神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

サマリー

我々は、高スループット、多重化を説明、およびプロテオミクス脳脊髄液（CSF）の臨床翻訳のための潜在的に開発されたアッセイをターゲットに。テストでは、このようなアポリポタンパク質Eバリアント（E2、E3およびE4）などの神経変性のための潜在的なマーカーおよびリスク要因を、定量、およびそれらの対立遺伝子の発現を測定することができます。

要約

多くの神経変性疾患は、まだ有効な治療を欠いています。これらの疾患を識別し、分類するための信頼性のあるバイオマーカーは、将来の新しい治療法の開発に重要になります。多くの場合、潜在的な新規バイオマーカーは、それらの開発と高コストの制限のために診療所にそれをしないでください。しかし、具体的に三連四重極質量分析計を用いて、液体クロマトグラフィー - タンデム/質量分析法（MRM LC-MS / MS）の多重反応モニタリングを用いて標的プロテオミクスは、迅速診断検査室に臨床翻訳のためのバイオマーカーを評価し、検証するために使用することができる1つの方法であります。伝統的に、このプラットフォームは、臨床検査室での小分子の測定に広く使用されてきたが、それはそれをELISA（酵素結合Immunosorに魅力的な代替を行い、タンパク質を分析するための電位であります曲がったアッセイ）メソッドをベース。我々は、Eアイソフォーム4（のApoE4）のアポリポタンパク質既知の危険因子の検出および定量を含む認知症の多重マーカーを測定するために使用できる方法ターゲットプロテオミクスここに記載しています。

翻訳のための適切なアッセイを行うためには、有効な高度に特異的かつコスト、迅速簡単になるように設計されています。これを達成するために、アッセイの開発におけるすべてのステップは、彼らがで分析されている個々のタンパク質や組織のために最適化されなければならない。この方法は、翻訳の対象とプロテオミクスMRMのLC-MS / MSを開発する様々なヒントやトリックなどの一般的なワークフローについて説明します。

メソッド開発は、検出のためのMSのキャリブレーションをトリプシンquantotypicペプチドのカスタム合成バージョンを使用して最適化した後、MSにおける分析の前にクロマトグラフ分離における内因性ペプチドの正確な同定を決定するために、CSFにスパイクされています。 absoluを達成するためにTE定量、短いアミノ酸配列タグを有するペプチドの安定同位体標識内部標準バージョンおよびトリプシン切断部位を含むが、アッセイに含まれています。

概要

アルツハイマー病などの神経変性疾患の成長への影響、レビー小体型認知症とパーキンソン病は、多くの国¹での社会経済的な課題となっています。識別し、疾患の初期段階で患者を分類し、任意の潜在的な新しい治療法を監視するためにするために使用することができる追加のバイオマーカーが必要とされています。この方法の全体的な目標は、神経変性の潜在的CSFマーカーの検証の合理化、経済的かつ迅速な方法のための一般的なパイプラインを作成することです。理論的根拠は、検出実験から複数の潜在的タン​​パク質バイオマーカーを評価するために容易に修正可能な方法としてターゲットプロテオミクスまたはペプチドのMRM LC-MS / MSを使用することです。これらは、さらに迅速なクロマトグラフィー分離（<10分）上で多重化して評価することができます。神経変性のバイオマーカーのためのこの多重画面の中で、我々は知られている認知症の危険因子のアポリポタンパク質アイソフォームE4（ApoE4のを）含まれているので、我々は、CAnはそれが別々の遺伝子型判定テスト²の必要性を排除することによって、同時にその発現状況とレベルを決定します。 LC MS / MSは、定期的に正確例えばELISAまたはラジオイムノアッセイ（RIA）などの他の方法を介して小分子を定量するための最適な方法として使用されています。タンパク質を分析するMS技術の使用におけるこのシフトは、免疫ベースの技術の問題を中心に駆動されました。これらは、クロス特異性、バッチバッチ変動に、限られた貯蔵寿命、および高いコストが含まれます。したがって、目標とプロテオミクスは、急速に、ウエスタンブロット法、RIAおよびELISAなどの抗体ベースの方法への成長の代替になってきています。しかし、1つのアッセイに多数のマーカーを多重化する能力は、免疫ベースの方法³に対するこの技術の主要な利点です。技術は、多くの組織に適用可能であり、プラズマ⁴及び尿^5,6を含む多くのプロテオミクス研究の検証戦略として使用されています。

テchniqueは、トリプル四重極質量分析計を使用してアクセスし、専門知識を持っている任意の研究室にも適用することができます。ペプチド設計は、オープンソースデータベースの利用拡大と比較的単純です。カスタムペプチド合成の競争市場は、それらをはるかに手頃な価格になります。重いペプチドは、しかし、高価であり、したがって、マーカーは、大規模に移動する前に、小さな集団で評価されるべきです。最も大きな病院は容易にターゲットプロテオミクスアッセイを実行するために適合させることができるトリプル四重極ベースのプラットフォームを有する、臨床診断設定で使用される技術のための成長可能性があります。日常的な診断の設定にそれを作る方法の一つのようなアプリケーションは、鎌状赤血球貧血⁷のための新生児の血液スポットスクリーニングへの最近のアプリケーションです。

プロトコル

注：ここで説明するプロトコル全体の概略Fi回線 グレ1に与えられている。この方法の開発のために使用されるすべての試料は黒字臨床診断サンプルがあり、ロンドンブルームズベリー倫理委員会から倫理的承認を持っています。

評価対象のCSF MRM LC-MS / MSアッセイ候補マーカーペプチドを作成するプロセス全体を示す図1の回路図は、タンパク質標的から選択されます。カスタム合成されたペプチドを使用することによって、標的LC-MS / MS多重法が作成されます。評価後、アッセイは、神経変性の潜在的なマーカーの有効性を評価するために使用することができます。

1.ペプチドの選択とデザイン

注：マーカーペプチドの基準は、それが一意でなければならないということです（ プロテオ 強い>）とタンパク質（quantotypic）の定量的な豊かさを表します。ペプチドが一意であるかどうかを判断するには、UNIPROTのウェブサイト（http://www.uniprot.org/blast/）の「爆発」検索ツールを使用することができます。

1. 標的タンパク質（マーカー）のリストを定義する、 すなわち 、アポE（ 表2参照）。
   注：マーカーは前のプロテオームプロファイリング実験⁸から同定された場合、そのデータセットから最良の応答を与えるペプチドを選択します。
2. この情報が利用できない場合、このようなMS-ダイジェストなどのソフトウェアツールを使用して、そのような標的タンパク質のインシリコトリプシン消化のように 、オープンソースのウェブサイトを使用しています。
3. トリプシンおよび翻訳後修飾を受けないペプチドを選択してください。
   注：この情報はUNIPROTサイトwww.uniprot.org上で確認することができます。 LC-MSサンプル調製中に化学修飾を受けやすいペプチドを避けてください。
<李>は選択されたペプチドのカスタム合成を注文してください。
注：マーカーペプチドは、カスタム様々な営利企業によって合成することができます。アポEの合計のApoEレベルを測定するために使用quantotypicペプチドはAATVGSLAGQPLQERであると決定されました。 E2とE4の変異体を決定するために使用されるプロテオタイピックペプチド配列は、それぞれ、位置158（RLAVYQAGARとCLAVYQAGAR）および112位（LGADMEDVCGRとLGADMEDVR）のために、トリプシンペプチドです。

標準的なペプチドの調製

注：最高の定量的な遷移を選択するために、マトリックス（CSF）の検出を最適化する必要があります。多重化されたペプチドを最適化する最も効率的な方法は、既知の濃度のペプチドのプールを作成することです。これらのプールは、方法開発および標準曲線のために使用することができます。

1. 1mg / mlのストックに（ペプチド詳細は表2に示されている）、合成ペプチドを再懸濁濃度は、命令を製造しています。デフォルトでは、命令が使用できない場合、50：50（v / v）のアセトニトリル（ACN）で再懸濁ペプチド/ H ₂ O
2. 低結合マイクロ遠心チューブに各ペプチドのストック濃度とプール千ピコモルからペプチドの1:10希釈液を調製します。スピードバックコンセントレータに-20℃での最終プールとストアをドライダウン。将来の使用のために複数のプールを準備します。
3. 低結合チューブに小分けし、CSFを100μl。凍結乾燥CSFを。
4. 10および1ピコモル/μlの濃度を得るために消化緩衝液（100mMのトリスHCl、pHが7.8、6 M尿素、2 Mチオ尿素、2％のASB14）でプールされた千ピコモルペプチドのアリコートを懸濁します。
5. 0、1、2、5、10および15 pMの濃度でのCSFの凍結乾燥した100μlのアリコートにプールされたペプチドをスパイク。 TRの消化効率の内部標準およびコントロールとして機能するように、このような酵母エノラーゼとして無傷の無関係なタンパク質の20 ngのを追加します。ypsin。
6. 20μlの最終量にバッファをダイジェストでCSFアリコートをトップ。渦。
7. （100mMのトリスHCl、pH7.8の1mlに30 mg）をジチオトレイトールの1.5μl加え、室温で1時間振ります。
8. ヨードアセトアミドの3μL（100 mMトリス塩酸、pHが7.8の1ミリリットル中に35 mg）を加え、暗所で45分間、室温で振ります。
9. ddH ₂ Oの165μLを加えます
10. 50mMの重炭酸アンモニウム緩衝液に再懸濁トリプシン溶液、pHが7.8を修正は0.1μg/μlのシーケンシンググレードの10μLを加えます。 37°CO / Nの水浴中でインキュベートし、サンプルを凍結することによって消化を停止します。ストアは分析する準備が整うまで-20℃で消化します。

MSペプチドの検出の3最適化

1. 適切なソフトウェア、 例えば、スカイライン⁹に、コピーし、ペプチドの配列を最適化することが貼り付けます。情報を取得するためにペプチド配列をクリック予想される前駆イオン質量及び生成物イオン。
2. さらには1ng / MS法の開発のためのmlの濃度になるように（セクション2.1を参照）ストック濃度からのペプチドを希釈します。
3. （ - 0.8ml /分、通常は0.1）と0 - 5％の衝突エネルギーを直接最適化された流速で質量分析計にペプチドを注入します。
4. 実験の多重荷電前駆イオン^8を同定するために、MSスペクトルを取得します。最も強度（doubly-または三重に荷電前駆体イオンをお勧めします）を与える前駆体イオン（のm / z）を選択します。
5. ペプチドを再注入し、衝突誘起解離（CID）によりペプチドを断片化するために衝突エネルギーを適用します。最高のフラグメンテーションパターン取得するコーンと衝突エネルギーを最適化（フラグメントイオンは単独で、または二重荷電、および親イオンよりも好ましくは大きなフラグメントイオンの質量を、お勧めします）。
6. 実験的に得られた遷移がインシリコで生成された遷移と一致していることを確認します</ em>の（ステップ3.1で説明したように）。前駆体イオンあたり少なくとも2最も強い遷移を使用して、MRMメソッドファイル内の遷移リストを保存します。最終アッセイでの確認のための定量化のための1と1：2の遷移が含まれます。
   注：一部のMSのメーカーは、自動化されたMRMまたはSRM分析最適化のための機能（ すなわち 、ウォーターズIntellistart）を持っています。 0.1％FAで70％ACN - 可能であれば、50で組み合わさ移動相を有するペプチドを注入します。

4. LC-MRMメソッド開発

注：トリプル四重極質量分析計に結合された超高速液体クロマトグラフィー（UPLC）システムにより、合成ペプチドの混合物を分析します。ソースがきれいであることを確認してください。溶媒Aは0.1％FAとのddH ₂ 0です。溶媒Bは、0.1％FAでACNです。

1. 同位相の前の列にC-18相（1.6μmの直径、90オングストロームの細孔、2.1ミリメートル×50ミリメートルの長さ）を充填し、添付UPLCカラムを備えたLC-MSシステムを使用してください。
2. 解凍CSFは、氷の上でダイジェスト10分間16000グラムで遠心分離し、300μlのガラスインサートバイアルに60μLを移すとC ^oを -20℃で背もたれを保存します
3. （グラデーションの設定については表1を参照のこと ）40％ACNの直線勾配- 10分1を使用して標準曲線の点から最高濃度を注入
4. 得られたクロマトグラムを開き、保持時間と、ステップ3で作成した全ての遷移を有するペプチドあたりの上部の2つの最も強い（定量的）の遷移を注意してください。
5. この情報に基づいて、ペプチドを測定するためのタイミングチャネルと（ステップ3.6で作成した）、10分間のMRM法を更新する（例えば、 図2を参照）。感度を維持するために、8より大きいピークあたりのポイントで各チャンネルを維持し、各ペプチドの少なくとも一つの移行のための0.01秒よりも長い時間が住みます。
6. MRM法の「溶剤遅れ 'を含む：最初のピークの溶出前に10秒まで最初に1つずつと、方法、最後のピーク溶出後20秒の終わりに別の。 MS法ファイル内のメソッドイベントで「溶媒遅延」を選択することでこれを行います。
7. 時限MRMメソッドを使用して標準曲線を実行し、直線性をチェックすることによって（ステップ3.6で生成された）遷移との干渉非特異的なピークが存在しないことを確認します。
8. ペプチドは、メソッドを介して非スパイクプールされた制御と疾患CSFを実行して、検出可能であるかどうかを確認します。
9. アッセイの検出限界未満であるペプチドを削除してください。

ダイナミックMRM MS法の図2の例。ペプチド遷移の時限チャネルが確立された保持時間に応じてグループ化することができます。選択マーカーペプチドがクロマトグラフィーカラムから溶出としてのMRMを有効化は時限様式に組み込まれる、TRAの数を最小限に抑えます時間にわたるnsitionsおよびアッセイの感度を向上させます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

内部標準の5.追加

注：以前に記載¹⁰のように、安定同位体標識内部標準をアッセイに含めることができます。これらの規格の費用には、第1のマトリックス中のペプチドを評価することをお勧めします。

1. CSF中の検出のために最適化された理想的なペプチドを決定します。最高の強度とし、干渉ピークせずに、ほとんどの再発性であるペプチドを選択します。
2. 内因性ペプチドに少なくとも6ダ相対によるペプチドの質量を増加させる重い¹³ C ¹⁵ Nアミノ酸ラベルを含むようにペプチドを対応する設計。 N-または重いPEPのC末端のいずれかに6追加のアミノ酸 - また、4のタグを追加しますトリプシン消化のために制御するために、潮。
3. 消化緩衝液中で安定同位体標識内部標準を希釈する（ステップ2.4を参照してください）。以前に開発中に観察された存在量に応じて、さまざまなレベルでスパイクすることによってCSFにスパイクされる安定同位体標識内部標準の理想的な量を決定します。内因性ペプチドの安定同位体標識標準の1：1の比が約1を達成することを目指しています。
   注：安定同位体標識内部標準は、様々な営利企業によって合成することができます。

CSFの患者サンプルの6 LC-MRMアッセイ

1. スパイクは、CSFを100μlに安定同位体標識標準の量を最適化し、混合物を凍結乾燥します。
2. 2.10 - バッファを消化し、ポイント2.7で説明したように消化を行う20μlのCSFを再懸濁します。
3. ステップ4で開発されたLC-MRMメソッドを使用してサンプルを分析します。
4. 定量分析のために、標準的な激励を実行します標準曲線で0 -15ピコモルの濃度で潮。標準曲線の作成のためのステップ2.5を参照してください。

7.データ解析

注：定量的なデータは、ベースラインのピーク内部標準（重標識ペプチド）の強度比に基づいています。 SRM / MRMデータ分析に関する詳細な情報は、以前に^10を説明しました。比率データは、絶対レベルを決定または重標識ペプチドの添加濃度からそれらを計算するために、標準曲線に使用することができます。

1. 質量分析計メーカーの標準ソフトウェア^10を用いたLC-MRMデータを分析します。また、定量的なMRMデータ^10を分析するためにスカイラインのソフトウェアを使用しています。
2. このようなスパイク酵母エノラーゼまたは各実験における安定同位体で標識された標準として内部標準の応答をチェックすることにより、ランの感度を確認してください。変動係数（CV）がより大きくないことを確認してください25％。
3. 手動で精度を確保するために、データの注釈を確認します。利用可能な場合、ペプチドの安定同位体標識バージョンを使用する、すなわち 、適切な安定同位体標識内部標準を各ペプチドとの比率を分析します。
4. CSF100μlのあたりピコモルの絶対値を取得するには、同時に実行された適切な標準曲線を介し比データを実行します。
5. 変動係数（CV）を計算します。各ペプチドのCVは25％以下および高豊富なペプチドについて15％未満であるべきです。
   注：100μlのCSF値ごとに絶対値pmolのは、後続の下流の統計的分析に使用することができます。

8.アポリポタンパク質Eアイソフォームステータス

注：のApoEアイソフォームの状態を決定するために、対応するペプチドの存在は、各アイソフォームの存在を決定することによって行うことができます。

1. >千信号のCSF閾値100μl中のApoEを考えてみましょうそのペプチドに対する陽性として-to-ノイズ。患者のアイソフォームのステータスを決定するために/不在に必要なペプチドについては、 図5を参照してください。総アポE式に各アイソフォームの％を計算することによって、対立遺伝子の発現を決定します。

結果

上述の方法を用いて、54のタンパク質からの74ペプチドからなるハイスループット10分間多重アッセイは、神経変性疾患、アルツハイマー病およびレビー小体型認知症^{（LBD）8。} 図3のマーカーのためのアッセイとして、開発された、公開多重クロマトグラムを示します以前アッセイからの重要なペプチドマーカーの^8。ペプチドは、アッセイに含まれており、その定量的な遷移を表2に示す。この方法で生成されたデータは、関連する安定同位体標識内部標準に標準化された比率を与えます。これらの値は、絶対ピコモル/100μlのCSF濃度を決定するために、標準曲線を介して置くことができます。これらの値は、統計的に、臨床サンプルにおける変化について分析することができます。

以前に^8、74 PEの定量説明したようにこのCSFアッセイに含まptidesは、これらの...

ディスカッション

すべてのMSベースのアッセイと同様に、この方法での重要なステップは、内部標準の適切かつ正確な量の決意です。絶対的定量を使用している場合は、標準曲線におけるスパイクペプチドの正確な量も重要です。

私たちのアッセイは、CSFの沈殿またはMS分析前にクリーンアップまたは脱塩工程のいずれかのタイプを使用する必要はありません - それは完全にワンポット反応法です。 CSFの少量及び（血漿と比較して）、その制限された複雑さのために、これらのステップは、それにより分析を簡素化し、診断設定への変換に対してより適して、最終的なプロトコルから除去することができることが見出されました。主分析カラムおよびMS法における溶媒の遅延のプレカラムの介在物が、500以上のサンプルについて実行MSの間の感度を維持するのに十分であるように見えます。アッセイ-UPLC runniとしてngの時間は、明確にマトリックスを消化CSFにおいて正しいピークを識別することが重要であり、短いです。

これは、スパイクされた合成ペプチドの使用、標準曲線を用いて達成することができま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセトニトリル(ACN)、LC-MSグレード	Fisher	A955-1
ギ酸、LC-MS グレード、	Fisher	A117-50
ジチオスレイトール (DTT)	Sigma	D5545 - 5 g
塩酸、37% w/w	VWR	BDH3028 - 2.5 LG
ヨードアセトアミド	シグマ	I1149 - 5 g
水酸化ナトリウム (NaOH)	Fisher	S318-500
トリプシン、シーケンシンググレード、変性	Promega	V5113
トリフルオロ酢酸 (TFA)、LC-MS グレード	Fisher	A116-50
尿素	シグマ	U0631- 500 g
水、LC-MS ULTRA Chromasolv	Fluka	14263
カスタム合成ペプチド 脱塩 1-4 mg	Genscript	カスタム
重標識アミノ酸 [13C; 15N] カスタムペプチド	Genscript	カスタム
ASB 14	Merck Millipore	182750 - 25 g
チオ尿素	Σ	T7875 - 500 g
トリス ベース	Σ	T6066
VanGuard プレカラム	Waters	186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm カラム	Waters	186007114
Yeast Enolase	シグマ	E6126
300 μlクリアスクリュートップガラスバイ	アルフィッシャーサイエンティフィック	03-FISV
Yスリットスクリューキャップ	フィッシャーサイエンティフィック	9SCK-(B)-ST1X
凍結乾燥機	ドワーズMudulyo	Mudulyoシステム
コンセントレーター/スピードバキュー	エッペンドフ	コンセントレータ plus 5301
Xevo -TQ-S 質量分析計、	Waters
Acquity UPLC システム	Waters