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リトマス試験を用いて細菌の比色検出

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DOI：

10.3791/54546

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2016年9月17日

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1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

この記事について

サマリー

RNA切断DNAzyme、ウレアーゼ、および磁気ビーズを利用した修正リトマス試験を使用して、大腸菌の比色検出のためのプロトコルを記述します。

要約

ポイントオブケアやフィールドアプリケーションのための特定の病原体を検出するために使用できる、単純でありながら効果的な方法に対する需要が高まっています。このような方法は、ユーザーフレンドリーで、専門家と非専門家の両方が簡単に解釈できる信頼性の高い結果を生成する必要があります。pHのリトマス試験は、簡単な色の変化によって試験サンプルのpHを報告するため、簡単、迅速、効果的です。私たちは、細菌検出のためのリトマス試験を活用するためのアプローチを開発しました。この手法は、細菌特異的なRNA切断DNAzymeを利用して、目的の細菌を認識することと、ウレアーゼの活性を制御するメカニズムを提供することという2つの機能を達成します。DNAzyme-ウレアーゼコンジュゲートで固定化された磁気ビーズを使用することで、試験サンプル中の細菌の存在がビーズから溶液へのウレアーゼの放出に伝達されます。放出されたウレアーゼは、尿素をアンモニアに加水分解するために試験溶液に移され、その結果、従来のリトマス試験紙を使用して視覚化できるpHの上昇がもたらされます。

概要

細菌性病原体は、世界的な罹患率と死亡率の主要な原因の一つです。院内感染、食品媒介性病原体、環境中の細菌汚染物質による発生は、公衆衛生と安全に深刻かつ継続的な脅威をもたらします。これらのアウトブレイクを防ぐためには、さまざまな状況下で病原体をタイムリーに検出できる効果的なツールが必要です。シンプルでありながらも持ち運び可能で費用対効果の高い効果的な検査は、特にアウトブレイクの影響を受けやすいが高価な検査施設を買う余裕がない地域では、非常に切望されています。1-3 細菌を検出する方法は数多く存在しますが、その多くは、長い検査時間、高価な機器、複雑な検査手順を必要とするため、スクリーニングや現場での検査ツールとしては適していません。

比色検査は、肉眼で色の変化を簡単に検出できるため、ポイントオブケアやフィールドアプリケーションにとって特に魅力的です。pHのリトマス試験は、簡単、迅速、そして効果的です。これは非常に古い技術ですが、そのシンプルさと有効性により、今日でも広く使用されています。驚くべきことに、この単純な検査は、最近、この検査を大腸菌検査用に修正するアプローチを開発するまで、他の分析物の検出を達成するために変更されていませんでした。4

大腸菌の拡張リトマス試験紙は、3つの追加要素を使用します:大腸菌活性化RNA切断DNAzyme（EC1)、5ウレアーゼ、および磁気ビーズ。DNAザイムとは、触媒活性を持つ合成一本鎖DNA分子を指します。6 これらは、in vitro選択を使用してランダム配列DNAプールから単離できます。7,8 それらは非常に安定しており、高効率の自動DNA合成を使用して費用対効果の高い方法で製造できます。9 これらの理由から、DNAzymes、特にRNA切断DNAzymesは、バイオセンシングアプリケーションについて広く研究されてきました。6,10,11 RNA切断DNAザイムセンサーは、金属イオン、12-16の低分子、17,18の細菌性病原体5,19-21、および癌細胞を検出するために開発されました。22 標的誘導性RNA切断DNAzymeの広範な利用可能性を考えると、DNAzymeを利用するアッセイは、多様な分析物を検出するために拡張できる可能性があります。

Ureeaseは、尿素をアンモニアに加水分解する能力のために選択され、その結果、pHが上昇します。また、ウレアーゼは非常に効率的で安定しており、他の生体分子との結合に適しています。したがって、RNA切断DNAzymeとウレアーゼのコンジュゲートにより、他のターゲットの検出にリトマス試験を使用できると仮定しました。5

RNA切断DNAzymeの作用は、DNAzyme-ウレアーゼ結合体で固定化された磁気ビーズの使用を通じて、ウレアーゼ媒介性のpH上昇に中継されます。調査中のDNAzymeの活性は大腸菌に厳密に依存しているため、試験溶液中にこの細菌が存在すると、磁気ビーズから溶液にウレアーゼが放出され、その後、pH感受性色素を含むレポーター溶液中で尿素を加水分解するために使用されます。この手順の最終結果は、染料またはpHペーパーによって便利に報告できる色の変化です。

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プロトコル

試薬および緩衝液の調製

  1. 0.5 Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）
    1. 2リットルのビーカーで、脱イオン蒸留水800ミリリットル（のddH 2 O）に186.1グラムのEDTAを追加します。 NaOHペレットを用いて、8.0への溶液のpHを調整します。 1.0 Lの最終容量までのddH 2 Oを追加し、4℃でオートクレーブ処理し、ストアのオートクレーブ可能なガラス瓶にソリューションを転送します。
  2. 10×トリス - ホウ酸EDTA（10×TBE）
    1. 4 Lのプラスチックビーカーでは、すべてのコンポーネントまで攪拌棒を用いて、4 L.ミックスの最終容量432グラムトリスベース、200グラムのホウ酸、0.5 M EDTA（pHは8.0）とのddH 2 Oの80ミリリットルを追加します。溶解されます。 4℃でオートクレーブ処理し、ストアの1 Lのガラス瓶にソリューションを転送します。
  3. 10％変性ポリアクリルアミド証券
    1. 4 Lのプラスチックビーカー内で、1681.7グラムの尿素を追加し、400ミリリットル10倍TBE、40％アクリルアミド/ビスアクリルアミドの1 L（29：1）からfまでのソリューションとのddH 2 Oinalボリュームは、尿素が溶解するまで攪拌棒を用いて、4 L.ミックスです。 4℃で1 L琥珀色のガラスびんとストアにソリューションを転送します。
  4. 2倍ゲルローディングバッファー（2×GLB）
    1. 200ミリリットルのガラス製ビーカーに、44グラムの尿素、8グラムのスクロース、10mgのブロモフェノールブルー、10 mgのキシレンシアノールFF、10％ドデシル硫酸ナトリウム400μlの、および10×TBEの4ミリリットルを追加します。 40 mlの最終体積までのddH 2 Oを加え、磁気攪拌棒で混合しながら、50℃で穏やかに加熱して成分を溶解します。 4℃で1.5ミリリットルマイクロチューブや店舗への転送1ミリリットルのアリコート。
      注：使用前には、任意の固形物を再溶解するために90℃で短時間加熱を必要とします。
  5. 1 Mトリス - 塩酸（トリス-HCl）（pH7.5）を
    1. ガラス瓶に、トリスベースの12.1グラムとのddH 2 Oの70ミリリットルを追加し、固体が溶解するまで混合します。 1 M塩酸（HCl）を使用してpHを7.5に調整します。オートクレーブSTO 100 mlの最終容量までのddH 2 Oを加えます4℃で再
  6. 5 M塩化ナトリウム（NaCl）で
    1. ガラス瓶に、のddH 2 Oの150ミリリットル中のNaClの58.4グラムを溶解ddH 2 Oで200mlにボリュームを調整します4℃で保存。
  7. DNA溶出バッファー
    1. ガラス瓶に、1 Mトリス塩酸（pH7.5）、8.0 5 MのNaCl mlおよび0.5 M EDTA 0.4mlの液（pH 8.0）2.0 mlと混合します。 ddH 2 O、4℃でオートクレーブや店舗で200mlにボリュームを調整します。
  8. 1 M 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）（pH7.4）で
    1. ガラス瓶に、のddH 2 O 80ml中HEPES 2.38グラム溶解5 N NaOHを用いてpHを7.4に調整し、100ミリリットルの最終容量までのddH 2 Oを追加します。
  9. 1 M塩化マグネシウム（MgCl 2を）
    1. ガラス瓶に、のMgCl 2・6H 2 Oの2.03グラムを追加し、のddH 2 Oで100mlにボリュームをもたらします
  10. 反応バッファー（RB）
    1. 50ミリリットルの円錐管で、1 M HEPES（pH7.4）で、5 M NaClを1.5ミリリットル、1 MのMgCl 2の0.75ミリリットル、およびTween-20の5μlに50μlを添加します。 50ミリリットルの最終体積のddH 2 Oを追加します。溶液を混合し、使用するまで4℃でシリンジ駆動フィルター（0.22μm）で、店舗を使用して別のコニカルチューブにフィルタリングします。
  11. 結合緩衝液（BB）
    1. 50ミリリットルコニカルチューブでは、1Mトリス塩酸（pH7.5）を500μl、NaClを8.8グラムを追加し、のMgCl 2の1 M50μlの、およびTween 20の5μlのは、最終容量までのddH 2 Oを追加します。 50ミリリットルの。溶液を混合し、使用するまで4℃でシリンジ駆動フィルター（0.22μm）で、店舗を使用して別のコニカルチューブにフィルタリングします。
  12. 基質溶液（SS）
    1. 50ミリリットルの円錐管では、NaClを5.8グラム、1 Mの3ミリリットルのMgCl 2、1.5グラムの尿素、およびのddH 2 Oの40ミリリットルを追加します。 10mMのHClを用いて5.0に溶液のpHを調整します。溶液が緩衝されていないため、塩酸を用いてpHを調整します慎重に小さな塩酸アリコートの添加によって。 50ミリリットルの最終体積のddH 2 Oを追加します。
    2. 溶液を混合し、使用するまで4℃でシリンジ駆動フィルター（0.22μm）で、店舗を使用して別のコニカルチューブにフィルタリングします。
  13. ルリア・ベルターニ（LB）ブロス
    1. ビーカーに、のddH 2 Oを1Lの20.0 gでLB粉末を溶解します4℃でガラスびん、オートクレーブ、およびストアに転送します。
  14. 1.5％LB寒天
    1. 250ミリリットルフラスコに、1.5グラム寒天とLBブロスの100ミリリットルを追加します。 4℃でオートクレーブや店舗。
  15. 寒天プレート
    1. 電子レンジでLB寒天を再溶解し、溶液を〜50℃に冷却します。 〜5のプレートを作り、ペトリ皿にソリューションを注ぎ、それらを固化することができます。

2.合成とEの精製coli-応答ザイムEC1

  1. テンプレート媒介酵素連結によりEC1の合成
    1. COMMを精製ercially合成されたオリゴヌクレオチドBS1、DE1、及びT1 10％が、標準的なプロトコルに従って、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（dPAGE）を変性させることによって（ 表1に提供された配列）。
    2. BS1、DE1、およびT1の100μMのストックを準備します。使用するまで-20℃で保管してください。
    3. 1.5mlマイクロチューブでは、酵素のサプライヤー（500 mMトリス塩酸（pHは7.6）、100 mMのMgCl 2をにより提供のddH 2 Oの38.5μlを、DE1を5μl、および10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液5μlを追加50mMのジチオスレイトール（DTT）、1.0 mMのスペルミジン）。
    4. アデノシン三リン酸（ATP）（100 mM）の1μLを加えます。 T4ポリヌクレオチドキナーゼ（10 U /μl）を5単位を追加します。慎重に反応混合物をピペットで混ぜます。
    5. 37℃で30分間反応をインキュベートします。
    6. 5分間90℃に加熱して反応をクエンチしました。
    7. ddH 2 Oの118μlを、BS1の5μlを、およびT1の5μlを添加します。 2マイルのために90°Cまで反応を加熱nは、その後、10分間かけて室温まで冷却。
    8. 酵素供給業者によって提供さ10×T4 DNAリガーゼ反応緩衝液20μl（400 mMトリス塩酸（pHは7.8）、100 mMのMgCl 2を、100mMのDTT、5mMのATP）を追加します。 T4 DNAリガーゼ10単位（5 U /μl）を加え、注意深くピペッティングにより混合します。
    9. 2時間室温でインキュベートします。
    10. 3 M酢酸ナトリウム（NaOAcを）（pHは5.2）を20μl、冷たい100％エタノール500μlのを追加します。ボルテックスにより溶液を混合し、30分間-20℃の冷凍庫にチューブを配置します。
    11. 遠心分離機、4℃で20分間20,000×gでマイクロフュージ。ピペットで注意深く上清を除去します。
    12. 4℃で10分間20,000×gで再び冷70％エタノール及び遠心分離機でペレットを洗浄。再度上清を除去し、10分間真空下でペレットを乾燥させます。
    13. ddH 2 Oの15μlのDNAを再懸濁した後、2×GLBの15μlを添加します。
    14. 90°Cに勢いよくボルテックスし、熱のために2分。後述のように10％dPAGEにより全長DNAを精製します。
  2. 10％dPAGEの設定
    1. きれいな2枚のガラス板（1フルプレートと1ノッチ付き）、2 0.75ミリメートルの厚さのスペーサー、および12ウェルコーム。 2それぞれの側にスペーサ及び上部に切り欠き板が平らな表面上の1つのガラス板を置きます。サプライヤーによって設けられた4つのクリップを使用して、2つのプレートをクリップ。
    2. 150 mlのプラスチックビーカーに、10％dPAGE 40mlを、テトラメチルエチレンジアミンの40μL（TEMED）、および10％の過硫酸アンモニウム（APS）の400μLを注ぎます。成分を混合し、ゆっくりとプレート間のソリューションを注ぎます。
    3. コー​​ムを挿入した後、ゲルを10分間かけて重合することができます。ゲルが重合された後、ゆっくりとコームを削除してのddH 2 Oでウェルをフラッシュ
    4. ゲル電気泳動装置にプレートをマウントします。過熱を防ぐために、発生した熱を放散するための金属板を使用します。
    5. 上部と下部のチャンバーに1×TBEを注ぎますウェルはよくバッファーに沈めていることを確認してください。ピペットまたはシリンジを使用して、1×TBEでウェルを洗浄します。
    6. サンプルをロードする前に15分間、35ミリアンペアと実行前に実行されるように装置を設定します。
  3. 10％dPAGEから連結したEC1の溶出
    1. 底色素（ブロモフェノールブルー）は、ガラス板の底部に到達するまで、ステップ2.2.6に続いて、35ミリアンペアでゲルを実行します。これは、約1.5時間を取る必要があります。電源をオフにして、装置からプレートを取り外します。
    2. 紙タオルの数枚のプレートを置き、慎重にガラス板からスペーサーを削除します。慎重トップガラス板を取り外し、ラップでゲルを包みます。
    3. 第二のガラスプレートを取り外して、再度ラップでカバーするためにゲルを裏返し。ラップのしわを避けるように注意してください。
    4. 4つの異なるDNAバンド（完全に連結したEC1、DE1、BS1、およびT1）を生成しますUVシャドーイング（260 nm）を用いて連結産物を可視化します。
    5. 消費税1.5mlマイクロチューブに滅菌カミソリの刃と転送にトップバンド（EC1）。それは細かいペースト状になるまで滅菌ピペットチップ（200μlの先端サイズ）を有するゲルをつぶします。 、DNAの溶出緩衝液550μLを加える埋め込み蛍光団を保護するためにアルミホイルでチューブをカバーし、そして15分間振とうします。
    6. 5分間20,000×gでゲル溶液を遠心し、慎重に別の1.5mlマイクロチューブに上清400μlのを転送します。ピペット操作中にゲル片を回収することは避けてください。
    7. 転送上清を持つマイクロチューブに冷たい100％エタノールの3 MのNaOAc（pHは5.2）の40μlを添加し、1.0ミリリットル。ボルテックスにより溶液を混合し、30分間-20℃の冷凍庫にチューブを配置します。
    8. 遠心分離機、4℃で20分間20,000×gでマイクロフュージ。ピペットで注意深く上清を除去します。
    9. 4℃で10分間20,000×gで再び冷70％エタノール及び遠心分離機でペレットを洗浄。もう一度、削除上清を、10分間真空下でペレットを乾燥させます。
    10. 260 nmのUV吸光度を測定することにより、EC1の濃度を決定します。 10μMのストックを作成し、使用するまで-20℃でサンプルを保存します。

DNAへのウレアーゼの3コンジュゲート

  1. スクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）ストックの調製
    1. DMSOの676μlの中1mgのSMCCを溶解させます。使用するまで氷上に渦と場所。
  2. ウレアーゼストックの調製
    1. 1×PBS（なしのMg 2+またはCa 2+）1mlに1mgのウレアーゼを溶解させます。使用するまで氷上に置いてください。
      注：結晶化ウレアーゼを溶解するのに遅く、穏やかな混合は、変性を回避するために必要とされます。
  3. ウレアーゼ-DNAの合成（UrDNA）
    1. 2.5ミリリットルマイクロチューブに100μMLD1の10μLを加えます。 ddH 2 Oの140μlを、10×PBSを40μl、およびボルテックスを追加します。
    2. SMCC秒の80.5μlを添加しますタック、卓上遠心機を用いて、DMSO、渦、および短時間遠心機の159.5μlの。
    3. 60分間37℃でインキュベートします。マイクロフュージキャップの下に結露を避けてください。
    4. 1×PBS200μlの、3 MのNaOAc（pHは5.2）60μlの、冷100％エタノールの1.5ミリリットルを追加します。ボルテックスで溶液を混合し、30分間-20℃でインキュベートします。
    5. 遠心分離機、4℃で20分間20,000×gでソリューションを提供します。上清を除去し、真空下でペレットを乾燥させます。過乾燥は避けてください。
    6. 乾燥したペレットにウレアーゼ株式の400μlを添加し、5時間室温でインキュベートします。
    7. 予め洗浄100K MWCO遠心フィルターカラムに粗製の結合体の200μlのを転送します。 5分間、14,000×gでカラムを遠心。
    8. 5分間、14,000×gで、カラムと遠心への粗結合体の残りの200μlのを転送します。列を削除し、新しい2.0ミリリットルマイクロチューブ（「コレクションチューブ」）に逆さまに置きます。
    9. Centrif2分1,000×gで（反転列を持つ）コレクションチューブUGE。コレクションチューブを外し、コンジュゲートの追加の回復のために、膜を洗浄し、遠心カラムに1×PBSの30μlを添加します。
    10. もう一度列を反転し、コレクションチューブに戻す置きます。 2分1,000×gで遠心分離（逆列を持つ）コレクションチューブ。列を削除し、処分します。
    11. 使用するまで4℃でUrDNAを保管してください。

磁気ビーズ上にEC1とUrDNAの4アセンブリ

  1. よく磁気ビーズ（MB）の株式を混合し、1.5mlマイクロチューブにMB懸濁液100μlを移します。 MBを単離するための磁気ラックホルダーにマイクロチューブを置きます。
  2. ピペットで上清を除去し、チューブに結合バッファー（BB）の150μlを添加します。ホルダーからチューブを外し、慎重に均質な溶液にMBを再懸濁するためにチューブをタップします。トンにサスペンションをはね避けてくださいチューブまたはキャップのオペアンプ。この問題が発生した場合、簡単に戻って懸濁液に残留物をスピンする卓上型遠心分離機を使用しています。
  3. 繰り返しステップ4.2をさらに2回。
  4. この懸濁液に、10μMのEC1の10μlを添加します。慎重にチューブをタップして混ぜます。
  5. 30分間の穏やかな振とうで溶液をインキュベートします。 MBの沈殿を回避するために、チューブごとに2〜3分をタップします。
  6. MBを分離し、ピペッティングにより上清を除去するために戻って磁気ラック上のマイクロチューブを置きます。 （ステップ4.2で説明したように）BB150μlでMB 3回洗浄します。
  7. 洗濯が完了すると、BB150μlの合計でMBを一時停止します。この溶液に、UrDNAの15μlを添加し、2分間45℃にソリューションを加熱します。溶液を室温に冷却し、2時間インキュベートします。
  8. MBを分離し、ピペッティングにより上清を除去するために戻って磁気ラック上のマイクロチューブを置きます。
  9. 反応バッファー（RB）の100μLを加えます。トンを削除します彼は、磁気ラックからチューブを微量遠心し、慎重にMBを再懸濁します。
  10. ステップ4.9を繰り返して、MB 3回以上洗浄します。
    注：洗浄上清をすぐに偽陽性シグナルをもたらし得る、ハイブリダイズしないUrDNAがまだ存在するかどうかを決定するために試験することができます。試験は、洗浄溶液に50mMの尿素及び0.04％フェノールレッドを10μlを10μl添加することによって行うことができます。洗浄液は、色の変化を起こさないまでMBを洗浄し続けます。 100μlの懸濁液を使用するまで4℃で保存されています。

細菌細胞20の5準備

  1. 培養E.株式から大腸菌
    1. プレートE.大腸菌 K12（MG1655）炎の下で、または生物学的安全キャビネット内のグリセロールストックからLB寒天プレート上に。
    2. LB寒天を穿刺を避けるために、寒天プレートの表面を滅菌したピペットチップを使用して、静かにグリセロールストックを触れ、軽く連勝。
    3. ストリークを反転プレートとは、14時間、37℃でインキュベートします。
    4. パラフィルムでプレートをシールし、3週間の最大のために4℃で保存します。
  2. 培養E.細胞の計数のための大腸菌
    1. 滅菌した14 mlの培養チューブに、LB培地を2mlを分注します。
    2. 滅菌したピペットチップを使用して、ステップ5.1で調製した画線寒天プレートから単一コロニーをピックアップし、培養チューブに移します。
    3. 37℃で培養物をインキュベートし、14時間、230 rpmで振とうします。
    4. 逐次10倍の間隔で細菌培養物を希釈します。
    5. 各希釈サンプルについて、均等に独立したLB寒天プレート上で5100μlアリコートをプレート。プレートを反転し、14時間、37℃でインキュベートします。
    6. 各希釈液の平均細胞濃度を得るために、各サンプルの細胞を数えます。
      注：10 7細胞は、しばしばE.のための基準リトマス試験を設定するために使用されていますE.このレベルとして大腸菌 大腸菌は、迅速なカラーちゃんをトリガすることができますGE。結果セクションで説明したようにしかし、適切に実行リトマス試験は、と低い500個の細胞を検出することができます。
  3. E.の準備テストのための大腸菌細胞
    1. 目的の細胞懸濁液を、1.5mlマイクロチューブに培養された株式の譲渡1ミリリットルのため。
    2. 4℃で10分間、6000×gで細胞を遠心。慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去します。
    3. 細胞ペレットに反応緩衝液10μlを加え、細胞を再懸濁。 5分間細胞懸濁液を超音波処理します。 5分間のアイスボックスに細胞懸濁液を転送します。
    4. さらに5分間、細胞懸濁液を超音波処理します。
    5. 4℃で10分間13,000×gで細胞懸濁液を遠心。テストのための上清（10μl）を使用してください。

6.リトマス試験

  1. 1.5mlマイクロチューブでは、マイクロチューブ中の反応バッファー（RB）の100μLを添加し、ボルテックスすることにより、チューブを予備洗浄し、バッファを破棄。
  2. 転送洗浄マイクロチューブに組み立てEC1（プロトコル4）15μlの。
  3. 磁気ラック上にマイクロチューブを配置することによって磁気ビーズを洗浄します。ピペットで上清を取り除きます。ラックからマイクロチューブを外し、RBの100μlを添加し、慎重に磁気ビーズを再懸濁します。
  4. ステップ6.3を繰り返して、MBさらに2回洗浄します。
  5. 磁気ラックにバックマイクロチューブを置き、上清を除去し、10μlのE.を追加大腸菌サンプルは、ステップ5.3から調製しました。
  6. 静かにマイクロチューブをタップして、慎重に試料及び磁性ビーズを混ぜます。
  7. 1時間室温で反応をインキュベートします。
  8. 反応に、のddH 2 Oの90μlを添加し、磁気ラック上にマイクロチューブを配置します。
  9. 後の磁気分離の約3分、慎重に0.5ミリリットルマイクロチューブに上清の85μLを移します。にゆっくりと上清を撤回任意の磁気ビーズを収集することは避けてください。
  10. 上記のマイクロチューブに0.04％のフェノールレッド、および100μlの基質溶液の15μlを添加します。
  11. 色の変化を記録するために特定の時間間隔で写真を撮ります。
    注：pHの変化はまた、微小電極でpH計を用いてモニターすることができます。最初のpHは約5.2〜5.5でなければならない（溶液は黄色です）。そうでない場合、溶液は、1mMの酢酸緩衝液のpH 5.0）を添加することによって調整することができます。

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結果

細菌のリトマス試験の原理は、図1で説明されたテストは、3つの重要な材料使用しています。特定の細菌、ウレアーゼおよび磁気ビーズによって活性化されるRNA切断DNAザイムを。 DNAザイムは、目的の細菌の高度に特異的な検出を達成するために、分子認識要素として使用されます。ウレアーゼおよび磁気ビーズをDNAザイムのRNA切断活性のシグナル伝達を達成するために使用されます。これは、ウレアーゼDNAザイムコンジュゲートを含む磁気ビーズを作成することを含みます。標的細菌の存在下で、DNAザイム切断のRNA結合。このアクションは、磁気ビーズからのウレアーゼの解離を生じさせます。放出ウレアーゼが簡単磁気ビーズから分離し、尿素およびpH感受性色素を含有するレポーター溶液の色変化を生成するために使用することができます。ウレアーゼは、cをトリガのpHの増加を伴う、アンモニアに尿素を加水分解する色素のolor変化。

図2は、...

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ディスカッション

図1に示すように、リトマス試験に細菌応答性DNAザイムのRNA切断活性の作用の翻訳は、ウレアーゼと磁気分離を使用することによって可能となる。細菌検出のための修正されたリトマス試験のデモンストレーションではあるがE.で行わ大腸菌依存性RNA切断DNAザイム、5,19,20デザインは、一般的に任意のRNA切断DNAザイムのために拡張することができます。異なる検体と新たな目標のためにランダム配列プールからの新しいRNA切断DNAザイムを単離するための様々な方法論のためのRNA切断DNAザイムの偉大な可用性を考えると、我々は修正されたリトマス試験プラットフォームは関心の多様な標的の検出に拡張することができることを期待します。

E.のためのリトマス試験報告反応時間は、それぞれ、1及び2時間に設定されている場合大腸菌検出は5,000と500の細胞を検出することができます。人気のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）法は、...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究プロジェクトのための資金は、カナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）によって、ディスカバリー助成金を通じてYLに提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
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エチレンジアミン四酢酸(EDTA)VWR AMRESCO0105
酸化ナトリウム(NaOH)ペレットBIO BASIC CANADA INC.SB6789
トリスベースVWR AMRESCO0497
ホウ酸AMRESCO0588尿
素VWR AMRESCOM123
40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)溶液BIO BASIC CANADA INC.A0007
ショ糖バイオショップカナダ株式会社SUC507
ブロモフェノールブルーバイオショップカナダBRO777
レンシアノールFFシグマアルドリッチX-4126
10%ドデシル硫酸ナトリウムBioshopカナダ株式会社SDS001
塩酸(HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
塩化ナトリウム(NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
塩化マグネシウム (II) 六水和物VWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
アデノシン トリホスパフテ (ATP)AMRESCO0220
酢酸ナトリウム三水和物 (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
エタノール市販アルコールP016EAAN
テトラメチレンエチレンジアミン (TEMED)AMRESCO0761
10% 過硫酸アンモニウム (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
スクシンイミジル 4-(N-maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
ジメチルスルホキシド (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0.04% フェノール レッドSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 ポリヌクレオチド キナーゼ反応バッファーLucigen30061-1
10x T4 DNA リガーゼ反応バッファーBio Basics CanadaB1122-B
T4 DNA リガーゼ (5 U/μl)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BrothAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl)Lucigen30061-1
大腸菌K12 (MG1655)ATCCATCC700926
Beckman Coulter, Inc.
ガラス板CBS科学ngp-250nr
0.75mm厚スペーサーCBS科学VGS-0725r
12ウェルコームCBS科学VGC-7512
UVランプUVP95-0017-09
分光光度計(NanoVue)GEヘルスケアN/A
金属板CBS科学CPA165-250
ボルテックスVWR インターナショナル58816-123
ゲル電気泳動装置CBS 科学ASG-250
シャーレVWR インターナショナル25384-342
100 kDa MWCO 遠心フィルターEMD ミリポアUFC510024
磁気ビーズ (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
磁気分離ラックNew England BioLabsS1506S
マイクロチューブSarstedt72.69
シリンジ フィルター (0.22 μm)VWR International28145-501
14 ml 培養チューブVWR International60818-725
細胞培養インキュベーターEppendorf ScientificM13520000
Branson 超音波洗浄機BransonN/A
カメラ (Canon Powershot G11)CanonN/A
50 ml コニカルチューブVWR International89004-364
水キシ392187

参考文献

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