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方法論記事

と実験感染

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DOI:

10.3791/54554

⸱

2016年11月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、 リステリア・モノサイトゲネスのEGD株と（リステリア菌）を C57BL / 6Jマウスに接種すると、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞によるインターフェロンγ（IFN-γ）反応を測定する方法を説明しますそして、適応Tは、感染後のリンパ球。このプロトコルは、病原体の改変されたLD 50用量での感染後のマウスの生存の研究を実施する方法について説明します。

要約

リステリア菌は、ヒトにおける食品媒介性疾患の原因であるグラム陽性細菌です。この病原体によるマウスの実験的感染は、細胞内病原体に対する宿主の免疫における自然免疫と適応免疫細胞および特定のサイトカインの役割に非常に有益となっています。 リステリア菌と亜致死感染の間の生来の細胞によるIFN-γの産生は、マクロファージおよび病原体1-3の初期の制御を活性化するために重要です。また、適応メモリリンパ球によるIFN-γ産生が再感染4時に先天性細胞の活性化をプライミングするために重要です。 L.は、このように感染モデルをモノサイトゲネス IFN-γの産生を増加させるために設計されている新しい治療法は、in vivoでの IFN-γ応答に影響を与えると、そのような細菌のクリアランスを大きくするか、マウスの生存率を向上させるなどの生産的な生物学的効果を持っているかどうかを調査するための優れたツールとして機能しますから感染。 リステリア菌のEGD株とC57BL / 6Jマウスの腹腔内感染を行うために、フローサイトメトリーによって、NK細胞、NKT細胞、および適応リンパ球によるIFN-γの産生を測定する方法のための基本的なプロトコルは、ここで説明します。 （1）成長し、接種菌を調製し、（2）脾臓及び肝臓における細菌負荷を測定し、エンドポイント（3）測定動物の生存：また、手順がに記載されています。代表的なデータは、この感染モデルは、 リステリア・モノサイトゲネスおよびこの感染からマウスの生存に対するIFN-γ応答の特定の薬剤の効果を試験するために使用することができる方法を説明するために提供されます。

概要

IFN-γは、細胞内病原体に対する免疫を媒介するため、腫瘍の成長5を制御するために重要であるサイトカインです。耐性菌におけるこのサイトカインの重要性は、IFN-γシグナル伝達経路に変異を有する人間観察に明らかであるマイコバクテリアやサルモネラ菌6での感染を非常に受けやすいです。同様に、マイコバクテリア7-9とL.を含む他の細胞内病原体に対するIFN-γまたは抵抗のIFN-γ受容体展示欠陥のいずれかを欠損したマウスは、10,11、 リーシュマニア 12、 ネズミチフス菌 13、および特定のウイルス11 モノ サイトゲネス 。病原体に対抗することに加えて、IFN-γは、腫瘍14に対する宿主防御に重要な役割を果たしています。 IFN-γの高い生産は、感染または癌の文脈において有益であるが、このサイトカインの持続的生産はトンをリンクされています全身性自己免疫15-17と非肥満糖尿病マウスモデル18におけるI型糖尿病の加速の開発O。

IFN-γの主要な源は、NK細胞、NKT細胞、γδT細胞、Tヘルパー1（Th1）細胞、および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）5,19,20を含みます。 IFN-γは、によって先天性および適応免疫の両方を増強する：（1）アップレギュレート（3）強化マクロファージ、（2）抗原提示細胞上の共刺激分子の発現を増加させる、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびII発現を食作用および炎症性サイトカインの産生および殺菌因子（ 例えば 、一酸化窒素および活性酸素種）、（4）（5）（免疫グロブリン抗体のクラススイッチを促進するTh1エフェクター細胞へのナイーブCD4 + T細胞の分化を促進します（）マウスにおけるIg）図2aおよびIgG3、（6）は、iの部位に免疫細胞を動員するケモカインの産生を誘導しますnfection、及び（7）NK細胞およびCTL応答5,19を高めます。病原体および腫瘍に対する宿主応答におけるIFN-γの決定的な重要性を考えると、組換えIFN-γは（19件）様々な感染症や悪性腫瘍の治療薬として試験されています。 IFN-γまたはのTh1促進サイトカインインターロイキン-12（IL-12）の全身投与は、副作用および用量関連毒性19,21に関連付けられているためしかし、によりIFN-γ産生を増加するための代替戦略を開発することに関心があります免疫細胞。新しい生物製剤と小分子の開発は、このような薬剤は、免疫応答の間に、これは、このような動物の生存の増加などの意味のある生物学的作用に変換するかどうかのIFN-γ産生を増加させるかどうかをテストするためにin vivoでスクリーニングツールが必要です。

グラム陽性細菌リステリア菌によるマウスの実験的感染は、のために尽力したモデルとなっています細胞内病原体1,22に対する宿主免疫におけるIFN-γの役割を解読します。静脈内または腹腔内病原体（IP）によるマウスの感染は、それらが脾臓中のピークの細菌負荷が3と4日の間に発生すると常駐マクロファージおよび肝細胞によって内在なり脾臓および肝臓に細菌の急速な普及につながる後感染1,3,22。 NK細胞によるIFN-γの産生は、マクロファージの活性化及び病原体3に対する早期の抵抗のために重要です。しかし高感染性用量で、IFN-γの産生も病原体のクリアランス23に損害を与える恐れがあります。 NKT細胞は、病原体2,24の初期制御時の脾臓および肝臓におけるIFN-γの供給源であり、この生産は、NK細胞2を含む他の細胞型によってIFN-γ産生を増幅することが示されています。一方、後に作用する適応型Tリンパ球パルティで、CD8 + T細胞cularは、病原体のクリアランスを媒介し、再感染1,4,22に対する保護を提供するために重要です。

この感染モデルは、（1件）いくつかの理由のための研究者にとって魅力となっています。まず、病原体による感染は非常に再現性があり、強力なTh1および細胞性免疫応答を誘導します。第二に、致死感染中に、細菌負荷は、それが容易に測定することができ、肝臓及び脾臓に集中しています。第三に、病原体を安全バイオセーフティーレベル2（BSL2）条件下で取り扱うことができます。第四に、生物とそれが広範囲に特徴づけられている生成する免疫応答。最後に、変異体および遺伝的に改変された株の様々な使用のために利用可能であるが開発されています。

ここで説明するL.のEGD株とC57BL / 6Jマウスの接種のための基本的なプロトコルは25とIFNを測定するためのモノサイトゲネスれる-再γNK、NKT、および適応リンパ球感染後によりsponses。また、致死感染後の脾臓および肝臓における細菌負荷を測定し、病原体の改変LD 50用量での感染後の生存研究を行う方法について説明します。最後に、代表的なデータは、このプロトコルはL.、感染モノサイトゲネスからのIFN-γ応答およびマウス生存に対する新規治療法の効果をスクリーニングするために使用することができる方法を示しています。

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プロトコル

安全性について

このプロトコルは、ライブリステリア菌によるマウスの感染を説明します。病原体は、免疫無防備されていない訓練を受けた者がBSL2条件の下で安全に処理されます。免疫不全の人々がHIVに感染しているか、免疫抑制療法による治療を必要とする慢性疾患を持っている妊婦、高齢者や個人が含まれます。感染したサンプルの処理中に作業員が保護白衣やガウン、手袋、マスク、目の保護具を着用しなければなりません。本明細書に記載される研究は、大学健康ネットワーク（UHN）バイオセーフティー局によって発行された証明書（＃32876）の下BSL2の条件で行いました。感染マウスまたは未使用の組織からの死体は、二重袋詰めし、バイオハザード廃棄物で処分しました。感染マウスからのケージはまた、オートクレーブで除染されました。

倫理声明

マウスは維持され、quaraに感染していましたUHNの動物施設内ntine部屋と動物ケアに関するカナダの理事会によって設定されたガイドラインに従って世話しました。マウスのすべての手順はUHN動物ケア委員会によって承認された動物使用プロトコル＃3214で行いました。倫理的配慮に、死が生存の研究のためのエンドポイントとして使用されませんでした。 L.のためにここに報告された修正されたLD 50用量は、感染がマウスの50％が20％の体重の損失または以下の臨床徴候のうちの少なくとも2つを示すから成って特定のエンドポイントに達しれる用量であると決定されたモノサイトゲネス ：無気力、フリル毛皮、猫背の姿勢、呼吸困難、鈍いまたはくぼんだ目。彼らはUHN施設のガイドラインに従って、二酸化炭素（CO 2）への暴露を介してエンドポイントに達したときに、マウスを安楽死させました。

長期保存用のグリセロールストックの調製

注：この手順は、どのようにグリセロールストックを説明しますL.モノサイトゲネスのEGD株は、元のグリセロールストックから調製されます。エアロゾルを発生する可能性がある手順は、認定安全キャビネット（BSC）内で実行する必要があります。

  1. 細菌増殖のためのブレインハートインフュージョン（BHI）寒天プレートを準備します。この3.8％を加える（w / v）のBHIブロスおよび1.5％寒天（w / v）の二重蒸留H 2 O（のddH 2 O）をオートクレーブの液体。寒天を50℃に冷却した後、1時間BSC中の細菌ペトリ皿（25ミリリットル/皿）に液体を分配し、（明らかに）プレートが乾燥してみましょう。
    注：前のプレートを注ぐに凝固を避けるためにオートクレーブした後、50℃の水浴に転送BHI寒天。逆さまに（上部のメディア側で）使用直前まで4℃で保存BHIプレート。
  2. 液体BHI培地を準備します。このために、のddH 2 Oオートクレーブ内BHIブロス（w / v）の3.8％を混ぜます。
  3. -80°C凍結からEGD株をモノサイトゲネスL.の凍結グリセロールストックを削除しますrと室温に解凍。
  4. BHIプレートの部分を横切って前後に先端を解凍したグリセロールストックに滅菌ピペットチップを浸し、すぐに連勝。これは、プライマリスジです。
  5. （これは二連勝で）90°Cでプレートを回して、新鮮なピペットチップを使用して、最初のスジを通してドラッグして、プレートの次の1/4それを広めます。第三連勝を作るためにもう一度繰り返します。
  6. 逆さまにプレートを回して、37℃で一晩インキュベートします。単一の均一なコロニーをストリークと目に見える16〜24時間の最後のセットで得られるべきです。
  7. 無菌通気50ミリリットルチューブに無菌BHIブロスの10ミリリットルを分注します。滅菌したピペットチップを使用してプレートからリステリア菌の1コロニーを採取し、培養液を接種します。 37°Cが軌道毎分225回転（rpm）での設定で一晩またはOD 600 = 1.0になるまで振盪インキュベーターでの培養をインキュベートします。
    注：ガラスまたは使い捨てナンプラーSTIC三角フラスコ培養菌にも使用することができます。かかわらず使用容器の種類の、それは無菌であることを確認して、排気し、培養物の容量は、細菌の適切な通気を確保するために、容器の全容積の20％を超えないこと。
  8. 1：1の比率で一晩細菌培養液との無菌の100％グリセロールを混合することによって、グリセロールストックを準備します。ストレージのための-80℃の冷凍庫に2ミリリットルの極低温バイアル（500μlの/バイアル）と転送バイアルに細菌/グリセロール混合物を配布します。
    注：ビーズストック方法細菌を保存するためにグリセロールストックの代わりにも使用することができます。この方法により、多孔質マイクロビーズは、 リステリア菌の純粋培養物を接種し、-80℃で保存します。各ビーズは、必要に応じて新鮮な培地に接種するために使用することができます。さらなる情報のための材料リストを参照してください。

デイ文化におけるリステリア菌の成長曲線の2決意

注：この手順では、感染症の研究のためにコロニー形成単位（CFU）を推定するために使用されるリステリア・モノサイトゲネスの成長曲線を生成する方法について説明します。エアロゾルを発生する可能性があるすべてのステップは、認定されたBSC内で実行する必要があります。

  1. 通気50mlのチューブに10ミリリットルのBHI培地にステップ1.7で生成された一晩培養物100μlを取り、（45°の角度で傾斜225rpmで、）振盪インキュベーター中で37℃で成長します。コントロールとして非接種されたチューブを使用してください。
  2. 時間間隔で（1、2、3、4、5、6時間、 等 。）培養物0.5mlのサンプルを取ります。プラスチックキュベット中でBHI培地で1（v / v）の各アリコート1に希釈します。アップピペットとミックスダウンします。分光計を用いて600nmで（OD 600）での光学密度（OD）を測定します。 OD 600 = 1になるまで細菌を培養し続けます。
  3. 同時に、文化の100μlのサンプルを採取し、滅菌1.5ミリリットルMICRに900μlのBHI培地で希釈ocentrifuge管（これは10 -1希釈です）。 5分間、6000×gで細菌を遠心分離し、上清を吸引除去します。
  4. 、BHI培地1ml中にペレットを再懸濁6,000×gで5分間遠心分離し、上清を吸引することにより、二回細菌を洗浄します。 1ミリリットルBHI培地でペレットを再懸濁。 （10 -9〜10 -2）を BHI培地中で、このサンプルの10倍希釈系列を準備します。独立したBHI寒天プレート上に各希釈液100μlのスプレッド。インキュベーター中で37℃で一晩培養します。
  5. 300個のコロニー - 翌日、30の間を持っているプレートを選択します。残りを捨てます。これらのプレート上のコロニーを数えます。 表1は、OD 600 = 0.84採取したアリコートで得られたカウントの例を示しています。この例では、プレートの一方が（ すなわち、10 -6希釈）30との間のコロニー数を有していた- 300 CFU / mlの計算のために使用しました。
    注：大きいとプレートより300コロニーが過密状態が細菌の増殖を妨げることができるので、使用され、またそれが困難な識別と個々のコロニーを列挙することができますされていません。希釈技術や汚染物質の存在下で、小さな誤差が範囲の下端のカウントの精度に大きな影響を与えることができるので、カウント<30を有するプレートも使用されていません。
  6. めっき体積コロニーの数を分割した後、特定の希釈用のCFU / mlの値を得るために希釈係数を掛け。 表1の例では、10 -6希釈でカウントが希釈した培養のためのCFU / mlの値を取得するために0.1ミリリットルによってこの値70分割しました。次いで、希釈していない培養物（7.0×10 8）のCFU / mlの値を得るために希釈係数（10 6）することによって、この値を掛けます。
  7. 成長26の対数期を識別するために、H（x軸）の時間対OD 600（y軸）のプロット。
    注：この成長CURV特定のODの読みに成長したときに、電子は、日間の培養のCFU / mlと推定値を提供します。日培養物を成長させるための目標OD 600として使用することができる増殖の対数期にあるOD 600読み取りを選択します。今接種材料の調製のための培養においてCFUを推定するために使用することができ、これらのデータ（手順3）。

リステリア菌と感染実験のための接種材料の調製

注：この手順は、（手順2で調製）一晩培養物から開始された日の培養物からの感染性接種物の調製を記載します。特に断らない限り、これらの工程の全ては、BSCで行われます。

  1. マウスの数及び研究の実験計画に基づいて、感染のために必要なCFUの数を計算します。無菌通気三角フラスコまたは培養チューブにBHI培地の適切な量を追加します。
    注：CFU細菌のPreparedが行った実験の種類に依存することになります。感染中NKおよびNKT細胞応答を研究するために、各マウスは、細菌の10 5 CFU（手順6）を接種します。感染症に適応T細胞反応を研究または細菌負荷を測定する場合、各マウスは、細菌の2×10 4 CFU（手順8）を接種します。エンドポイントへの生存を勉強している場合、各マウス（雄と雌では1.5×10 5 CFUのための10 5 CFUである、手順9を参照）病原体のLD 50用量を接種されています。
  2. 一晩培養物100μlのBHI培地を含むチューブを接種します。ターゲットOD 600に達するまで37℃で軌道振盪インキュベーター（225 rpm）で培養をインキュベートします。滅菌遠心チューブに培養内容を転送します。
  3. 遠心分離機を用いて6,000×gで5分間ペレット内に遠心細菌。漂白剤を含むトラップフラスコに取り付けられた真空を用いて上清を吸引除去します。
  4. 洗浄は、その間に（6,000×gで5分間）遠心分離し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回ペレット。
  5. 第二の洗浄を吸引し、200μlの体積で各マウスに関心のCFUを提供するために1×PBS中で適切な濃度で細菌を希釈します。
    注：これは、ラボのガラス製品は、リポ多糖などの免疫学的汚染物質を導入することができるので、洗濯細菌のためと接種材料の調製のための滅菌1×PBSの商業的供給源を使用するのが最適です。

リステリア菌によるマウスの4実験感染

注：この手順は、手順3とどのように接種物で配信CFUを確認するにして調製接種物をマウスに感染する方法について説明します。マウスおよび注射の取り扱いは、BSCで行われます。

  1. あなたの実験のためにオスまたはメスC57BL / 6Jマウスの十分な数を注文します。またとして未感染のコントロールを提供するために、マウスを注文。
  2. にマウスを許可します細菌接種前に1週間順化。
    注：動物の輸送に伴うストレスがストレスホルモンの生産とリンパ球27,28での一過性の上昇を誘発することができるためです。
  3. 接種の日に、各マウスのベースライン体重を取得し、実験ノートに記録します。
  4. BSCでは、アップと細菌が均等に分散されていることを確認した後、25 G針を装着した1ミリリットル安全工学シリンジに接種物を200μlを取るために、滅菌ピペットを用いて、ダウン細菌懸濁液を混ぜます。
  5. 準備された接種材料の200μlでマウスの腹腔に注入する（ 例えば 、NK細胞の感染の10 5 CFU、手順6）。この手順については、マウスの肩の周りのたるんだ皮膚をつかむことにより、少ない利き手をマウスに首筋。マウスがよく抑制されることを確認した後、mはちょうど横、下腹部にマウスを注入膀胱を避けるためにidline。
  6. バイオハザードシャープコンテナ内針と注射器を処分。
  7. すべてのマウスが注入されるまで、4.6 - を繰り返して、4.3を繰り返します。 1×PBSで同様の工程を実施する（非感染対照）を注射したマウス。
    注：CFUは、成長曲線に基づく推定値であるので、接種材料の実際のCFUを確認することもお勧めします。あなたは可算個のコロニーをもたらすことを期待（10倍希釈系列を使用して）準備された接種材料の4つの異なる希釈液 - このために、3を準備します。 BHI寒天プレート上に各希釈液の100μLを広げ、37℃で一晩インキュベートします。コロニーをカウントし、手順2で説明したように、実際のCFU / mlで計算します。

免疫学5.準備熱殺菌されたリステリア・モノサイトゲネス

注：エアロゾルを発生させる可能性を持っているすべてのステップがBSC内で実行されます。

  1. OD 600値aまで日の文化を育てます再対数期の範囲内であることに達しました。 1.5ミリリットルのマイクロチューブに文化を分注します。
  2. 細菌を殺すために1時間水浴中で70℃でチューブをインキュベートします。
  3. ステップ3.3と3.4のように、1×PBSで2回細菌を洗ってください。ウシ胎児血清（FCS）を含有する無菌の完全RPMI培地中で再懸濁し、4×10 6 / mlの濃度で（レシピの補足ファイル1を参照されたいです）。アリコートを-80℃で2ミリリットルの無菌極低温バイアルおよびストアに細菌を殺しました。
  4. BHI寒天プレート上に熱殺菌された細菌製剤の100μLを広げ、37℃で一晩インキュベートすることにより、細菌の死を確認してください。
    注：これらの熱殺菌細菌はBHI寒天プレート上で成長している任意のコロニーがある場合は、手順8での培養中のリンパ球を刺激するための準備ができて熱殺害の手順を繰り返す必要があります。

感染時のNKおよびNKT細胞によるIFN-γ応答の6測定

注：この手順では、 リステリア・モノサイトゲネスの10 5 CFUでの感染後24時間で、マウスにおけるNKおよびNKT細胞によるIFN-γ応答を測定する方法を説明します。それは脾臓24でNKおよびNKT細胞による堅牢なIFN-γ応答を誘導するため、この用量が使用されます。 BSCのすべてのステップを実施します。 、細胞生存率を維持するのに役立つ可能な限り氷上で細胞を維持し、氷冷緩衝液を使用します。

  1. リステリア菌の10 5 CFUと手順4で説明したように、マウスを接種します。同時に、非感染対照マウスは、1×PBSの等量をip注射します。
  2. 機関のガイドラインに従ってCO 2吸入により24時間の接種後にマウスを安楽死させます。
  3. その右側に各マウスをうそとスクイーズボトルを使用して、70％エタノールで皮膚を濡らします。
  4. 無菌または滅菌ピンセットとタフカットはさみを使用して、ちょうど肋骨の下の下の皮膚を切開。
  5. ダウンスプレー70％エタノールで露出筋層。脾臓は、筋層（ 図1中の白抜き矢印ヘッド）の下に表示されるはずです。
  6. 無菌または滅菌鉗子と細かいハサミを使用して、脾臓を明らかにするために、筋層を切開。静かにピンセットで脾臓を取得し、結合組織を周囲から離れて脾臓をカットする微細なハサミを使用しています。
  7. 滅菌1×PBSを含む15ミリリットルコニカルチューブに脾臓を置きます。
  8. 滅菌1×PBSで滅菌ペトリ皿をハーフ埋めます。無菌の3ミリリットル注射器の平坦な端を使用して、ペトリ皿に70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して脾臓を解離。
  9. 滅菌10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、きれいな滅菌15ミリリットルコニカルチューブに脾細胞懸濁液を転送します。
  10. 4℃で10分間、335×gで遠心分離サンプル。
  11. 漂白剤を含むトラップフラスコに上清を吸引除去します。指でチューブをフリックするか、下のチューブをドラッグすることで、細胞ペレットを緩め前後に波形表面に沿って（ 例えば、空気の流れは、BSCにベント）。
  12. 各脾臓に塩化アンモニウム - カリウム（ACK）溶解バッファー（レシピの補足ファイル1を参照）1.5 mlで添加することにより溶解赤血球。正確に1分15秒後に、細胞溶解を停止し、1×PBSでチューブを満たします。
  13. ステップ6.10で説明したように遠心分離細胞。吸引した上清および（FACS）緩衝液（2％FCSを含有する滅菌1×PBS）を蛍光活性化細胞選別10mlに細胞ペレットを再懸濁します。
  14. 血球計数器を用いて細胞を数えます。このため、計数のために細胞懸濁液の2つのアリコートを取ります。 （のddH 2 O中0.4％トリパンブルー溶液を希釈することによって作られた0.04％、）トリパンブルーの等量の各細胞懸濁液の15μlのを追加します。負荷血球計数器のチャンバ内に各セル/トリパンブルーサスペンション15μlの（ すなわち 、上部チャンバー内1、下部チャンバー内1）。
  15. 顕微鏡を用いて、内のすべての非青色細胞を数え各チャンバ内の中央グリッドの5大広場（ 図2）。このカウントを取り、10 6 / mlの中の細胞の数を取得するために10で割っ。 図2の例では、カウントが5乗で215細胞です。従って、細胞濃度は、21.5×10 6 / mlです。二つの試料から得られた細胞濃度を平均化します。
  16. 染色、フローサイトメトリーのための96ウェル丸底プレート中のウェル/汚れ当たりの種子1×10 6個の細胞。また、未染色および蛍光マイナス1（FMO）コントロールの細胞に接種することを確認します。 表2に染色パネルサイトメトリー推奨フローを参照してください。
    注：以下の手順のためには、氷の上または4℃で細胞を維持し、蛍光色素が存在する場合にホイルで光から細胞を保護することをお勧めします。マルチチャンネルピペットは、処理を高速化するために96ウェル染色プレートに液体を分配するために使用することができます。ときに細胞ペレットを乱さないように注意してください遠心分離プレートからの上清を吸引します。遠心分離は、プレートアダプターを装着していない場合、染色はまた、FACSチューブ中で行うことができます。この時点でのすべての遠心分離工程は、4℃で5分間、456×gで行われます。
  17. プレートを遠心分離し、その後FACS緩衝液で細胞を2回洗浄します。 1回の洗浄を、各ウェルにFACS緩衝液200μlを添加プレートを遠心分離し、上清を吸引することによって行われます。
  18. 50μl/ウェルの抗マウスCD16 / CD32（精製されたFcブロック）（0.5μgの）を含むFACS緩衝液を加えることによって、ブロッキング工程を実行します。 15分間、4℃で細胞をインキュベートします。上記のように、1×PBSで細胞を1回洗浄します。
  19. 細胞に：（1×PBSで千固定可能な生存性染料が1に希釈）100μlの生存率染料を追加します。 30分間、暗所で4℃（冷蔵庫で）で染色細胞。上記のようにFACS緩衝液で細胞を2回洗浄します。
  20. 2回目の洗浄の後、それぞれのウェルに細胞表面抗体またはテトラマーの100μlを添加トンに従ってO染色のパネルを、 表2に記載します。 30分間、暗所で4℃（冷蔵庫で）で染色細胞。このとき、また、単一の正およびFMOコントロールを染色するための抗体を追加します。
    注：単一陽性対照については、それがパネルに用いられる抗体で染色されたCD4抗体または商業的補償ビーズの様々な蛍光色素のバージョンで染色されているいずれかの使用脾細胞に推奨されます。この染色手順を実施する前に、すべてのFACS抗体染色のための最適濃度を決定するための試験研究で滴定されるべきです。
  21. 上記のようにFACS緩衝液で細胞を2回洗浄した後、4％パラホルムアルデヒド（のddH 2 Oで希釈し、16％パラホルムアルデヒドストック）を50μlでそれらを再懸濁し、室温で10分間インキュベートすることによって細胞を固定。 注意：パラホルムアルデヒドは有毒であり、唯一のドラフト内で処理する必要があります。
  22. 私は、細胞を2回洗浄しますnはFACS緩衝液、間に遠心分離。 FACS緩衝液で細胞を再懸濁します。最大3つの日のために、光から保護し、冷蔵庫に次のステップまたはストアのセルに進みます。
  23. 遠心分離細胞は、間に遠心分離し、上清を除去し、1×透過化/洗浄緩衝液（パーマ/洗浄緩衝液）150μlで細胞を2回洗浄します。 ddH 2 O 9（v / v）のPerm /洗浄緩衝液1を希釈することにより10×ストックから調製されます
  24. 2回目の洗浄の後、パーマ/洗浄緩衝液150μlの中で細胞を再懸濁し、暗所で4℃で15分間インキュベートします。
  25. 遠心分離した細胞は再び、その後、上清を吸引除去します。抗IFN-γを含む1×パーマ/洗浄緩衝液50μl中に細胞を再懸濁し、暗所で4℃で1時間インキュベートします。
  26. 間での遠心分離、1×パーマ/洗浄緩衝液で細胞を2回洗浄します。 FACS緩衝液250μlの中で細胞を再懸濁した後、FACSチューブに細胞を移します。
  27. フローcytometを使用して取得フローサイトメトリーに進みます表2 29に記載の染色パネルに用いた蛍光色素を識別するために設定し、適切なレーザー設定とフィルタを持ってえー。サンプル当たり少なくとも20万イベントと補償コントロールの10,000事象を収集します。
  28. 補償マトリックスを適用し、フローサイトメトリー解析ソフトウェア30を使用してデータを分析します。

ピーク感染時に脾臓および肝臓中の細菌負荷の7.測定

注：特に断りのない限り、すべてのステップは、BSC内で実行されます。

  1. マウスは、手順4に記載の手順を用いて病原体の2×10 4 CFUをip接種します。
  2. 感染後3日目に、滅菌1.5 mlマイクロチューブを用意し、それぞれを含む1×PBS中の氷冷滅菌0.1％トリトンX-100500μlの0.2 - 2mmの酸洗浄滅菌ガラスビーズ - 1.5の0.3グラム。各チューブを秤量します。
    注：ガラスビーズはincuにより酸洗浄し、1時間、マグネチックスターラー上にビーカー中の10％酢酸に〜を除いて。これらのビーズは、その後広く、酸を除去するためのddH 2 Oで洗浄し、空気乾燥され、その後、使用前にオートクレーブ処理されます。
  3. CO 2の暴露によりマウスを安楽死させます。
  4. 臓器の解剖について、解剖ボード上の背中に動物を置き、25 G針を使用してボードにマウスの四肢を固定します。 70％エタノールで湿潤することにより、皮膚を消毒します。
  5. 半ば胸部に鼠径部から皮膚内の正中切開を行い、無菌のタフなカットハサミを使用して、各膝に向かって、それぞれの肘に向かって半ば胸から半ば脚の付け根から。ブラント解剖し、25 G針を使用して開いてピン止め、皮膚をバックに反映。
  6. 70％エタノールでそれを湿潤した後、滅菌細かいハサミは、腹膜壁に正中切開を行い使用して筋肉層を消毒。ピンセットで剣状突起をつかみます。その後、同じ細かいハサミを使用して、剣状突起proceから腹膜壁の削減を行いますちょうど横隔膜下の胸郭次の横方向の各側のssは、肝臓を明らかにしました。
  7. 滅菌はさみを使用して、肝臓の〜100 mgのピースを（すべてのマウスのための同じ葉を使用）を切り出し、予め計量した1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに入れてください。
  8. 優しく脾臓を視覚化するために腹腔の左側にある器官を脇にプッシュするために鉗子を使用してください。静かにピンセットで脾臓を取得し、周囲の結合組織を離れて切断することにより、腹膜腔からそれを解放。
  9. ビーズを含む予め計量した1.5ミリリットルのマイクロチューブに脾臓を置きます。氷を含む漏れ防止容器内の実験室への輸送組織。 mgの組織の重みを決定するために、器官を含む管を再秤量します。
  10. 30ヘルツの周波数で3分間ビーズミルホモジナイザーを用いて管を振盪することによって、組織をホモジナイズします。
    注：それはプロセスへのために適しているとしてビーズミル法が均質化のために好ましいです多数のサンプルを歌い、あまり混乱し、病原体への曝露の可能性を作成します。しかし、自動ホモジナイザーまたは手動ガラス組織ホモジナイザーを代替として使用することができるを2mlオートクレーブ。
  11. （希釈していないから10 -7までの範囲）に至るまで、1×PBS中の0.1％トリトンX-100中でホモジネートの10倍希釈系列を準備します。
  12. 滅菌スプレッダーを使用して（二重に）BHI寒天プレート上にそれぞれ希釈したホモジネート100μlのスプレッド。トランスファープレート37℃のインキュベーターに、一晩インキュベートします。
  13. 残りの部分を破棄し、30および300コロニー/プレートとの間に含まれているプレートを保管してください。各プレート上のコロニーをカウントし、重複したスプレッドのためのコロニーの平均数を決定します。
  14. 以下の式に従ってCFU / mgのを計算します。
    CFU / mgで均質化した組織のmgの重量で割っ準備ホモジネートのミリリットルを乗じたホモジネート、中= CFU / mlです。
    注：たとえば、30 COLの平均場合oniesは0.5ミリリットルで均質化した肝臓の120 mgのピースから調製した10 -2希釈したホモジネート100μlのめっき後に計数した以下のように、計算は次のようになります。
    CFU / mlの= 30コロニー×100（希釈倍率）/ 0.1ミリリットル（ボリュームスプレッド）=3万CFU / mlです。
    CFU / mgで=3万CFU / mlの×0.5 mlのホモジネート/ 120 mgの組織= 125 CFU / mgで。

8. CD4 +およびCD8によるIFN-γ応答にリステリア・モノサイトゲネスの影響+細胞

注：（1）流量：この手順では、2つの方法を使用して適応免疫応答（〜7日間の感染後）のピーク時に採取した脾臓CD4 +およびCD8 + Tエフェクター細胞によるIFN-γ産生を測定する方法を説明しますフローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色により、CD4 +およびCD8 +細胞によるIFN-γを測定するため、及び（2）ELISAは、脾臓細胞によって産生される総IFN-γレベルを測定するために（すべてのT細胞を含みます）。手続きBSC内で実行されます。

  1. 手順4で説明した手順を使用して、病原体の2×10 4 CFUで腹腔に注射することによってマウスに感染。
  2. 7日目感染後に、施設のガイドラインに従ってCO 2吸入によりマウスを安楽死させます。
  3. 滅菌1×PBSを含む15 mlのコニカルチューブ中の脾臓（前述）と場所を解剖。氷を含む漏れのない容器に実験室にチューブを輸送。
  4. 単一細胞懸濁液に脾臓を処理項6に記載のように赤血球を溶解し、次に10％FCSを含有する完全RPMI培地中で細胞を再懸濁。血球計数器を用いて細胞を数えます。
  5. IFN-γ応答の測定のための文化を設定します。このディスペンス細胞について（1の4×10 6ミリリットル /ウェル）と共に24ウェルプレートと同数に（4×10 6または1ミリリットル/ウェル）を解凍熱殺菌されたリステリア・モノサイトゲネスの（手順5で調製） 。 37への転送細胞Cのインキュベーター°。
  6. インキュベーションの20時間後、ウェルにタンパク質輸送阻害剤の0.66μL/ミリリットルを追加し、インキュベーションを継続します。
  7. 四時間後に、市販の酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）キット31を使用して、IFN-γレベルの後に測定するための転送BSCにプレートと（-80℃）培養上清とフリーズの500μLを集めます。その後、滅菌15mlチューブに細胞を集めます。 1×PBSでウェルを洗浄し、回収した細胞と一緒にこの洗浄液をプールします。
  8. 表3に記載の染色のパネルを使用する以外は手順6に記載されるように、CD4 +及びCD8 +細胞のIFN-γのための細胞表面染色および細胞内染色を行います。 （20万イベント/サンプルを収集）取得フローサイトメーターとフローサイトメトリー解析ソフトウェア30を使用してデータ29を分析するために進んでください。

9. リステリア Infec後エンドポイントにマウスの生存を測定しますン

注：この手順は、病原体の変更されたLD 50用量で感染後のエンドポイントにマウスの生存に対する薬剤の効果を説明します。これらのすべての手順は、動物施設におけるBSCで行われています。

  1. これは、10 5 CFU（男性用）または（女性用）1.5×10 5 CFU 31であると決定された手順4に記載のようにマウスがリステリア菌の修正LD 50用量で腹腔注入します。
  2. 臨床徴候1日2回、マウスをフォローし、実験ノートにこれらの徴候や動物の体重を記録します。彼らは20％の体重またはリステリア症の2臨床徴候の損失（無気力、フリル毛皮、猫背の姿勢、呼吸困難、鈍いまたはくぼんだ目）を示す場合、マウスを安楽死させます。
  3. 14日後、CO 2吸入によりマウスを存続安楽死させます。
  4. 時間32に対する各グループの生存率をプロットすることにより、データのカプラン・マイヤープロットを準備します。
    注：マウスは（倫理に関する声明に記載されたエンドポイントを満たす）感染に屈する場合、これは通常、5日目、感染後（ 図7）によって起こります。

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結果

図3は、病原体の10 5 CFUで24時間の感染後に脾臓NK細胞およびNKT細胞におけるIFN-γのいくつかの典型的なフローサイトメトリー染色を提示します。この図はまた、表2に記載の染色パネルのためのゲーティング戦略を示しています。 図4は、雄マウスは、PPARαアンタゴニストIS001や車両制御で処理された10 5 CFU リステリア菌に感染させ、その後、24時間後にNK細胞とNKT細胞におけるIFN-γについて分析した一つの実験で得られたいくつかの代表的なデータを示しています。この図は、IS001を用いた治療は、病原体に感染した後、NK細胞、NKT細胞によるIFN-γ応答をブーストではなく、ことを示しています。 図5は、熱殺菌PAでのex vivoでの再刺激後7日目の脾臓CD4 +およびCD8 <...

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ディスカッション

ここでは、LのEGD株はオスまたはメスC57BL / 6Jマウスに25を モノサイトゲネスでの基本的な感染実験を実施する方法のプロトコルを記述します。このプロトコルは、インビボ 31 に先天性および適応リンパ球によるIFN-γ産生に対する新しい小分子IS001の効果を研究するために設立されました。細菌クリアランスと生存感染後を監視することにより、洞察力は、IFN-γにおけるこれらの変化は、感染を制御するホストの能力に影響を与えたかに得られました。

プロトコルにおける重要な検討事項

研究のこのタイプの設計における重要な考慮点は、各実験が適切給電と適切に制御することです。感染による免疫応答における生物学的変化に（ 図4、図6を参照）、N = 4ことをお勧めします-グループ当たり5匹のマウスは最初の免疫研究のために使用されるべきです。もしFTERデータの傾向が、グループ間で明らかな有意差があ...

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開示事項

開示する利益相反はありません。

謝辞

このプロトコルの開発は、CIHR(MOP97807)からSEDへの運営助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブレインハートインフュージョンブロス、修正BD299070ブランドが適切であるべきです
天BD214010ブランドが適切であるべきです
Triton X-100Sigma-AldrichX100任意のブランドが適切であるべきです
1x PBSシグマD8537ブランドが適切であるべきです
TissueLyser IIQiagen85300
塩化アンモニウム(NH3Cl)どのブランドも適切であるべきです
KHCO3どのブランドも適切であるべきです
Na2EDTAどのブランドも適切であるべきです
RPMI 1640Gibco22400089どのブランドも適切でなければなりません
ウシ胎児血清 Gibco12483前に、56°Cで熱不活性化してください。C 30分間
L-グルタミンGibco25030任意のブランドが適切であるべきです
非必須アミノ酸Gibco11140任意のブランドは適切であるべきです
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140どのブランドも適切であるべきです
GolgiStop タンパク質輸送阻害剤 (モネンシンを含む)BD5547244 μl 6 mL 細胞培養
16% パラホルマルデヒ電子顕微鏡法 Sciences15710ddH2O または 1x PBS
10x Perm/Wash バッファーBD554723ddH2O
Fc ブロック、抗マウス CD16/CD32 精製eBioscience14-0161希釈 1:50
固定可能な生存率 色素 eFluor 506eBioscience65-0866希釈 1:1,000 (分子プローブからの生存率染料も使用しています)
抗マウス CD4-PE-Cy5 (GK1.5)eBioscience15-0041メーカーは特定のテストサイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。
抗マウスCD8-FITC (53-6.7)eBioscience11-0081メーカーは特定の試験サイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。
PBS57/mCD1d tetramer-APCNIH Tetramer CoreFacility N/A施設からの贈り物として入手
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)eBioscience25-5961メーカーは、特定のテストサイズを推奨しています。ただし、これは使用前に滴定する必要があります。
抗マウス NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)eBioscience47-3351メーカーは一定の試験サイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。
抗マウスCD45 PE-シアニン7 (30-F11)eBioscience25-0451製造業者は特定の試験サイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。
抗マウスIFNガンマ-PE(XMG1.2)eBioscience12-7311メーカーは特定のテストサイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。
OneComp eBeadseBioscience01-1111染色ごとに1滴使用
マウスIFNガンマELISAキットeBioscience88-7314培養上清中のインターフェロンガンマの測定に使用
培養用細菌の培養に使用され、どのブランドも適切であるべきです
1.5mlの微量遠心チューブは適切であるべきです
細菌性ペトリ皿任意のブランドは適切であるべきです
2 mL cyrovials任意のブランドは適切であるべきです
UV 分光計任意のブランドは適切であるべきです
安全設計された針任意のブランドは適切であるべきです
C57BL/6Jジャクソン研究所Stock#000664注文7週間での到着
漂白剤除染用
70% エタノール除染用
ガラスビーズどのブランドも適切であるべきです
遠心分離機のローター、バケツ、バケツカバー。
微量遠心分離機任意のブランドは適切であるべきです
滅菌グリセロール任意のブランドは適切であるべきです
ピペットのヒントどのブランドも適切であるべきです
ピペットは適切であるべきです
手術器具どのブランドも適切であるべきです
70ミクロンストレーナー任意のブランドは適切であるべきです
3 mlシリンジどのブランドも適切であるべきです
ピペットガンどのブランドも適切であるべきです
ろ過ユニットどのブランドも適切であるべきです
トリパンブルー1 から 9 を ddH2O で希釈します、どのブランドも適切であるべきです
血球計算盤任意のブランドが適切であるべき
丸底プレートどのブランドも適切であるべき
FACs チューブフィッシャーサイエンティフィック14-959-5
BD LSR IIBD任意のフローサイトメーターは、フルオロコルムスを区別するために適切なレーザー構成とフィルターセットを持つ取得に使用できます
FlowjoソフトウェアTreestarデータ分析に使用されます。他のタイプのデータ分析ソフトウェアも適切です
マルチチャンネルピペッター(0-300 µl)エッペンドルフフローサイトメトリー染色中の細胞洗浄および抗体添加に使用
酢酸ガラスビーズの洗浄に使用され、どのブランドも適切であるべきです
マイクロバンク 細菌保存システムプロラボ診断細菌の長期保存のためのグリセロールストックの代替として使用されます
任意の寒任意の任意の使用中 50mlのベントチューブ

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