ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1型に感染した、または感染していない生細胞の細胞中心に向かって移動するファゴソームの速度を測定する方法を、蛍光感染細胞を特定するためのスピニングディスク共焦点蛍光顕微鏡とファゴソームを検出するための明視野顕微鏡を用いて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
マクロファージは、自然免疫と特異的免疫の交差点で主要な役割を果たす食細胞です。それらはヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1に感染する可能性があり、その細胞変性効果に対する耐性のために、持続的なウイルス貯蔵庫と見なすことができます。さらに、HIVに感染したマクロファージは、日和見疾患の発症に寄与する欠陥のある機能を示します。
HIV-1がマクロファージの食作用反応を損なう正確なメカニズムは不明でした。私たちは以前に、マクロファージがHIV-1に感染すると、マクロファージによるさまざまな粒子状物質の取り込みが阻害されることを示しました。この阻害は部分的なものに過ぎず、HIVに感染したマクロファージ内でファゴソームが形成されました。そこで、これらのファゴソームの運命を解析することに着目しました。ファゴソームの成熟は、これらのコンパートメントの細胞中心への移動を伴い、そこでリソソームと融合してファゴリソソームを生成し、摂取された物質の分解に関与します。私たちは、食作用の標的としてIgGオプソニン化ヒツジ赤血球を使用しました。個々のHIV感染マクロファージにおけるファゴソームの求心運動の速度を測定するために、明視野と蛍光共焦点顕微鏡の組み合わせを使用しました。私たちは、ファゴソームが核に向かう距離を計算し、次にファゴソームの速度を計算する方法を確立しました。HIV感染細胞はGFP発現ウイルスによって同定されましたが、この方法は非感染細胞やあらゆる種類の感染や治療に適用できます。
概要
マクロファージは、自然免疫系と恒常性において主要な役割を果たします。それらは、食作用1,2と呼ばれるプロセスによって病原体や破片を内在化して排除するプロの食細胞です。ファゴソームは、粒子状物質の飲み込み後に形成される閉じたコンパートメントであり、エンドサイトーシスコンパートメントとの一連の融合および分裂イベントを経験し、ファゴリソソームと呼ばれる分解コンパートメントにつながります。このコンパートメントは、プロトンポンピングv-ATPアーゼの獲得により酸性のpHを持ち、加水分解酵素を含み、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)が豊富です。ファゴソームの成熟は、微小管3,4上を細胞中心に向かって移動し、リソソームが蓄積する核周囲の位置に到達することを伴います。
多くの病原体がファゴソームの成熟を乗っ取ると報告されており、その中には、彼らが居住する液胞環境を変化させる細胞内生活様式を持つ細菌も含まれます5。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1は、T細胞に加えてマクロファージを標的としています。マクロファージは、T細胞とは異なり、ウイルスの細胞変性作用に耐性があるため、ウイルスの貯蔵庫と見なすことができます。さらに、HIV-1に感染したマクロファージは食作用機能に欠陥があり、日和見性疾患の出現に寄与します。特に、サルモネラ菌Typhimurium ST313によって引き起こされる重篤な侵襲性非腸チフス性....
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プロトコル
プロトコルは、国内および国際的な法律や地方条例に厳密に従って行わなければなりません。研究目的のために献血をする彼らの同意を与えた健康なドナーからの血液は、機関が契約を締結していると輸血センターから得られています。ヒトの血液を使用した場合には、特別な保護がとられなければなりません。 HIV-1を用いた実験では現地の法律に従って、バイオセーフティーレベル3または2（BSL-3または2）実験室で行われなければなりません。
接着によって密度勾配遠心と選択によるヒト単球由来マクロファージ（hMDMs）の調製
- 健康なドナー（9ミリリットル）からの新鮮な血液で起動します。 70 mlの最終容積を得ることが2+ の Ca 2+およびMgなしの滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、新鮮な血液の全体積を希釈し、穏やかに（50ml×2回）コニカルチューブ（チューブにつき35 mL）に希釈された血液を追加、の15ミリリットルの上eutralは、非常に各チューブに既に溶液中に、高質量の親水性多糖分岐します。
- ブレーキなしで20℃で20分間、537×gでの血液の遠心分離は、両方の管。次に界面で濁ったセル環に 含まれる末梢血単核細胞（PBMC）を収集およびCa 2+及びMg 2+なしで、1×PBS 15 mlを含む新しい50mlチューブに移しま....
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結果
HIV-1感染および非感染hMDMsによる食作用をのFcR媒介性は、モデル標的としてのIgGオプソニン化SRBCを（ 図1）を使用してここで説明されています。このプロトコルの重要なステップは、hMDMsの準備とHIV-1の感染です。確かに、分化したマクロファージの収量と品質は、ドナーの間で変化するだけでなく、10から40%の範囲の効率で感染率。これは破片としての代わりに、FcRを媒介食作用によってそれらの認識および取り込みを誘導する可能性があるためまた、IgGのオプソニン化-SRBCをの製造は、赤血球の損傷を避けるためにも重要です。最適なオプソニンは、効率的な食作用を保証します。
HIVに感染したマクロファージの生活におけるファゴソームの動きは、BSL-3実験室でのスピニングディスク共焦点顕微鏡上のBFチャネルとリアルタイムで分析されます。 BFチャネルの設定は重要なトンですO核（ 図2、
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ディスカッション
この技術は、いくつかの重要なステップがあります。感染の割合がドナー依存しているため、まず、HIV-1によるhMDMsの製造およびそれらの感染が重要です。注目すべきは、我々は潜在的に生体内でウイルスが遭遇したマクロファージの状態がよく、これまでに特徴付けされていないため、感染前に、in vitroで偏光されていないマクロファージを使用することを決定しました。我々は、マクロファージは、M1やM2でもないことを示す、いくつかの表面マーカーの発現を調べ、CD4およびCCR5の発現を検証しました。感染率が可変と10〜40％の範囲、時には低いです。顕微鏡下でHIV-1感染蛍光hMDMを見つけることは困難であることができる理由は、この変数感染率です。加えて、遠心工程の直後にHIV-1感染細胞を見つけるために必要な時間も取得開始の遅延をもたらすことができます。食作用はsynchronizatioなしで開始することができました結合し、遠心分離により生成された取り込みのn個。ただし、このオプションは、細胞に到達する前にフロートSRBCをするように選択していません。これは、ビーズとの良好な選択肢である可能性があります。感染.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
原稿を読んでくださったジャミル・ジュブレール博士に感謝します。本研究は、CNRS、Inserm、パリ・デカルト大学、Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02)、Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518、GLBの博士フェローシップを含む)、Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS、CDのポスドクフェローシップを含む)からの助成金を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ファルコン 100 mm TC処理細胞培養ディッシュ | コーニング | 353003 | ウイルス生産用 |
| ガラスボトムディッシュ 35 mm コーティングなし 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C ケース | 取得用 |
| ファルコン組織培養プレート 6ウェル | サーモフィッシャー サイエンティフィ | コーニング 353934 | ヒト単球由来マクロファージ用 |
| フィコールプラーク PLUS | ドミニクDutscher | 17-1440-03 | 密度遠心分離用溶液中の中性、高分岐、高質量、親水性多糖類 |
| DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ;HEK細胞培養 |
| 用RPMI 1640培地GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | 4°Cで保存。C;hMDMsの文化 |
| Fœタルカーフセラム(FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | -20 °C ;非補完ペ |
| ニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | -20 °Cで保存;C ;hMDMsの文化 |
| RPMI 1640媒体、フェノール赤無し(10x 500 ml) | 生命技術 | 11835-105 | 37 >Cウォーターバス使用前;食作用アッセイ用 |
| FuGENE6 トランスフェクション試薬 | Promega | E2692 | 4 °C で保存;C ;ウイルス産生用 |
| ヒツジ赤血球 (SRBC) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Alsever バッファーに 4 °C で保存;C 使用前の |
| 抗羊赤血球 IgG | MP Biomedicals | 55806 | 4 °C で保存;C |
| ウシ血清アルブミン熱ショック画分、pH 7、≥98% | シグマ | A7906 | は -20 °C で保存。C |
| 倒立顕微鏡 DMI600 | ライカ | ||
| 共焦点スピニングディスクユニット CSU-X1M1 | 横河 | ||
| 491 nm 50 mW レーザー | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | ライカ | 対物レンズ ;倍率100倍。開口数1.40;イマージョンオイル | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) カメラ | フォトメトリクス | ピクセルサイズ 6.45 & マイクロ;メートル x 6.45 & マイクロ;m ;定義 1,392 x 1,040 ;14ビット | |
| メタモルフ7.7.5ソフトウェア | 分子デバイス | 顕微鏡GraphPad | |
| プリズムソフトウェアの | 統計分析用 |
参考文献
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F.
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再版と許可
