方法論記事

リトマス試験を用いて細菌の比色検出

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DOI：

10.3791/54546

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2016年9月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

この記事について

サマリー

RNA切断DNAzyme、ウレアーゼ、および磁気ビーズを利用した修正リトマス試験を使用して、大腸菌の比色検出のためのプロトコルを記述します。

要約

ポイントオブケアやフィールドアプリケーションのための特定の病原体を検出するために使用できる、単純でありながら効果的な方法に対する需要が高まっています。このような方法は、ユーザーフレンドリーで、専門家と非専門家の両方が簡単に解釈できる信頼性の高い結果を生成する必要があります。pHのリトマス試験は、簡単な色の変化によって試験サンプルのpHを報告するため、簡単、迅速、効果的です。私たちは、細菌検出のためのリトマス試験を活用するためのアプローチを開発しました。この手法は、細菌特異的なRNA切断DNAzymeを利用して、目的の細菌を認識することと、ウレアーゼの活性を制御するメカニズムを提供することという2つの機能を達成します。DNAzyme-ウレアーゼコンジュゲートで固定化された磁気ビーズを使用することで、試験サンプル中の細菌の存在がビーズから溶液へのウレアーゼの放出に伝達されます。放出されたウレアーゼは、尿素をアンモニアに加水分解するために試験溶液に移され、その結果、従来のリトマス試験紙を使用して視覚化できるpHの上昇がもたらされます。

概要

細菌性病原体は、世界的な罹患率と死亡率の主要な原因の一つです。院内感染、食品媒介性病原体、環境中の細菌汚染物質による発生は、公衆衛生と安全に深刻かつ継続的な脅威をもたらします。これらのアウトブレイクを防ぐためには、さまざまな状況下で病原体をタイムリーに検出できる効果的なツールが必要です。シンプルでありながらも持ち運び可能で費用対効果の高い効果的な検査は、特にアウトブレイクの影響を受けやすいが高価な検査施設を買う余裕がない地域では、非常に切望されています。1-3 細菌を検出する方法は数多く存在しますが、その多くは、長い検査時間、高価な機器、複雑な検査手順を必要とするため、スクリーニングや現場での検査ツールとしては適していません。

比色検査は、肉眼で色の変化を簡単に検出できるため、ポイントオブケアやフィールドアプリケーションにとって特に魅力的です。pHのリトマス試験は、簡単、迅速、そして効果的です。これは非常に古い技術ですが、そのシンプルさと有効性により、今日でも広く使用されています。驚くべきことに、この単純な検査は、最近、この検査を大腸菌検査用に修正するアプローチを開発するまで、他の分析物の検出を達成するために変更されていませんでした。4

大腸菌の拡張リトマス試験紙は、3つの追加要素を使用します:大腸菌活性化RNA切断DNAz....

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プロトコル

試薬および緩衝液の調製

  1. 0.5 Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）
    1. 2リットルのビーカーで、脱イオン蒸留水800ミリリットル（のddH 2 O）に186.1グラムのEDTAを追加します。 NaOHペレットを用いて、8.0への溶液のpHを調整します。 1.0 Lの最終容量までのddH 2 Oを追加し、4℃でオートクレーブ処理し、ストアのオートクレーブ可能なガラス瓶にソリューションを転送します。
  2. 10×トリス - ホウ酸EDTA（10×TBE）
    1. 4 Lのプラスチックビーカーでは、すべてのコンポーネントまで攪拌棒を用いて、4 L.ミックスの最終容量432グラムトリスベース、200グラムのホウ酸、0.5 M EDTA（pHは8.0）とのddH 2 Oの80ミリリットルを追加します。溶解されます。 4℃でオートクレーブ処理し、ストアの1 Lのガラス瓶にソリューションを転送します。
  3. 10％変性ポリアクリルアミド証券
    1. 4 Lのプラスチックビーカー内で、1681.7グラムの尿素を追加し、400ミリリットル10倍TBE、40％アクリルアミド/ビスアクリルアミドの1 L（29：1）からfまでのソリューションとのddH 2 Oinalボリュームは、尿素が溶解するまで攪拌棒を用いて、4 L.ミックスです。 4℃で1 ....

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結果

細菌のリトマス試験の原理は、図1で説明されたテストは、3つの重要な材料使用しています。特定の細菌、ウレアーゼおよび磁気ビーズによって活性化されるRNA切断DNAザイムを。 DNAザイムは、目的の細菌の高度に特異的な検出を達成するために、分子認識要素として使用されます。ウレアーゼおよび磁気ビーズをDNAザイムのRNA切断活性のシグナル伝達を達成するために使用されます。これは、ウレアーゼDNAザイムコンジュゲートを含む磁気ビーズを作成することを含みます。標的細菌の存在下で、DNAザイム切断のRNA結合。このアクションは、磁気ビーズからのウレアーゼの解離を生じさせます。放出ウレアーゼが簡単磁気ビーズから分離し、尿素およびpH感受性色素を含有するレポーター溶液の色変化を生成するために使用することができます。ウレアーゼは、cをトリガのpHの増加を伴う、アンモニアに尿素を加水分解する色素のolor変化。

図2は、.......

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ディスカッション

図1に示すように、リトマス試験に細菌応答性DNAザイムのRNA切断活性の作用の翻訳は、ウレアーゼと磁気分離を使用することによって可能となる。細菌検出のための修正されたリトマス試験のデモンストレーションではあるがE.で行わ大腸菌依存性RNA切断DNAザイム、5,19,20デザインは、一般的に任意のRNA切断DNAザイムのために拡張することができます。異なる検体と新たな目標のためにランダム配列プールからの新しいRNA切断DNAザイムを単離するための様々な方法論のためのRNA切断DNAザイムの偉大な可用性を考えると、我々は修正されたリトマス試験プラットフォームは関心の多様な標的の検出に拡張することができることを期待します。

E.のためのリトマス試験報告反応時間は、それぞれ、1及び2時間に設定されている場合大腸菌検出は5,000と500の細胞を検出することができます。人気のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）法は、.......

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究プロジェクトのための資金は、カナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）によって、ディスカバリー助成金を通じてYLに提供されました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)VWR AMRESCO0105
酸化ナトリウム(NaOH)ペレットBIO BASIC CANADA INC.SB6789
トリスベースVWR AMRESCO0497
ホウ酸AMRESCO0588尿
素VWR AMRESCOM123
40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)溶液BIO BASIC CANADA INC.A0007
ショ糖バイオショップカナダ株式会社SUC507
ブロモフェノールブルーバイオショップカナダBRO777
レンシアノールFFシグマアルドリッチX-4126
10%ドデシル硫酸ナトリウムBioshopカナダ株式会社SDS001
塩酸(HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
塩化ナトリウム(NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
塩化マグネシウム (II) 六水和物VWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
アデノシン トリホスパフテ (ATP)AMRESCO0220
酢酸ナトリウム三水和物 (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
エタノール市販アルコールP016EAAN
テトラメチレンエチレンジアミン (TEMED)AMRESCO0761
10% 過硫酸アンモニウム (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
スクシンイミジル 4-(N-maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
ジメチルスルホキシド (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0.04% フェノール レッドSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 ポリヌクレオチド キナーゼ反応バッファーLucigen30061-1
10x T4 DNA リガーゼ反応バッファーBio Basics CanadaB1122-B
T4 DNA リガーゼ (5 U/μl)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BrothAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl)Lucigen30061-1
大腸菌K12 (MG1655)ATCCATCC700926
Beckman Coulter, Inc.
ガラス板CBS科学ngp-250nr
0.75mm厚スペーサーCBS科学VGS-0725r
12ウェルコームCBS科学VGC-7512
UVランプUVP95-0017-09
分光光度計(NanoVue)GEヘルスケアN/A
金属板CBS科学CPA165-250
ボルテックスVWR インターナショナル58816-123
ゲル電気泳動装置CBS 科学ASG-250
シャーレVWR インターナショナル25384-342
100 kDa MWCO 遠心フィルターEMD ミリポアUFC510024
磁気ビーズ (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
磁気分離ラックNew England BioLabsS1506S
マイクロチューブSarstedt72.69
シリンジ フィルター (0.22 μm)VWR International28145-501
14 ml 培養チューブVWR International60818-725
細胞培養インキュベーターEppendorf ScientificM13520000
Branson 超音波洗浄機BransonN/A
カメラ (Canon Powershot G11)CanonN/A
50 ml コニカルチューブVWR International89004-364
水キシ392187

参考文献

  1. Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
  2. Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (20....

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RNA DNAE colipH

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