虫の種数の増加から、ゲノム配列の最近の刊行物は、まだ未知の機能の遺伝子の機能解析のためのツールのための緊急の必要性につながります。 RNA干渉は、分子機能⁴⁹と胚のマイクロインジェクションを推測するために最も貴重な方法の一つであることが証明されたこれらの研究を容易にします。

プラスミドDNAの注入は、トランスポザーゼ媒介遺伝子挿入を用いて、昆虫のゲノムを変更するために使用することができ、より最近では、ゲノム編集ツール（ 例えば、TALEN、CRISPR / Cas9、HEGs）。これらの技術はすでに撲滅にまたは野生個体群の交換ワットの両方を目指し、害虫制御プログラムのために使用される可能性があり、複数の昆虫種の菌株の開発を可能にしています修正された生物学的機能を備えたi番目の昆虫。このプロトコルでは、我々は、プラスミドDNAまたはdsRNAのいずれかでチ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 x 注入バッファー			0.1 mM リン酸バッファー pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA			Phenol-Chloroform 精製
標準幼虫食品			1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g Broad-spectrum Antimicrobial Agent used in Pharmaceutical Products Dissolved in 50 エタノールml、砂糖400g、脱塩ビール酵母175g、軟質小麦ふすま
ニンジン幼虫食品			2.5g寒天、安息香酸ナトリウム4g、4.5ml 37%HCl、酵母抽出物42g、にんじん粉末115g、2.86 g広域スペクトル抗菌剤、水から1 L
の成人食用			酵母抽出物と砂糖(1:10)
顕微鏡スライド	Sigma-Aldrich	Z692247
注射針	エッペンドルフ	5242956000
マイクロローダー	エッペンドルフ	5242956003
ダブルスライドテープ
Whatman 黒丸紙	Sigma-Aldrich	Z695505
漂白			希釈石 1:2 使用前に
絵筆 (000)
マイクロマニピュレーター	成重	MN-153
マイクロインジェクター	エッペンドルフ		フェムトジェット
アダルトケージ
クロロトリフルオロエチレンオイル	シグマアルドリッチ	H8898<
em>Ceratitis capitata< / em>			使用される株はISPRAです