の効率的な胞子形成サッカロマイセス・セレビシエ 96マルチウェルフォーマットで

サマリー

ここでは、出芽酵母の胞子形成が96マルチウェル形式で行われます。

要約

栄養ストレスの時期に、Saccharomyces cerevisiaeは胞子形成として知られる配偶子形成を経験します。窒素と炭素が不足している二倍体酵母細胞は、胞子形成プロセスを開始します。胞子形成のプロセスには、減数分裂とそれに続く胞子形成が含まれ、一倍体核が環境に耐性のある胞子にパッケージ化されます。私たちは、96枚のマルチウェルプレートで出芽酵母の効率的な胞子形成の方法を開発し、酵母細胞の胞子形成表現型のスクリーニングのスループットを向上させました。これらの方法は、適切な最小培地を使用する場合に栄養選択が必要なプラスミドを含む酵母のスクリーニング、または豊富な胞子形成レジメンを使用する場合にゲノム変化を伴う酵母のスクリーニングに適合します。この方法では、胞子形成中の通気が胞子形成に重要であることがわかり、96マルチウェルプレートフォーマットに適合した十分な通気を確保するための技術を考案しました。これらの方法では、大容量フラスコベースの実験で達成できる典型的な~80%レベルの胞子形成は達成されませんが、これらの方法では、少量のマルチウェルプレートで約50〜60%の胞子形成を確実に達成できます。

概要

出芽酵母における胞子形成が減数分裂^1、遺伝子組換え²のメカニズム^{、3シグナル}伝達細胞による開発のコントロール、開発⁴の栄養制御、転写時の染色体分離の制御を含む生物学の多くの側面、洞察を提供することが検討されています開発⁵の規制、および胞子形成⁶の検討。胞子形成は、保護胞子壁⁶の堆積に続いて母細胞内の新しい膜区画の形成を含む新規な細胞分裂事象を含みます。胞子形成細胞を調べるこれらの研究は、多くの場合、比較的効率的なやり方^7,8で約24時間で胞子形成のプロセスを経ることができる急速に胞子形成酵母株SK1、を利用します。出芽酵母のための胞子形成条件の最適化は^、9月13日 、これらの実験について説明したがSは、固体培地上または胞子形成は、培養チューブもしくはフラスコを用いて行われる大規模な液体培養物中で胞子形成を調べました。

ここでは、96マルチウェルプレートフォーマットで酵母を胞子形成するための方法を説明します。我々は、この方法のために、通気が同期および効率的な胞子形成のために重要であることを見つけると、小容量マルチウェルフォーマット十分な胞子形成を確保するための手法を考案しました。細胞は、高スループット技術とタイルライブラリ^14-16を使用して高コピー抑制のためのマルチウェルプレートフォーマット、このようなスクリーニングのために最適化された試薬を用いてスクリーニングされる96マルチウェルプレート形式で胞子形成することができます。

プロトコル

1.胞子形成のための準備

注：このプロトコルに記載されたメディアは、標準的なレシピと方法^13,17を用いて製造される。表1は 、このプロトコルで使用される様々なメディアの1 Lのための製剤が得られます。

	バクトペプトン	酵母エキス	バクト寒天	ブドウ糖	酢酸カリウム	グリセロール	ddH 2 O
YPGプレート	20グラム	10グラム	20グラム	-	-	30ミリリットル	970ミリリットル
YPDプレート	20グラム	10グラム	20グラム	20グラム	-	-	千ミリリットル
YPD液体	20グラム	10グラム	-	20グラム	-	-	千ミリリットル
YPA液体	20グラム	10グラム	-	-	20グラム	-	千ミリリットル
胞子形成培地	-	-	-	-	10グラム	-	千ミリリットル

表1：メディア製剤金額はメディアの1 Lのために与えられています。メディアに関する詳細成分は、材料表に記載されています。

1. すべての胞子形成細胞は同じ遺伝子型になる場合は、次の手順を実行します。
   1. 解凍酵母株はYPG（YPGlycerol）プレートに使用されます。 30℃で12-16時間、酵母を育てます。重要なことは、SK1細胞はまた、胞子形成する態勢を整えているので、SK1株はYPGプレート上に長すぎる残されるべきではない、またはそれらは、プレート上で胞子を形成することができます。
      注：炭素源としてのグリセロールの使用は、酸化的リン酸化を必要とし、従って、機能的なミトコンドリアDNAを有する細胞について選択するようYPG上に成長した新たに解凍した株が好ましいです。 SK1細胞は、機能的なミトコンドリアDNAを失い、petitesのになる傾向を有します。機能的なミトコンドリアDNAは、胞子形成のために必要とされます。
   2. 単一コロニーのためのYPD（YPDextrose）プレート上にYPGプレートからストリーク酵母。 30℃でYPDプレート24-28時間に酵母を成長させます。
   3. YPD固体培地上での増殖の約36〜48時間後、単一コロニーを使用して、25ミリリットルのYPD培養を開始YPDプレートから。細胞は7.0〜約OD ₆₀₀ = 4.0になるまで、この文化を育てます。 220 rpmで振とう、振盪インキュベーター中で30℃で一晩、この手順を実行します。
   4. YPD培養物から、（220で振盪30℃振盪インキュベーター中で酵母を育てる2節の各96ウェルプレートの必要性のためにOD ₆₀₀ = 0.1であることYPA（YPAcetate）文化の千ミリリットルを開始するために、細胞の適切な量を使用します培養OD ₆₀₀までの回転数）は1.5から1.3の間です。
      注：4 96マルチウェルプレートをスクリーニングする場合は、各96マルチウェルプレートのためのYPA培地の100ミリリットルを接種は、例えば、第2節でスクリーニングするために、YPA培地の400ミリリットルが必要になります。 YPA培養における10％の余分なボリュームで起動すると、蒸発量が消失するのを防止することが必要です。細胞は、適切なOD _600に到達するために一般的には、12-16時間の間になります。時間の量は、酵母株の遺伝子型に依存して変化し得ます。 YPAはpresporulationメディアです。 Pregrowth酢酸で効率的かつ同期胞子形成⁶のために必要な（例えばIME1など）の遺伝子の発現を誘導するのに役立ちます。
   5. 5分間テーブルトップ遠心機で1800×gでスピンはYPAで増殖させた細胞をペレット化します。洗浄細胞は、滅菌オートクレーブした脱イオン水0.5体積の1倍。再びスピン、および洗浄を捨てます。 1×ボリュームの胞子形成培地で細胞を再懸濁し。第2節に進みます。
2. 96マルチウェルフォーマットに、（ すなわち 、異なるプラスミドまたは異なる変異を含むで形質転換され、一般的に入手し、凍結ストックとして保存されている）、異なる遺伝子型の配列の細胞を、異なる遺伝子型のもので胞子形成のために細胞を使用している場合。そして、次の手順を実行します。
   1. YPG固体培地上で96マルチウェルプレート（複数可）で解凍凍結ストックから細胞を転送するために、無菌の96プロングフロッガーを使用してください。 30℃での酵母の一晩を成長させます。
   2. 滅菌96プロングフロッガーを使用して、YPD固形培地または選択的にYPG固体培地から細胞を転送固体培地（アミノ酸を欠いている、すなわち 、合成最小培地、細胞は選択を必要とするプラスミドが含まれている場合）。コロニーを各株のために形成されるまで、選択培地が必要であればYPD及び2日目に、典型的には1日、30℃で酵母を成長します。
   3. アリコート96深い2ミリリットルマルチウェルプレートの各ウェルにYPD液体培地または選択液体培地の1.2ミリリットル。フロッガーを使用して液体培地に固体培地から細胞を移すには、テープによって所定の位置に保持されたプラスチック蓋でカバーし、220 rpmで振とうしながら、30℃のシェーカーで一晩増殖します。
      注：長方形のペトリプレートからプラスチックのふたを使用して、カバープレートの汚染を最小限にします。空気の循環が最小限に制限されているように、テープ片を使用して所定の位置に蓋を保持します。
   4. 96ウェルプレートを収容するためのアダプタを有するスイングバケット遠心機を用いて5分間、1,800×gで遠心分離板。細胞からの培地を捨て、各ウェルに500μlのYPAを追加し、YPAでペレット化した細胞を再懸濁します。カバープラスチック蓋をテープで適所に保持。
   5. 220 rpmで振とう、振盪インキュベーター中で30℃で15時間、細胞を増殖させます。第2節に進みます。

96マルチウェルフォーマット2.胞子形成細胞

1. 1.3ミリリットルウェルを有する96ウェルプレートの各ウェルに1 3ミリメートル滅菌固体ガラスビーズまたは滅菌5ミリメートルのx 2ミリメートルの磁気攪拌棒のいずれかを追加します。 （ビーズまたは攪拌棒を使用するかどうかについての議論については、以下の代表的な結果を参照してください。）
2. スクリーニングされるすべてのセルが同じ遺伝子型である場合は、2.2.1に進みます。スクリーニングされる細胞は、異なる遺伝子型である場合は、2.2.2に進みます。
   1. 96マルチウェルプレートの各ウェルにステップ1.1.5アリコート細胞+培地500μlのから細胞を取ります。テープによって所定の位置に保持プラスチック製のふたでカバーしています。 2.3に進んでください。
   2. 96ウェルプレートを収容するためのアダプタとスイングバケット遠心機を用いて1.2.4から5分間、1800×gでYPAであるスピン細胞、。の流動細胞からのFメディア。各ウェルに胞子形成培地500μlを添加して、胞子形成培地でペレット化した細胞を再懸濁します。テープによって所定の位置に保持プラスチック製のふたでカバーしています。 2.3に進んでください。
3. ガラスビーズを使用している場合は、場所の30℃の振盪培養器内のサンプルとは、胞子形成のための220 rpmで振とうします。胞子形成のために30℃インキュベーターの内側撹拌プレート上の磁気撹拌棒、場所のサンプルを使用している場合。
   注：磁気攪拌棒の正確な撹拌速度は限りすべてのバーが精力的に動いていると文化を通気するように、非常に重要ではありません。
4. （：5希釈1）可視化のために胞子形成培養物からサンプルを引き出す、胞子形成の進行を監視するために、96ウェルカバースリッププレートに胞子形成培地の24μlに胞子形成培養物から細胞の6μlを添加。倒立顕微鏡を用いて細胞を検査する前に5分間沈降細胞を残します。
   注：野生型SK1細胞では、コンパクトな成熟した胞子が3によって形成されます胞子形成培地に移した後、6時間。胞子形成の進行は、例えば、核マーカー、蛍光マーカーを用いて顕微鏡検査によりモニターすることができる（ すなわち 、HTB2-mCherryを^18）が減数分裂またはprospore膜マーカーを調べるために（ すなわち 、G20 ^19）は胞子形態形成を調べました。あるいは、屈折胞子の形成は、胞子形成培地に移した後、約12時間を開始ノマルスキー微分干渉顕微鏡を用いて見ることができます。

結果

（上記のように）このプロトコールを評価するために、胞子形成効率は、マルチウェルプレート中で胞子形成細胞から得られたフラスコ（ 表2）に大きなボリュームを使用して胞子形成細胞と比較しました。マルチウェルプレートの使用は〜80％の効率が日常的に見ることができるフラスコに胞子形成時に見られる高効率を達成しませんでした。 （ガラスビーズまたは攪拌棒で提供される）適切な通気とマルチウェルプレートに胞子形成することは最良の結果（66％効率）5ミリメートル×2ミリメートル撹拌棒を用いて得られたと、十分な胞子形成効率を50％より多くを達成することができます。二つの異なる株（野生型とsmk1Δ）の代表的な胞子形成は、（ 図1）ここに示されています。これらの細胞は、胞子形成培地で36時間後に検査し、96ウェルガラス底板を用いて可視化しています。

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ディスカッション

ここでは、96マルチウェルフォーマットでSK1酵母を胞子形成するためのプロトコルを提示します。エアレーションは、各ウェル中の攪拌棒やガラスビーズのいずれかの使用を必要とする、効率的な胞子形成するためのキーです。細胞は、ビーズや撹拌棒のいずれかなし振盪インキュベーター中で96マルチウェルプレートに胞子形成されている場合、細胞が効率的に胞子を形成しません。細胞は、ビーズまたは（撹拌せずに30℃で、表1であることと比較して、振とう培養器で攪拌棒、のいずれかなしに胞子形成されたときに胞子形成効率のわずかな増加が見られ、10％対シェーカーで17％が攪拌に置かプレート）。 7ミリメートルの攪拌棒は、隣接するウェル内の攪拌棒との相互作用に適切文化を曝気しなかったため、同様に、7ミリメートルの撹拌棒の使用は、おそらく、貧しい胞子形成効率（28％）が得られました。このプロトコルは、SPOを研究するために一般的に使用される同期かつ効率的に胞子形成SK1酵母株^7,8を使用して胞子形成のための条件を説明しrulation;このプロトコルを使用して、他の酵母株を得ることができる胞子形成効率は、これらの技術を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Nunc 1.3 ml DeepWell プレート	ThermoScientific	260251	胞子形成に使用
Nunc 2.0 ml DeepWell プレート	ThermoScientific	278743	胞子形成前増殖に使用、ステップ 1.2.3
3 mm ガラスビーズ	フィッシャー	11-312A	胞子形成に使用
5 mm x 2 mm 攪拌子、12 個入りパック	フィッシャー	14-511-82	胞子形成に使用
96井戸フロッ	ガーV&ステップ	1.2	VP407
	ステップ	VP381	; フロッガー
長方形のペトリ皿	ステップ 1.2 に必要な	ThermoScientific	264728
培地に必要な	バクトペプトン	BD	211677培
酵母エキス	BD	212750	地に必要な
バクト寒天	培	212750
キストロース		メディアに必要な	ッシャーD16-3
メディアに必要な酢酸カリウム		フィ	ッシャーP171-500
グリセロール		フィ	ッシャーG33-500
ブラック96ウェルガラス底板	2.4に必要な	マットテック	PBK96G-1.5.5-F