方法論記事

磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

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DOI：

10.3791/54545

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2016年9月15日

 ,  , 
1Promega Corporation

この記事について

サマリー

小分子を有する抗体を標識するためにビーズ法は、細胞培地から直接抗体の少量の標識化を可能にします。この方法は、アミンおよびチオール化学と互換性があり、手動または自動化されたプラットフォームを使用して、並行して複数のサンプルを処理することができます。

要約

蛍光染料のような小分子、細胞毒性薬、および放射性トレーサーで標識した抗体は、本質的な生物医学研究のツール、免疫診断およびより最近の治療薬としてあります。小分子を用いて抗体を標識するための従来の方法は、比較的高い濃度で精製された抗体を必要とする複数の透析工程を含み、スループットが制限されています。しかし、抗体薬剤コンジュゲート（ADC）ですの分野を含むいくつかのアプリケーションでは、細胞培地から直接抗体の標識化を可能にする新しい方法の恩恵を受ける。このような方法は、例えば、抗体は、生物学的に関連するアッセイにおいてスクリーニングされるADCの場合の受容体媒介性抗体内在化アッセイを可能にすることができます。ここでは、直接細胞培地から抗体の少量の標識化を可能にする方法（オン・ビーズ法）を説明します。このアプローチは、抗体を捕捉するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインG親和性ビーズを利用しますアミン又はチオール化学および標識抗体のその後の溶出のいずれかを使用して小分子で標識することにより、続いて細胞培地から。小分子の代替物として蛍光色素を取って、我々は、アミンおよびチオール標識化学の両方を用いて細胞培地から直接三つの異なるマウス抗体のビーズの標識を示します。プロテインA及びプロテインGに対する抗体の高い結合親和性は高い回収率だけでなく、標識抗体の高純度を保証します。また、磁性ビーズの使用が著しく標識スループットを向上させる、複数のサンプルを手動で処理することを可能にします。

概要

小分子で標識された抗体は、おそらく生物学1,2で最も一般的に使用される試薬です。蛍光色素とビオチンで標識された抗体広範囲撮像に使用される、免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびその他のアプリケーション3-6間の免疫沈降。放射性標識した抗体3,7イメージングおよび治療 ​​における広範な使用を見出す、細胞毒性薬（のADC）で標識した抗体は、癌の治療に新たな選択肢を提供している、と2個のADCは、既に治療的使用の8のために承認されています。その広範な使用にもかかわらず、抗体を標識するための方法は、驚くほど変化しないままで、通常は複数の反応を伴い、脱塩が9-12ステップしています。解決方法は、わずか数抗体が標識される必要があり、高濃度で高度に精製された形態で利用可能である場合には、十分なボリュームで非常にうまく機能します。しかし、ADCのような新しいアプリケーションのために、そこにあります例えば、それらは生物学的に関連する特性についてスクリーニングすることができるように、初期のハイブリドーマ段階で抗体を標識する必要があり、受容体媒介性抗体の内在13-16。ハイブリドーマ段階で、サンプル容量は限られている抗体が低濃度で発現され、サンプルの数は、従って、溶液ベースの標識方法は適していない、大きいです。

従来の抗体標識法のスループットを簡素化し、改善するために、いくつかの代替的なアプローチは、17,18提案されています。一つのアプローチは、標識および精製されたタンパク質の標識反応と溶出した抗体を捕捉するために、非磁性タンパク質小さなカラムに充填親和性ビーズを使用することです。この方法は、細胞培地から直接抗体を標識するために使用することができるが、列の使用が面倒であることができます。磁気ビーズに基づく方法は、最近のカラムの使用を排除し、スループットが、原因を改善すること19が報告されていますビーズの結合能力を制限された抗体には、抗体の低マイクログラム量にのみナノグラムを標識することができました。

我々は最近開発され、小分子20と細胞培地中に存在する抗体を標識するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズ（落ち着いたビーズのヒトIgG / mlでの> 20 mg）を使用しました。ビーズの高容量は、抗体のマイクログラム数十〜数百が便利に標識することを可能にし、ビーズの迅速な磁気応答は、並列に多数のサンプルの取り扱いおよび処理を簡素化します。小分子の代替物として蛍光色素を使用して、我々は、この方法は、アミンおよびチオール標識化学と互換性があり、標識され、非常に純粋な抗体の高い回収率を提供していますことを示しています。

このプロトコルおよび付随するビデオは、磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いて細胞培地中に存在するマウス抗体のビーズ上の標識を説明します。プロトコルです4つのセクションに分かれて：第1節では、生物学的サンプルからビーズへの抗体の取り込みについて説明します。捕捉に続いて、アミン化学を用いて、またはチオール化学を用いて蛍光色素を有する抗体の標識は、それぞれ、セクション2およびセクション3に記載されています。最後に、セクション4は、抗体濃度の計算および抗体比染料のための方法が記載されています。

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プロトコル

1.抗体は大容量磁気プロテインAまたはプロテインG磁気ビーズ上に捕獲

  1. 一様に穏やかに振盪することにより磁気ビーズを再懸濁します。ビーズを小分けするときサスペンションを均一に保ちます。
  2. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにビーズスラリー50μlのを追加します。 10秒間磁気スタンドに置きます。大切に保管してバッファを削除します。
  3. 抗体結合緩衝液の250μlのを追加します。
  4. 混合し、10秒間磁気スタンドに置きます。慎重に結合緩衝液を除去します。
  5. ビーズに抗体の50-100μgのを含む試料の1.0ミリリットルを追加します。試料は、細胞培地中の抗体または抗体を精製することができます。
  6. ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。
  7. 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。
  8. 抗体結合/洗浄緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間マグネチックスタンドに置き、結合/洗浄緩衝液を除去します。このSを繰り返し2回の洗浄の合計のためのTEP。
  9. アミン化学を用いてラベル抗体に対する第2に、またはチオール化学を用いてラベル抗体と第3節に進んでください。

アミン化学を使用した2抗体ラベリング

  1. コンジュゲート抗体
    1. ビーズにアミン結合緩衝液の100μlのを追加します。
    2. 染料の1.0 mgのジメチルスルホキシド（DMSO）100μlを加えることによっての10mg / mlのアミン反応性蛍光色素（のAlexaFluor 532-SE）を溶解します。ボルテックスで混和します。使用直前にこのソリューションを行います。
    3. 抗体100μgのためにアミン反応性色素の2.5μlを添加します。
      注意：一般的に反応染料の5-20モル過剰が推奨されます。しかし、反応性染料の量は、経験的に、抗体の比と固有の抗体の特性に所望の染料に応じて最適化する必要がある反応物に添加しました。
    4. ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズがサスペンシオに残っていることを確認しますn個。
    5. 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。
    6. 抗体結合/洗浄緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間磁気スタンドに置きます。削除し、結合/洗浄緩衝液を廃棄します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。
  2. 抗体の回復
    1. ビーズに溶出緩衝液50μlを追加します。
    2. ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で5分間混合します。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。
    3. 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。溶出されたサンプルを削除し、中和バッファーを5μlを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。
    4. プロセスをもう一度繰り返し、溶出されたサンプルをプールします。
    5. 抗体濃度を定量し、色素と抗体の比率項4に記載の方法。

チオール化学を使用した3抗体ラベリング

  1. 抗体削減
    1. 250μLを追加チオール結合緩衝液と混合します。 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。バッファを削除し、破棄します。二回、この手順を繰り返します。
    2. チオール結合緩衝液の100μlのを追加します。
    3. 2.5mMの最終濃度までジチオスレイトール（DTT）を加えます。
    4. ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。
    5. 10秒間、磁気スタンドにチューブを配置し、バッファーを捨てます。
    6. チオール結合緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。バッファを削除し、破棄します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。
    7. チオール結合緩衝液の100μlのを追加します。
  2. コンジュゲート抗体
    1. 染料の1.0 mgの100μlのDMSOを添加することによって、/ミリリットルの10mgでチオール反応性染料を溶解させます。ボルテックスで混和します。使用直前にこのソリューションを行います。
    2. 抗100μgのためのチオール反応性色素の2.5μLを追加体。
      注意：一般的に反応染料の5-20モル過剰が推奨されます。しかし、反応性染料の量は、経験的に、抗体の比と固有の抗体の特性に所望の染料に応じて最適化する必要がある反応物に添加しました。
    3. ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。
    4. 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。
    5. チオール結合緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間マグネチックスタンドに置き、バッファを削除します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。
  3. 溶出抗体
    1. ビーズに溶出緩衝液50μlを追加します。
    2. ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で5分間混合します。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。
    3. 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。溶出されたサンプルを削除し、NEUTの5μLを含む新しいマイクロ遠心チューブに移しますralizationバッファ。
    4. プロセスをもう一度繰り返し、溶出されたサンプルをプールします。
    5. 抗体濃度を定量し、色素と抗体の比率項4に記載の方法。

4.計算色素と抗体比

  1. 280 nmの（A280）で色素（Amaxの）のためのλmaxでの抗体 - 色素複合体の吸光度を測定します。
  2. 抗体濃度を計算します。
    抗体濃度（mg / mlで）= A280 - （CF× 最大 ）/ 1.4
    CFは、（製造者によって提供される）色素の補正係数=場所。
  3. 色素と抗体の比率を計算します。
    色素と抗体比（DAR）=（15万×MAX）/抗体濃度（mg / ml）×ε 色素
    ここで、ε 色素は 、その吸収極大および抗体=15万ダの分子量で、色素の吸光係数を=。

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結果

高容量の磁気プロテインAおよびプロテインGビーズを使用して小分子と抗体を標識するための概略図を図1に示す磁気プロテインGビーズ上に捕捉された抗体は、ラベルアミン化学のいずれかを用いて、蛍光色素、例えば、小分子で標識することができます一次リジンアミノ酸のアミンまたは抗体のヒンジ領域中の還元チオールでラベルチオール化学を用いて。抗体とプロテインGとの間の親和性は、標識反応時の抗体の損失を最小限に21、結果強いです。これは、単純な精製に比べて蛍光色素で標識した後、三つの異なるマウス抗体アイソタイプの効率的な回収率（50％〜90％）（ 表1）に反映されています。 （19の前に報告されたものと同様の）効率的な回収がクマシーゲルでも明らかである（ 図2）バンドintensi精製された抗体および標識抗体の重鎖および軽鎖の関係を表1に報告された結果を反映する。クマシーゲル（ 図2）

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ディスカッション

この研究の目的は、小分子の様々な、低濃度で細胞培地中に存在する抗体を標識する方法を開発することでした。抗体発見の初期段階で多数の抗体を可能にするような方法では、小分子で標識され、生物学的に関連するアッセイを用いてスクリーニングすることができます。 1つのこのようなアッセイは内在化があっても同様の結合親和性を有する抗体の間で変動し得る受容体が媒介する抗体の内在化アッセイです。したがって、従来の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）ベースのスクリーニングに加えて、それらの内在化特性について具体的に抗体をスクリーニングすることが重要です。初期の抗体開発段階で抗体を標識する方法のための重要な要件は次のとおりです。直接細胞培地から抗体を標識するa）の能力。 b）細胞培地中の抗体濃度は、を50μg/ mlである場合、例えば、低濃度で存在する抗体を標識する能力。 C）標識抗体および抗体濃度の純度は、下流のアプリケーションとの互換性を保つ必要があります。 d）の方法は、アミンおよびチオールベースの​​結合化学の両方と互換性があります。 e）の方法は、複数のサンプルを同時に処理すると互換性があります。

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開示事項

著者は株式会社プロメガの従業員です。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マグネプロテインAビーズプロメガコーポレーション G8781
マグネプロテインGビーズプロメガコーポレーション  G7471
AlexaFluor 532-SE (スクシンイミジルエステル)Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)Life TechnologiesA20347
Fluorescein-ME (Maleimide)Life TechnologiesF-150
マグネティックスタンドプロメガZ5332

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