この報告は、急性感染細胞の細胞質抽出物中のヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)プレインテグレーションコンプレックス(PIC)関連統合活性を測定するためのin vitroアッセイについて説明しています。PIC関連HIV-1 DNAの異種標的DNAへの組み込みは、ネストされたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応戦略を使用して定量化されます。
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この記事について
サマリー
要約
HIV-1エンベロープタンパク質は、細胞質へのウイルスのカプシド（CA）コアの放出に続いてウイルスの細胞膜融合をもたらす、標的細胞表面上の同族受容体に係合します。その後、ウイルス逆転写酵素（RT）は、同名核タンパク質複合体の一部のような複雑な逆転写（RTC）は、二本鎖DNAコピー（vDNA）へのウイルスの一本鎖RNAゲノムを変換と呼ばれます。これは、他の核タンパク質複合体の生合成につながる、vDNAと関連するウイルスタンパク質と宿主因子で構成される統合前複合体（PIC）は、と呼ばれます。 PIC関連ウイルスインテグラーゼ（IN）は、時間的および空間的に調節二段階プロセスで宿主染色体DNAへvDNAの統合を調整します。まず、INは、細胞質内vDNAの3 '末端を処理して、PICは、核に入稿した後に第二、それは染色体DNAに加工vDNAの組込みを媒介します。 PICには、単離されました急性HIV-1に感染した標的細胞から、彼らは外因的に添加された異種標的DNAに関連vDNAを統合する能力があるとして、in vitroで機能的です。このようなインビトロの統合アッセイで PICベースのかなりレトロウイルス組み込みのメカニズムの詳細を描写するおよび阻害剤IN発見に貢献しています。本稿では、単離された天然のPICのin vitroでの統合の活性を測定するためのネストされたリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）ベースの戦略を採用して更新されたHIV-1のPICアッセイに手の込んだ。
概要
初期および後期のイベント：標的細胞におけるHIV-1複製は、大きく2段階にグループ化された複数のステップを伴います。 HIV-1順次標的細胞表面受容体CD4二共受容体（CCR5またはCXCR4）1のいずれかに結合したときに初期のイベントが始まります。その結果、ウイルスの細胞膜が融合、およびウイルスカプシド（CA）コアが細胞質2に放出されます。 CAのコアは、ウイルスゲノムの一本鎖RNA（ssRNA）と原点におけるウイルスおよび細胞の両方のいくつかのタンパク質が含まれています。 CA関連ウイルスタンパク質は、逆転写酵素（RT）及びインテグラーゼ（IN）、ウイルス複製の初期のイベント中に重要なステップを仲介する二つの酵素が含まれます。それぞれRTおよび複合核タンパク質複合体、すなわち逆転写（RTC）とプレインテグレーション複合体（PIC）の文脈で機能IN、3、4、5 <SUP>、6。ウイルスのssRNAゲノム港ターミナルリピート（R）ユニークな配列の（5時U5 '末端）および（3時U3'末端）に隣接する要素の両端。 RTCは、二本鎖（ds）DNAコピー（vDNA）へのウイルスのssRNAゲノム....
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プロトコル
1.ウイルス産生
注：、感染性HIV-1の高力価を生成する活性化されたデンドリマーベースのトランスフェクション試薬を用いて、感染性HIV-1分子クローンによるヒト胎児腎臓（HEK）細胞株293Tをトランスフェクトします。リン酸カルシウムトランスフェクション法は、同等の結果が得られることが観察されています。
- バイオセーフティレベル2（BSL2）ラボでは、シード8 10cmの皿当たり3×10 6 293T細胞mLの10％ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の。培養物を37℃に設定したインキュベーター中で細胞を、5％CO 2、O / N。
- 次の日は、各10cmの皿に細胞をトランスフェクトするために、血清および抗生物質を欠くDMEMの300μLの最終容量まで（ 材料表を参照）pNL4-3プラスミドDNAの8μgのを薄めます。 、トランスフェクション試薬の80μLを加え、ピペッティングによりよく混ぜ、そして室温でインキュベート5 - トランスフェクション複合体形成のための10分。
- 吸引により皿から培地を除去し、血清および抗生物質を含む新鮮なDMEMのディッシュあたり7 mLを加え。
- 、トランスフェクション複合体に血清および抗生物質を含むDMEMの1 mLを加え、....
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結果
HIV-1のPICの単離
急性感染のSup-T1細胞からのHIV-1のPICの単離のために使用されるプロトコルの概略図を図1に示されています。このプロトコルは、エンゲルマンらによって記載された方法に由来します。 19、20。 HIV-1のPICは、感染細胞内で組み立てられ、逆転写vDNAで構成されている核タンパク質複合体、ウイルスタンパク質、および細胞性因子19、20です。このレポートに記載された方法は、PIC-関連統合活動の源としてのHIV-1感染細胞の細胞質抽出物を使用しています。
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ディスカッション
レトロウイルスのPICの生化学的分析は、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムに重要な洞察を提供しています。レトロウイルスのPICの統合活性の測定は、プラーク形成アッセイ、サザンブロット分析、およびネストされた定量PCRにより達成することができます。プラークアッセイの実験戦略は面倒であり、統合6、7、18を測定するための間接的な方法を利用しています。サザンブロットベースアッセイ対策統合は、直接が、PICの6、7、18の比較的高い量を必要とします。
このレポートでは、in vitroで HIV-1 PIC-関連統合活性を測定するためのネストされた定量.......
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開示事項
著者には、競合する金融・非金融利益を宣言しません。
謝辞
この研究の一部は、CDにNIDA / NIHからの助成金DA024558、DA30896、DA033892、およびDA021471によってサポートされています。また、ヴァンダービルトCTSAはUL1RR024975、NCRR / NIH、NIMHD / NIHからU54グラントMD007593、およびテネシーCFARグラントP30のAI110527からMeharryトランスレーショナルリサーチセンター（MeTRC）CTSAグラントU54のRR026140を付与し、RCMIグラントG12MD007586を認めます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
ウシ胎児血清(FBS) | GIBCO/Invitrogen | 10437-028 | |
熱不活化ウシ胎児血清(Hi-FBS) | GIBCO/Invitrogen | 10438-026 | |
| ダルベッコ'修正されたイーグル」培地 (DMEM) | GIBCO/Invitrogen | 11995-065 | |
| ロズウェルパーク記念研究所 (RPMI) 1640 medium | GIBCO/Invitrogen | 11875-093 < | |
| p>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1x) | GIBCO/Invitrogen | 20012-027 | |
| トリプシン-EDTA (0.25%) | GIBCO/Invitrogen | 25200-056 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| HEK293T細胞 (293T) | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | |
| HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 114 | |
| PolyFect トランスフェクション試薬 | Qiagen | 301107 | |
DNase 1 < | p>Calbiochem/Merckmillipore | 260913 | |
Sup-T1細胞 | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1942 | |
HEPES pH 7.2 - 7.5 (ready-to-use solution) | GIBCO/Invitrogen | 15630-080 | |
| 塩化カリウム(KCl)溶液 | Sigma-Aldrich< /p> | 60142 | |
| 塩化マグネシウム(MgCl2)溶液 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| ジチオスレイトール(DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| アプロチニン | Sigma-Aldrich | A6106 | |
| ジジトニン < | p>Sigma-Aldrich | D141 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091-021 | |
| スクロース | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| phiX174 複製形態 DNA | Promega | D1531 | |
PhiX174-Fプライマー: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-Rプライマー: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' | Invitrogen および/または IDT-DNA | ||
| dNTP mix | Promega | U1515 | |
| Go Taq DNA ポリメラーゼ | Promega | M3005 | |
| Qiaquick ゲル抽出キット | Qiagen | 28706 | |
| 超純蒸留水 | Invitrogen | 10977-015 | |
Tris-EDTA (TE) バッファー (100x) | Sigma-Aldrich | T9285 | |
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩(EDTA)溶液、0.5 M、pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
Proteinase K(20 mg/mL ready-to-use solution) | Qiagen | 19131 | |
| フェノール(10 mM トリス HCl、pH 8.0 および 1 mM EDTA) | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| クロロホルム | Sigma-Aldrich | 288306 | |
グリコーゲン(5 mg/mL溶液) | Ambion/Invitrogen | AM9510 | |
酢酸ナトリウム(3 M、 pH 5.2) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| エタノール | Sigma-Aldrich | E7023 | |
First round LTR primer: 5'-GTGCGCTTCAGCAAG-3' 第1ラウンドphiX174プライマー: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' | Invitrogen および/または IDT-DNA | --- | |
第 2 ラウンド LTR-R プライマー: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' 第2ラウンドLTR-Uプライマー: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' 第2ラウンド タクマンプローブ: 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' | Invitrogen および/または IDT-DNA | --- | |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 170-8862 |
参考文献
- Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
- Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
- Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E.
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再版と許可
