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方法論記事

単離とマウスリンパ球の活性化

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⸱

DOI:

10.3791/54596

⸱

2016年10月30日

 ,  , 
1School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

この記事について

サマリー

リンパ球は、適応免疫応答の主要なプレーヤーです。ここでは、in vitroおよびin vivoでのリンパ球活性化における所望の分子の生理学的機能を決定するためのリンパ球精製プロトコルを紹介します。記載された実験手順は、コントロールと遺伝子組み換えリンパ球との間の機能的能力を比較するのに適している。

要約

B細胞とT細胞は、非常に多様な抗原受容体レパートリーを持ち、侵入する病原体1,2に対して特異的な免疫応答を発現する能力を持っています。当然のことながら、このような複雑な能力は、さまざまな細胞プロセスに関与する多数の分子によって制御され、タイムリーで空間的に制御された免疫応答を確保します3。ここでは、磁気細胞選別技術を用いて高度に精製されたマウスリンパ球を迅速に単離するための実験手順について説明します。得られた精製リンパ球は、その後、イムノブロッティング4による刺激によるリンパ球シグナル伝達能力の測定や、3H-チミジン取り込みまたはカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)標識5-7による増殖能の調査など、さまざまなin vitroまたはin vivoの機能アッセイに供することができる.制御リンパ球と遺伝子改変リンパ球の機能能力を比較するだけでなく、移植されたCFSE標識OT-I T細胞を用いた代表的な結果に示されているように、in vivoでの抗原提示細胞(APC)のT細胞刺激能力も決定できます。

概要

成熟リンパ球は、個人に既存の感染や炎症がない場合、一般的に静止状態で存在します。したがって、単離プロセス中にリンパ球のナイーブな状態を保持することが、in vitroまたはin vivoの機能アッセイを行う前に重要です。一貫性と再現性のある結果を確保するための鍵は、細胞の不要な操作を制限することです。

磁気細胞選別は、抗体とマイクロビーズを利用して細胞を標識し、目的の細胞集団を豊かにします。このアプローチでは、正の濃縮と負の枯渇という2つの精製戦略があります。ポジティブエンリッチメントは、標的細胞に結合する抗体を使用して、目的の細胞集団を濃縮します。一方、負の枯渇は、非標的細胞を枯渇させ、目的の細胞集団を残します。私たちの研究室では、標的細胞への抗体の結合が細胞の特徴や挙動を変化させる可能性があるため、正の濃縮よりも負の枯渇を好みます。実際、特定の細胞集団の単離に適した多くの確立された細胞表面マーカーは、機能的な受容体でもあります。

磁気セルソーティングは、生存可能な標的細胞の高純度の集団をもたらすだけでなく、蛍光活性化セルソーティング(FACS)で使用される高圧の流れによって引き起こされる細胞ストレスも少なくて済みます。不要な細胞集団を標識し、磁気分離カラムを使用してそれらを枯渇させることにより、標的細胞集団の生存率を損なうことなく、迅速な細胞分離を行うことができます。このプロトコルでは、ナイーブB細胞またはT細胞を精製するための負の枯渇戦略の使用を実証します。

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プロトコル

全てのマウスを交配させ、特定の病原体を含まない条件下で維持し、すべてのマウスプロトコルは、施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われています。

緩衝液および試薬の調製

  1. 、55μM2-メルカプトエタノールを完全ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地（10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、ペニシリン（100 IU / ml）を/ストレプトマイシン（100μg/ ml）を準備します）。
  2. これとは別に、20倍の平衡塩類溶液（BSS）ストック1およびストック2を準備します。
    1. 20倍BSSストック1（1 Lの滅菌水で111 mMのブドウ糖、8.8 mMリン酸カリウム、26.7 mMのリン酸ナトリウム二塩基性）を準備し、最終容量調整前の20倍BSSストック1に40ミリリットルの0.5％フェノールレッドを追加します。 4℃で保存する前に、0.2μmのフィルターを用いて滅菌濾過します。
    2. 20X BSSストック2（25.8 mMの塩化カルシウム二水和物、107 mMの塩化カリウム、2.73 MナトリウムCHを準備loride、19.6 mMの塩化マグネシウム六水和物、1 Lの滅菌水で16.6 mMの硫酸マグネシウム）。 4℃で保存する前に、0.2μmのフィルターを用いて滅菌濾過します。
    3. 400ミリリットル滅菌水それぞれに、別々に、50ミリリットルBSSストック1と50ミリリットルBSSストック2を希釈し、実験的な使用のために1X BSSを準備します。 、両方の希釈液を組み合わせてpHを7に調整し、20ミリリットルのFBS（2％）を追加します。 0.2μmのフィルターを用いて滅菌水と滅菌フィルターを使用して1 Lまでトップ。
      注：濃厚BSSストックの混合が直接析出につながる可能性があるため、BSSストック溶液を別途準備する必要があります。
  3. 赤血球（RBC）溶解バッファー
    1. RBC溶解緩衝液を調製するために、使用前に1部株式トリス塩基（滅菌水中の130mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pHは7.65）に9部ストック塩化アンモニウム（滅菌水中の155 mMの塩化アンモニウム）を混合します。
      注：4℃で塩化アンモニウムおよびトリスベースのストア滅菌ストック溶液。溶解bを準備しますRBCの効率的な溶解を確実にするために、新鮮なuffer。

脾臓またはリンパ節からリンパ球懸濁液の2世代

注：マウスの安楽死の前に、実験に必要な全ての試薬および装置を準備して、高い細胞生存率を維持するために、できるだけ早くリンパ球の単一細胞懸濁液を生成することが重要です。

  1. 頸椎脱臼またはCO 2窒息により実験マウスを安楽死させます。
    注：これ以降のステップで、すべての実験手順は、無菌的に行うべきです。
  2. 任意の切開を行う前に、70％エタノールにマウス全体を浸し。無菌的に8脾臓およびリンパ節を削除し、（ステップ1.2.3から）5ミリリットルの氷冷RPMI / FBS（2％FBSを含むRPMI）やBSS / FBSを含む別の15ミリリットルチューブに配置します。
    注：BSSは、効率的なRBC溶解を防止するため、脾細胞懸濁液を調製するためのRPMIを使用しAFTE BSSに切り替えますRBC溶解をrは。
  3. 2ミリリットルの氷冷RPMI / FBSまたはBSS / FBSを含むペトリ皿に無菌100μmのセルストレーナーメッシュの2枚の間に臓器（複数可）を置き、脾臓またはリンパ節からの単一細胞懸濁液を生成するには。それは非常に細かい部分に引き裂かれるまで1mlシリンジのプランジャーを用いて、器官（複数可）をマッシュ。
  4. 15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移し、セルストレーナーを氷冷RPMI / FBSまたはBSS / FBSでメッシュ洗います。 、残りの細胞懸濁液を収集し、同じ15 mlチューブに追加し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。上清を取り除きます。
    注：後続のステップでRBC溶解緩衝液または培地を添加する前に、指でチューブをフリックすることによりペレット化した細胞を再懸濁します。
  5. 細胞懸濁液の遠心分離中に室温（RT）RBC溶解バッファーを準備し（ステップ1.3を参照してください。）。細胞をペレット化し、上清を除去した後、すべての10 8個の細胞1mlのRBC溶解緩衝液を用いて細胞を再懸濁します。 IncuBATE 3-4分間室温で溶解反応。
  6. 14ミリリットルの氷冷BSS / FBSを停止RBC溶解し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。

B及びT細胞の3精製

  1. B細胞の精製
    1. 血球計数器を用いて細胞を数えます。 300μlのBSS / FBSで最大10 8脾臓細胞を再懸濁し、50μlの抗CD43に磁性マイクロビーズ9,10を追加します。 、死んだ細胞を除去30μlのアネキシンV磁気ビーズを追加します。 30分間、4℃の冷蔵庫中の細胞懸濁液をインキュベートします。
  2. T細胞の精製
    1. 血球計数器を用いて細胞を数えます。再懸濁し、標的細胞集団に応じて非T細胞枯渇抗体カクテルで10 8細胞CD19、B220、GR-1、TCR-γδ、CD49b、CD11cの、のCD11b、TER119およびCD4またはCD8に対する（ビオチン化抗体まで/ FBS 4,5200μlのBSSに200：）精製され、1に希釈しました。中の細胞懸濁液をインキュベート15分間、4℃の冷蔵庫。
    2. インキュベーション後、細胞を洗浄し、4℃で5分間、453×gでスピンダウンする10ミリリットルBSS / FBSを追加します。上清を除去し、30μlのストレプトアビジンマイクロビーズおよび15μlのアネキシンV磁気ビーズを165μlのBSS / FBS中で細胞を再懸濁します。 30分間、4℃の冷蔵庫中の細胞懸濁液をインキュベートします。
      注：、あっても磁性マイクロビーズで標識することを確認し、15分間マイクロビーズを用いて細胞をインキュベートし、その後、15ミリリットルチューブをタッピングにより穏やかに細胞懸濁液を混合し、ステップ3.1.1の間に、別の15分間インキュベートします。または3.2.2。
  3. 細胞精製のための分離カラムの調製
    1. 細胞のマイクロビーズ標識の中に未使用の分離カラムを準備する（ステップ3.1.1。または3.2.2。）。 RTへ（FBSなし）プリ暖かいBSSと無菌的にカラムを洗浄し、平衡化するために2ミリリットルを使用しています。 BSSで平衡化した後、洗浄し、カラムを乾燥させてはなりません。
      注：私たちはLS cを使用しますolumn代わりに推奨されるLDの列の、その再利用性に（ステップ3.4を参照してください。）。
    2. 磁気ビーズで標識した後、細胞を洗浄し、4℃で5分間、453×gでスピンダウンする14ミリリットルBSS / FBSを追加します。上清を除去し、1-3で細胞ミリリットルRT BSSを再サスペンド。
    3. 精製のプロセスの間に流量を減らすために、カラムの先端に滅菌21 Gの針を取り付けます。平衡化したカラムに細胞懸濁液をロードし、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。
      注：ロード中にカラムに気泡を導入することは避けてください。
    4. 1ミリリットルBSS / FBSで一回カラムを洗浄し、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。再び通る流れでカラムをリロードします。同じ15ミリリットルチューブ内の第二の負荷後のフロースルーを収集します。
    5. 1ミリリットルBSS / FBSでカラムを3回洗浄し、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。その後、目に5ミリリットルBSS / FBSを追加電子カラムと、プランジャーと、新しい15ミリリットルチューブにカラムから磁気標識された細胞を洗い流します。
    6. 精製されたBまたはT細胞4,5の表面抗原に結合する抗体を用いたフローサイトメトリーによって収集された細胞の純度を確認してください。
  4. 分離カラムを使用して再
    注：LSカラムは、浄化効率に影響を与えることなく、4回まで再利用することができます。
    1. プランジャーを使用して上から水を5mlの蒸留で5 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回カラムを3回洗浄します。
    2. 5ミリリットル70％エタノールでカラムを洗浄し、カラムに錆の蓄積を防ぐために空気タップを使用して広範囲にカラムを乾燥。
    3. 個別の精製実験のために使用されるLSカラムを準備するには、シリンジアダプタを使用して、5ミリリットル、70％エタノールで下から上カラムを洗浄。次に、5ミリリットル一度列の先頭からPBSに続いて5ミリリットル滅菌PBSで2回ボトムアップからカラムを洗浄。 2を追加します。ミリリットルRT BSSは、カラムを平衡化した後、標識された細胞でカラムをロードするに進みます。

4. CFSE標識および刺激

注：精製細胞は、in vitroでの様々なおよびインビボ機能アッセイにかけることができます。ここでは、APCは5のT細胞刺激能を決定するために、精製されたT細胞を使用します。

  1. 37°Cの前CFSEをロードする前暖かい標識溶液（PBS中0.1％FBS）。
    注：PBS中のFBSの低い割合を使用すると、CFSEのロード中に細胞死を減少させ、遠心分離中の細胞損失を最小限に抑えることができます。しかし、あまりにも多くのFBSはCFSEのロードを妨げる可能性があります。
  2. 標識溶液で2回精製した細胞を洗浄し、15mlチューブ中の予め温めた標識溶液中で2×10 7細胞/ mlで再懸濁しました。
  3. 予め温めておいた標識溶液中で：（5 mMのCFSEストック溶液の500倍希釈）10μMのCFSE溶液を調製します。 CFSEソリューションべきたて最適なラベリングを達成するたびに調製すること。
  4. CFSEで細胞をロードするには、15 mlチューブで1部10μMのCFSE溶液に1部の細胞懸濁液を追加し、37℃で10分間、暗所でインキュベートします。 5μMのCFSEの最終濃度は、1×10 7細胞/ mlを標識するために使用されます。
  5. CFSEのロード中に細胞の均質な混合物を確実にするためにチューブを2分ごとに反転します。
  6. 反応を停止するには、氷のように冷たい完全RPMI培地の複数のボリュームを追加し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。成功したCFSEのロード時に、細胞ペレットを、黄色がかった表示されます。
  7. ウォッシュCFSEは氷のように冷たい完全RPMI培地で細胞を1より多くの時間をロードされ、in vitroでの培養のためにまたはインビボ刺激に使用する前に、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。

5. in vitro刺激

  1. 使用直前に2倍の刺激のストック溶液（2×刺激原液）を調製10となるよう2X刺激原液0μlを96ウェルプレート中のウェルあたり200μlの最終容積に細胞100μlを添加することができます。
  2. （B細胞またはT細胞のためのCD3およびCD28のためにIgMまたはCD40）の刺激でコーティングされたプレートが必要な場合は、4℃で一晩PBSで刺激し、プレコート培養プレートを希釈します。代替的に、培養プレートは、実験の当日に1時間37℃でコーティングすることができます。 （プレートは任意の時点で乾燥させないでください）PBSで2回コーティングしたプレートを洗浄します。
B細胞について
刺激 最終濃度
F（ab '）2ヤギ抗マウスIgM 0.6から2.4 / mlの
抗マウスCD40モノクローナル抗体 0.5 / mlの
組み換え体マウスIL-4 25 U / mlの
リポ多糖類 0.1 / mlの
E.から（LPS） 大腸菌血清型055：B5
T細胞のための
刺激 最終濃度
抗CD3（プレートコーティングされました） 2-10 / mlの
（50μL/ウェルコーティング用）
抗CD28（プレートコーティングされました） 2 / mlの
組換えIL-2 40 U / mlの
PDBu（ホルボールエステル） 5-50 ng / mlで
A23187（カルシウムイオノフォア） 250 ng / mlで

表1： インビトロ培養中のリンパ球を刺激するために使用される刺激の濃度。

  1. CFSE標識B細胞の場合は、3×10 5細胞/ウェルで96ウェルの72時間平底プレート三連で完全RPMI培地と培養3×10 6細胞/ mlに再懸濁します。
  2. CFSE標識T細胞を、0.5~3×10 5細胞で三重で完全RPMI培地及び培養中の0.5-3×10 6細胞/ mlに再懸濁/ウェルで48または72時間、96ウェル丸底プレート。

6. インビボ刺激

  1. in vivoでの刺激、各MHC適合レシピエントマウスに養子移入（200μlのPBS中の静脈内（IV））マウスあたり4×10 6 CFSE標識T細胞について。
    注：このプロトコルでは、CFSE標識T細胞は、養子意志家など脾臓およびリンパ節などのリンパ器官へのこれらの細胞のように尾静脈または眼窩後注射を使用して転送することができます。
  2. 1日後に抗原とレシピエントマウスに挑戦。
    注意：OVA特異的T細胞受容体（TCR） - トランスジェニックT細胞を養子レシピエントマウスに移したため、この例では、我々は、抗原としてオボアルブミン（OVAタンパク質を50μg/マウス）を使用します。滅菌PBSでOVAタンパク質を準備し、各レシピエントマウス5に、皮下注射（SI）を経由して、OVAタンパク質/ PBSまたはPBS対照の100μLを注入します。
  3. 収穫し、3日間OVAタンパク質またはPBSで免疫した後、レシピエントマウスのリンパ器官（リンパ節および脾臓）からの単一細胞懸濁液を生成します。腸間膜、膝窩、鼠径部、腰部、および尾部リンパ節を含んで腋窩、上腕および表在性頸部リンパ節を含んで近位リンパ節（PLN）、）および遠位リンパ節（DLN）への個別のリンパ節、。 T細胞の増殖を確認するために、適切なFACS抗体を用いて染色細胞。
    注：このCFSE細胞追跡実験において、PBSを注射した対照マウスからのCFSE標識T細胞は非 - ジのベースライン蛍光を確立します細胞をviding。増殖の細胞分裂は、抗原刺激、CFSE標識細胞は、蛍光ピーク12,13を測定することによって可視化されます。 PBSコントロールで、増殖の細胞分裂の数は、CFSE標識T細胞は、12,13を決定することができます。
  4. サンプル間の細胞分裂またはピーク数を比較することによって、CFSE標識細胞増殖データを分析した （ 図1及び2）。
    注：例えば、養子OVA抗原を受けたレシピエントマウスに移しCFSE標識、OVA特異的T細胞は、PBS注射コントロールマウス5,12に比べて活発な増殖を受けます。また、ホーキンスら14により示されるようにCFSE細胞増殖データを分析するための多くの方法が存在することを指摘することは注目に値します。

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結果

リンパ球の磁性細胞精製は、ユーザが比較的短い時間で、標的細胞集団を精製することができます。我々の枯渇のプロトコルを用いて、精製した後、94.2％（に72.8％（前の精製）から（組換え活性化遺伝子1（RAG-1）欠損マウスにおけるOT-I）CD8 T細胞の割合を増加させることができました。 図1A）4,5。これらの精製されたリンパ球は、その後、リンパ球増殖およびシグナル伝達4,5を決定するために、下流の機能的アッセイのために使用することができます。例えば、我々は、APCのインビボでの T細胞刺激能を検討することができ 野生型（WT）および適当な抗原5で免疫化した変異体（MT）マウスにCFSE標識した、抗原特異的T細胞を転送することによって。

当社の代表的な実験では、我々は、精製され、CFSE標識、オボアルブミン（OV...

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ディスカッション

このプロトコルでは、我々は、リンパ器官からのリンパ球を精製するための手順を示します。磁気ビーズ選別を用いた細胞の精製は、実行可能な、高度に精製された標的細胞をもたらす迅速かつ簡単な方法です。

プロトコル内の重要なステップ

細胞生存率および細胞収量

in vitroで造血系細胞の生存率を維持することに成功し、再現性のある実験を確保するために重要です。化学的および生物学的試薬は、準最適な実験条件または摘出臓器の不適切な保存条件は、全ての細胞生存率に影響を与えることができます。マウスから切除時に、リンパ器官を氷とできるだけ早く調製単一細胞懸濁液上に格納する必要があります。細胞懸濁液の高速遠心分離も避けるべきです。さらに、細胞ペレット、上清を除去した後に指でチューブをフリックすることによって緩めなければなりません。そうではないピペッティングにより媒体の大量の直接への再懸濁ペレット推奨。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

研究は、シンガポール（ACRFのTier1-RG40 / 13およびTier2の-MOE2013-T2-2-038）、教育省によってサポートされています。原稿がObrizusコミュニケーションズからのエイミー・サリバンが編集しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Materials
RPMI 1640 (L-グルタミンなし)Gibco31870025
Fetal Bovine SerumHeat inactivated 
L-グルタミンギブコ25030024
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコ15140114
2-メルカプトエタノールギブコ21985023
抗CD43磁気マイクロビーズミルテニ バイオテック130-049-801混ぜる
事前に ストレプトビジンマイクロビーズミルテニイ バイオテック130-048-101混ぜる 事前に使用
抗アネキシンV磁気ビーズMiltenyi Biotec130-090-201よく使用前に混合
MACS LD Miltenyi Biotec130-042-901
96ウェルU底無菌培養プレートGreiner Bio-one650180
96ウェルF底滅菌培養プレートGreiner Bio-one655180
100 μm細胞ストレーナーメッシュ紫外線を使用して滅菌するには 使用前に
0.2 μm 滅菌済み使い捨てフィルターユニットNalgene567-0020任意の滅菌フィルターデバイスで代用可能
CellTrace VioletInvitrogenC34557CTV (略称)、CFSE
CellTrace YellowInvitrogenC34567CTY (略称)、CFSE
CellTrace Far RedInvitrogenC34564CTFR (略称)、CFSE
の代替Cell Proliferation Dye eFluor 670eBioscience65-0840CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26Sigma AldrichPKH26GLPKH26, alternative to CFSE
NameCompanyカタログ番号strong<strong>コメント
Chemicals
デキストロースSigma AldrichG7021
リン酸カリウム 一塩基性Sigma AldrichP5655
リン酸ナトリウム二塩基性Sigma AldrichS5136
フェノールレッドSigma AldrichP0290
塩化カルシウム二水和物Sigma AldrichC7902
塩化カリウムSigma AldrichP5405
塩化ナトリウムMerck MilliporeS7653他の供給源から使用できます
塩化マグネシウム六水和物Sigma AldrichM2393
硫酸マグネシウムSigma AldrichM2643
塩化アンモニウムSigma AldrichA9434
トリスベース
ジメチルスルホキシドシグマアルドリッチ D8418
(5-(および6-)カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)分子プローブC-1157DMSO
ホルボール12,13-ジブチレート(PBDU、ホルボールエステル)グマアルドリッチP1269
A23187(カルシウムイオノフォア)シグマアルドリッチC7522
名前会社カタログ番号コメント
抗体および組換えタンパク質
CD11bビオチン(クローンm1/70)Biolegend101204T細胞枯渇カクテル
CD11cビオチン(クローンN418)Biolegend117304T細胞枯渇カクテル
Gr-1ビオチン(クローンRB6-8C5)バイオレジェンド108404T細胞枯渇カクテル
Ter119ビオチン(クローンTer119)バイオレジェンド116204T細胞枯渇カクテル
TCR-&γ;&デルタ;ビオチン(クローンGL-3)バイオレジェンド118103T細胞枯渇カクテル
CD19ビオチン(クローン6D5)バイオレジェンド115504T細胞枯渇カクテル
B220ビオチン(クローンRA3-6B2)バイオレジェンド103204T細胞枯渇カクテル
CD49bビオチン(クローンDX5)バイオレジェン108904T細胞枯渇カクテル
CD4ビオチン(クローンGK1.5)バイオレジェンド100404T細胞枯渇カクテル
CD8ビオチン(クローン53-6.7)Biolegend100704T細胞枯渇カクテル
F(ab')2 ヤギ抗マウスIgM(プレートコーティング)Jackson ImmunoResearch 115-006-07550 & マイクロ;コーティング用l /ウェル(96ウェル)
抗マウスCD40 mAb(プレートコーティング)Pharmingen 55372250 & マイクロ;コーティング用l/well (96ウェル)
組換えIL-4ProSpec Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5Sigma AldrichL-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (プレートコーティング)eBioscience 16-0037-8550 & マイクロ;コーティング用l/well (96ウェル)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)eBioscience 16-0281-8550 & マイクロ;コーティング用l/well (96ウェル)
組換えIL-2ProSpecCyt-370
鶏卵白アルブミン、オボアルブミンSigmaAldrich A7641
よく よくはで再構成しますシド

参考文献

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