HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

マクロファージは、自然免疫系と恒常性において主要な役割を果たします。それらは、食作用^1,2と呼ばれるプロセスによって病原体や破片を内在化して排除するプロの食細胞です。ファゴソームは、粒子状物質の飲み込み後に形成される閉じたコンパートメントであり、エンドサイトーシスコンパートメントとの一連の融合および分裂イベントを経験し、ファゴリソソームと呼ばれる分解コンパートメントにつながります。このコンパートメントは、プロトンポンピングv-ATPアーゼの獲得により酸性のpHを持ち、加水分解酵素を含み、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)が豊富です。ファゴソームの成熟は、微小管^3,4上を細胞中心に向かって移動し、リソソームが蓄積する核周囲の位置に到達することを伴います。

多くの病原体がファゴソームの成熟を乗っ取ると報告されており、その中には、^{彼らが居住する}液胞環境を変化させる細胞内生活様式を持つ細菌も含まれます5。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1は、T細胞に加えてマクロファージを標的としています。マクロファージは、T細胞とは異なり、ウイルスの細胞変性作用に耐性があるため、ウイルスの貯蔵庫と見なすことができます。さらに、HIV-1に感染したマクロファージは食作用機能に欠陥があり、日和見性疾患の出現に寄与します。特に、サルモネラ菌Typhimurium ST313によって引き起こされる重篤な侵襲性非腸チフス性サルモネラ症は、過去30年間、HIV6に感染したサハラ以南のアフリカの子供または成人に蔓延しています。結核を発症するリスクは、HIV感染者の方がHIV感染者よりも20倍以上高いと推定されています。

これらすべての理由から、HIV感染マクロファージの食作用欠陥の根底にある分子メカニズムをより明確に定義することが重要です。我々は、粒子状物質、オプソニン化粒子、細菌または真菌の取り込みが、HIV感染マクロ^{ファージにおいて}阻害されることを示した7。この阻害が部分的であることを考えると、HIVに感染したヒトマクロファージ⁸の内在化ファゴソームの運命の解析に着手した。ファゴソームの成熟は、細胞中心への移動およびリソソームとの融合と密接に関連しているため、ファゴソームの成熟の欠陥は、感染細胞内の輸送モダリティの変更が原因である可能性があります。ここで説明する方法は、受容体介在性食作用、特に免疫グロブリン(FcR)のFc部分の受容体を標的とするモデルとして、IgGオプソニン化ヒツジ赤血球(IgG-SRBC)を使用します。これらの粒子は、細胞外SRBCと細胞内SRBCが異なる屈折特性を示すため、ラテックスビーズよりも明視野(BF)でイメージングが容易です⁹。HIV感染マクロファージにおいて核に向かって移動するファゴソームの速度を測定するために、我々は蛍光ウイルス¹⁰を使用し、ここで説明する簡単な手動追跡法を設定した。この方法は高度なプログラミングを必要とせず、ImageJを使用するだけです。付着細胞や、明視野顕微鏡や蛍光イメージングで視覚化できるあらゆるタイプの粒子や病原体に適しています。

プロトコルは、国内および国際的な法律や地方条例に厳密に従って行わなければなりません。研究目的のために献血をする彼らの同意を与えた健康なドナーからの血液は、機関が契約を締結していると輸血センターから得られています。ヒトの血液を使用した場合には、特別な保護がとられなければなりません。 HIV-1を用いた実験では現地の法律に従って、バイオセーフティーレベル3または2（BSL-3または2）実験室で行われなければなりません。

接着によって密度勾配遠心と選択によるヒト単球由来マクロファージ（hMDMs）の調製

1. 健康なドナー（9ミリリットル）からの新鮮な血液で起動します。 70 mlの最終容積を得ることが^{2+ の} Ca ²⁺およびMgなしの滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、新鮮な血液の全体積を希釈し、穏やかに（50ml×2回）コニカルチューブ（チューブにつき35 mL）に希釈された血液を追加、の15ミリリットルの上eutralは、非常に各チューブに既に​​溶液中に、高質量の親水性多糖分岐します。
2. ブレーキなしで20℃で20分間、537×gでの血液の遠心分離は、両方の管。次に界面で濁ったセル環に ​​含まれる末梢血単核細胞（PBMC）を収集およびCa ²⁺及びMg ²⁺なしで、1×PBS 15 mlを含む新しい50mlチューブに移します。
3. 遠心分離機20℃で5分間、218×gで細胞およびCa ²⁺およびMgなしで1×PBSの45ミリリットル中にペレットを再懸濁^2+。
4. 20℃で5分間、218×gで遠心分離した細胞は^{、2+ の} Ca ²⁺およびMgなしで1×PBS 10mlにペレットを再懸濁し、トリパンブルーで1/200の最終希釈に希釈することによって細胞をカウントします。
5. 20℃で5分間、218×gで細胞を遠心し、1640培地は、2mMのL-グルタミンおよび100μg/ mlのpenicを補充したRPMI（ロズウェルパーク記念研究所）でペレットを再懸濁illin -ストレプトマイシン6ウェルプレートの各ウェルに培地2ml中、ウェルあたり7×10 ^6個のPBMCを有すること。
6. 2時間、5％CO _2、37℃でプレートをインキュベートします。 2時間後、単球をプラスチックに付着しているでしょう。
7. 新たに単離した単球が、hMDMsに分化培地を吸引し、2mlでhMDM培地に交換できるようにする（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清（FCS）、2mM L-グルタミンおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンをdecomplemented）を補充し組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（RHM-CSF）を10ng / mlの最終濃度で。
8. 11日目（ 図1）、5％CO ₂で37℃で細胞をインキュベートします。
9. 11日目で培地を除去し、ウェルあたり冷たいhMDM培地2mlで2回洗浄します。次の冷1×PBS 1mlで各ウェルを2回洗浄します。
10. （2 mMのethylenediaminetetraacetatic酸と冷たい1×PBSの1ミリリットルで、各ウェル1時間を洗って、完全に分化しhMDMsを切り離すにはEDTA）と4℃で15から60分間、ウェルあたり2 mMのEDTA冷1×PBSの2ミリリットルで細胞をインキュベートします。
    注：細胞が存在して剥離する別の方法（ 例えば、トリプシンまたはトリプシン様活性）良い結果^11を与えるかもしれません。
11. （上下十分で静かにピペッティングすることにより完成）剥離した後、細胞を回収し、冷hMDM培地10mlを含む氷上で50mlチューブに入れ。
12. 20℃で5分間、218×gで遠心分離した細胞は、冷たいhMDM培地10mlにペレットを再懸濁し、トリパンブルーで1/20に希釈することによって細胞をカウントします。
13. 35ミリメートル顕微鏡グレードのガラスボトムディッシュあたり1×10 ⁶ hMDMsで細胞をシードし、1日間、5％CO ₂で37℃で培養します。

HIV-1ウイルスストックの2生産および定量

注：M. SchindlからR5向性エンベロープを運ぶNLR4.3 HIV-1のGag-iGFP（緑色蛍光タンパク質）、ギフトER ^10は、マクロファージを感染させるために、リアルタイムで感染細胞を見るために使用されます。

1. 商業トランスフェクション試薬を用いて対応するプロウイルスDNAの6μgの持つヒト胚性腎臓293T細胞（2×10 ⁶ 100 mmディッシュ）のトランスフェクションによりウイルスストックを生成します。
2. 細胞計数のβ-ガラクトシダーゼ着色が続くウイルスストックの連続希釈液を用いて、（HIV-1 LTRの制御下でβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を有する）HeLa細胞TZM-BL指標細胞を用いたウイルスストックの感染力を定量化¹²青色の細胞の。

HIV-1とhMDMs 3.感染

1. hMDMs（1.13でプレートした細胞）に感染多重度（MOI）hMDM培地の1ミリリットル中に0.02から0.03でウイルスを追加します。ウェルはhMDM媒体の唯一の1ミリリットルを追加制御し、2日間（ 図1）、5％CO _2、37℃で皿をインキュベートします。
2. 2日目にhMDM MEDで細胞を洗浄イウム3回と皿当たり新鮮hMDM培地の1ミリリットルを追加します。 6日目（ 図1）、5％CO ₂で37℃で細胞をインキュベートします。

ヒツジ赤血球の4オプソニン

1. 皿当たり7×10 ⁶ SRBCをの調製のために、4分間600×gで遠心分離すると、1×PBS中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む溶液100μlにSRBCを2回洗浄します。
2. SRBCを5μlの当たりのサブ凝集濃度でウサギのIgG抗SRBCを含むPBS / BSA 0.1％、1×500μlの洗浄SRBCをを再懸濁し、室温で30分間回転させながらインキュベートします。
   注：、抗SRBCをIgGのサブ凝集濃度を決定し、96ウェルプレート中の20μlの1/50から1/25600へのIgGの連続希釈物（13.1 mg / mlとでストック濃度）を調製しました。各ウェル中の20μlの2×10 ⁶ SRBCを追加し、いくつかの時間の間、暗い部屋でプレートを置きます。サブ凝集濃度であります直前よく凝集抗体（IgG + SRBCを、ネットワークを形成する）とウェルの希釈。
3. 回転の後、4分間600×gでのIgGオプソニン化-SRBCをを遠心分離し、4分間、600×gの遠心分離で1×PBS / BSA 0.1％の100μlで洗います。
4. 2mMのL-グルタミンおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（1ミリリットル/皿）を補充した予め温めたフェノールレッドを含まないRPMI培地中のIgGオプソニン化-SRBCを再懸濁。

5.ライブセルビデオ顕微鏡食作用アッセイ

1. 例えばCO _2は、加湿のために水でボトルを通過し、37℃で加熱室を備えた回転ディスクシステムのような共焦点イメージングシステムを使用してください。
2. 食作用アッセイの開始前に37℃で顕微鏡ステージを持つように、実験前に加熱室をオンにします。顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、およびイメージングソフトウェアをロードします。
3. このような走査速度、マニフィカ等の撮像設定を最適化イオン、解像度等が 60〜120分の間、毎分ごとにフィールドと、一つのフレーム画像に、少なくとも一つのセルを持っています。
   注：ここでは、サンプルは63Xレンズと60分の間に1フレーム分毎に結像されます。
4. 顕微鏡ステージ上のイメージング皿を置きます。フィールドに一つだけの全体のHIV-1感染したマクロファージを見つけるために、フォーカスと位置を調整します。使用される撮像システムとプローブに基づいて適切な励起/発光の設定を使用します。ファゴソームを観察する明視野（BF）のチャンネルを含める（ 図1II）。透過光及び露光時間の割合を調整することにより、異なるチャネルの画像の外観を最適化します。
   注：ここでは、NLR4.3 HIV-1のGag-iGFPは、レーザの20％（ 図1I）で長時間露光の50ミリ秒と491 nmのレーザーを使用して興奮していました。
5. イメージング皿を外し、皿（ 図1）に7×10 ⁶ SRBCを/ mlでSRBC懸濁液1mlを追加します。
6. 500×gで遠心分離RTで2分間は、食作用を同期この遠心分離の終わりに時間を記録し、ステージに皿を返します。
7. フォーカスを最適化し、（0.3ミクロンのステップ距離とセルの厚さを通して - 通常20面）のZスタックにGFPとBF画像を取り込む少なくとも1時間、毎分。使用される撮像システムのネイティブファイル形式でタイムラプスビデオを保存します。
   注：ここでは、タイムラプス動画は、ネイティブ形式、* .STKファイルに保存されていました。

タイムラプスビデオの6.分析

1. ビデオ編集ソフトの「レビュー多次元データ」ビデオ編集のために、ドロップダウンメニューをクリックして「アプリ」タブ上。
   1. ファイルを開くには、「ディレクトリの選択」にし、「ベースファイルを選択」をクリックしてください。 「データ設定」ボックスで、（.nd形式）を分析し、「表示」をクリックして取得を選択します。データが列ANに時間を持つテーブルで表現されています行中のd Z-計画。
   2. Z-突起（ 図2、左パネル）に感染を表すために、「波長」ボックスに491 nmの波長を選択し、「すべての面」と「Z投影」タブをクリックします。
   3. （、時系列を分析する「波長」ボックスにBF波長を選択して、外部のSRBCを（ 図2、赤矢印）、内部SRBCを（ 図2、赤い円）と核を区別するために、Z軸上での最適な平面を選択するには図2、青丸）。
   4. ビデオモンタージュを保存するには、「選択[Xの]」タブで、次に「イメージのロード（S）」をクリックしてください。最後に、tifファイル形式で読み込んだ画像を保存し、ImageJソフトウェア上で次のそれらを開きます。
2. 核の位置とBFチャネル（ 図3）で観察された異なるファゴソームを測定するためにImageJソフトウェア上のプラグイン「マニュアルトラッキング"を使用してください。
   1. ダウImageJのウェブサイトの「マニュアルトラッキング」プラグインをnload。 ImageJのでは、解析すべきプラグインと画像シーケンス（ 図3、ステップ1および2）を開きます。
   2. このような隣接するフレーム間の時間の量を表す「時間間隔」、および画素あたりの距離を表す「X / Yのキャリブレーション」（ 図3、ステップ3）などの設定を入力します。
      注：6.45のx 6.45μmの²のピクセルサイズを持つ63Xズームとカメラが使用されているので、ここでは、各フレームと0.205ミクロンのX / Yのキャリブレーションの間に1分の時間間隔で画像シーケンスを保存します。
   3. 追跡を開始するには、「トラックを追加」（ 図3、ステップ4）をクリックして、それが内在化される最初の時間でSRBCの中心をクリックしてください。次のフレームが自動的に表示されます。
   4. 時間の間に位置が異なるために、すべてのフレームでSRBC中央をクリックし続けます（ 図3、赤いボックスのステップ6）。
      1. その中心をクリックして、すべてのフレームでの地位を持っている核を追跡するために開始します。次回SRBCをの関数で異なるそれらの内在化（フレーム）で1ずつ（その中心をクリックして）ファゴソームを追跡します。 BFチャネルでSRBCを参照するには便宜上、トラッキング（ 図3、ステップ5）の間に「明るさとコントラスト」ウィンドウを使用します。
   5. 各SRBC追跡の間に、新しいトラックを持っている（ 図3、ステップ4）、「トラックを追加」をクリックしてください。追跡の数が第2の列に変更されます、結果テーブルの「トラックのn°」（ 図3、ステップ6）。
   6. 分析の次のステップに進み、スプレッドシート内のデータを保存します。
3. （核とSRBCをの内在化後の最初の5分の間にファゴソームの速度に向かってSRBCを含有ファゴソームの走行距離を計算するためFiを提供して表計算ソフトを使用して、グレ4）。
   1. スプレッドシートテーブルと新しいスプレッドシートファイルを開きます。この新たな次のパラメータファイルのみ、時間、x軸に移し、核およびすべてのSRBCを（ 図4A）のy座標。
   2. SRBCをのみそれらの座標と核の間の距離を計算するために、核とXY座標平面（ 図4B）でSRBCを検討してください。
      注：2点間の距離は、それらを接続する経路の長さです。平面では、SRBCと核との間の距離は、ピタゴラスの定理により与えられます。
      1. C（核とSRBCとの間の距離）を斜辺とAの長さを示し、B、他の2辺の長さを表す場合は、ピタゴラスの式のようにピタゴラスの定理を表現します：
         
         注：同時に、正規直交上、水平距離（X _核 -x _SRBC）であり、垂直距離bは _（SRBC -y Y _核 ）です。
      2. このように、核とSRBC（ 図4A、紫色のボックス）によるとの間の距離を計算します。
         
         注：μm単位の距離を持っているのx / yのキャリブレーションによって（ピクセル単位）得られた距離値を乗算します。ここで、X / Yのキャリブレーションは0.205μmです。
      3. 各時点で、核および初期距離（ 図4C）にSRBCとの間の距離を引きます。
      4. 最初の5分間の時間に対する測定値をプロットします。プロットに線形トレンドライン（ 図5A）を適用し、SRBC内在化後の最初の5分の間に核に向かってファゴソーム速度を表す線形トレンドラインの傾きを決定します。
      5. の平均値と統計誤差を計算するためにデータを照合速度値と適切なソフトウェア（ 図5B）を使用して、適切な形式でそれらをプロットします。

HIV-1感染および非感染hMDMsによる食作用をのFcR媒介性は、モデル標的としてのIgGオプソニン化SRBCを（ 図1）を使用してここで説明されています。このプロトコルの重要なステップは、hMDMsの準備とHIV-1の感染です。確かに、分化したマクロファージの収量と品質は、ドナーの間で変化するだけでなく、10から40%の範囲の効率で感染率。これは破片としての代わりに、FcRを媒介食作用によってそれらの認識および取り込みを誘導する可能性があるためまた、IgGのオプソニン化-SRBCをの製造は、赤血球の損傷を避けるためにも重要です。最適なオプソニンは、効率的な食作用を保証します。

HIVに感染したマクロファージの生活におけるファゴソームの動きは、BSL-3実験室でのスピニングディスク共焦点顕微鏡上のBFチャネルとリアルタイムで分析されます。 BFチャネルの設定は重要なトンですO核（ 図2、青い円）を参照し、内在化SRBCを（ 図2、赤い丸）から外部（ 図2、赤矢じり）を識別するため。 BF顕微鏡は、外部SRBCをより小さい屈折性​​であるファゴソームを参照するのに十分な最も単純な光学顕微鏡の照明技術として考えられています。

画像シーケンスの取得後の最初のステップは、ImageJソフトウェア（ 図3）での手動トラッキングです。この点は、各ファゴソームを追跡することが好ましいので、特に長くて面倒なすべての画像シーケンスに対して1つずつ、それは実験がために十分に大きなサンプルサイズに到達する条件あたり少なくとも3人のドナーで繰り返す必要があると考えられることができます統計分析（3人の異なるドナーを有する少なくとも30ファゴソーム）。

第二段階は、分析であります表計算ソフトの各内在SRBCを（ 図4）のための内在化後の最初の5分間、ファゴソームの速度を算出します。このために、我々は、距離は、時間に対する最初の5分の間に移動し、各ファゴソームのためにプロットします。代表的な例は 、 図5Aの非感染hMDMsに示されています。次に、線形回帰曲線の傾きであるファゴソームの速度を求めます。 0.5384ミクロン/分の速度は、このファゴソームが見つかりました。

注目すべきは、ここまたはデュマら 8に記載されているように、または後でより長い時間スケールにわたって速度を分析することによって、内部移行後の最初の数分の間ファゴソーム速度を分析することが可能です。私たちの研究では、HIV感染hMDMsで内在化後の最初の5分の間にファゴソーム速度は非感染hMDMs（ 図5B）に比べて低くなっていることを観察しました。

中図2のリアルタイム取得図1で説明したように代表的な制御およびHIV感染hMDMsによる食作用。hMDMsを調製し、感染している。NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP感染した細胞は、491 nmレーザーを用いて検出されます。スピニングディスク共焦点画像のZスタックを取得し、顕微鏡取得ソフトウェア及びImageJの（左のパネル）の両方を用いて分析します。 BF画像のギャラリーは、HHとして示さ非感染（映画1に対応する上部パネル）及び（45分の取得時にセル時間で46画像をNLR4.3 HIV-1Gag-iGFP感染（動画2に対応する下のパネル）を表します：ミリメートル）。細胞膜（黒の点線）、核（青丸）、外部SRBCを（そのうちのいくつかは赤矢頭で示す）と内部SRBCをは（そのうちのいくつかは赤い丸で示される）BF画像上で検出可能です。バー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ImageJの上のマニュアルトラッキングプラグインを用いて画像解析図 3. 命令の手順は、「マニュアルトラッキング」プラグイン（1）を開き、BFチャネルにタイムラプスビデオをロードした後、（2）、買収のパラメータを入力します（3）。 「トラックを追加」（4）と、選択されたファゴソーム（6、赤いボックス）のXとYの位置と新しいウィンドウを得るために、1ファゴソーム（5）をクリックすることで、追跡の測定を開始をクリックします。利便性のための時系列上のファゴソームに従うために、（5 '）明るさとコントラストを変化させる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

フィギュア表計算ソフトでのファゴソームの移動速度のデータ解析のための4命令の手順を実行します。（A）は 、スプレッドシートテーブルに核のXとYの位置と各ファゴソーム（赤いボックス）を組み立てます。別の列（紫色のボックス）で、（cは核とSRBCとAとの間の長さを表しピタゴラスの定理とし、直角三角形の他の2辺の長さbはファゴソームと核との間の距離を計算しますB）。 （C）最後に、時刻0で初期距離から与えられた時間にSRBCと核の間の距離を差し引くことにより、各時間（緑色のボックス）でファゴソームの移動距離を計算の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

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ファゴソームマイグレーション制御の速度およびHIV感染hMDMsの 図5. 定量化。（A）各SRBCについて、ちょうどSRBC内在化した後、核に向かって移動した距離を測定し、時間に対してプロットされています。最初の5分の間の速度は、表計算ソフトで線形回帰を用いて計算されます。代表的な実験は、（ 図3-4の内部SRBC）に示されています。 （B）最初の5分の間に全ての速度がHIV感染細胞における非感染（5ドナー）で66ファゴソームと60ファゴソーム（4ドナー）を測定します。 （ウェルチの補正で対応のないスチューデントのt検定; **、P <0.01）データは、平均±SEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

映画2：代表的なHIV感染マクロファージにおけるファゴソームの動き。 （右クリックしてダウンロード）。 HIV-1（NLR4.3 HIV-1のGag iGFP）はマクロファージを491レーザーを照射した後に同定されたに感染し。オプソニン化赤血球の移動は、45時BFチャネルで検出されました1分間に1画像（HH：MMとして示された時間での46画像）との食作用の分。バー=10μmです。

著者らは開示するものは何もない。