このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます

9.3K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/54611

⸱

2016年11月12日

 ,  , 
1Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, OARDC, 2Department of Plant Pathology, The Ohio State University, OARDC, 3Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, OARDC, 4OARDC Metabolite Analysis Cluster, The Ohio State University, OARDC

この記事について

サマリー

この記事では、無料の帯状キャピラリー電気泳動を用いて植物材料からの有機酸の検出および定量するための方法を提示しています。コーヒー種子中の有機酸濃度の二次発酵の効果を決定するこの方法の潜在的なアプリケーションの例が提供されます。

要約

カルボン酸は、一つ以上の末端カルボキシル（COOH）官能基を含む有機酸です。短鎖カルボン酸（SCCAs; 3〜6個の炭素を含有するカルボン酸）、そのようなリンゴ酸やクエン酸などは、それらが細胞呼吸で機能し、細胞の健康の指標として役立つことができる多くの生物学的システムの適切な機能に重要です。食品中に、有機酸の含有量は、酸味又は「酸」味をもたらす増加SCCAレベルと、味に大きな影響を与えることができます。このため、有機酸濃度の迅速な分析のための方法は、食品及び飲料産業に特に重要です。しかし、残念ながら、SCCAの定量化のために使用されるほとんどの方法は、高価で、クロマトグラフィーおよび/または質量分析解析に続いて、危険な試薬を用いたサンプルの誘導体化を必要とする時間のかかるプロトコルに依存しています。この方法は、組織の検出および定量化のための別の方法を詳述しますフリーゾーンキャピラリー電気泳動（CZE）を用いて植物材料と食品試料からANIC酸は、単に、キャピラリー電気泳動（CE）と呼ばれます。 CZEは、検出の下限（0.005ミリグラム/ ml）でSCCAsを測定するための費用対効果の高い方法を提供します。この記事では、植物試料からSCCAsの抽出と定量化について詳しく説明します。提供される方法は、コーヒー豆からSCCAsの測定に焦点を当てているが、提供される方法は、複数の植物をベースとする食品材料に適用することができます。

概要

カルボン酸は、1つ以上の末端カルボキシル官能基を含む有機化合物であり、それぞれが1つ以上の炭素(R-C[O]OH)を含むR基に結合しています。炭素を1〜6個含む短鎖低分子量カルボン酸(短鎖カルボン酸、SCCA)は、細胞呼吸の必須成分であり、細胞の成長と発生に必要ないくつかの生化学的経路で機能します。SCCAは、細胞代謝1、細胞シグナル伝達2、および環境に対する生物の応答(抗菌薬3など)において重要な役割を果たします。このため、SCCAは、細胞代謝、植物のストレス応答4,5、および果実の品質6,7の混乱の有用な指標として役立つ可能性があります。これまで、SCCAは主に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)やガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)などのクロマトグラフィー技術によって定量されてきました。これらの方法は、非常に低い検出限界を達成することができますが、高価であり、腐食性試薬および/または毒性試薬を使用した標的SCCAの誘導体化が必要であり、GCまたはHPLCでの長時間の分離ランが含まれます。このため、有機酸を定量するために、サンプルの誘導体化を必要としない遊離帯状キャピラリー電気泳動(CZE)を使用することへの関心が着実に高まっています8。

Free zonal Capillary Electrophoresis(CZE)は、理論段数が多く、速度が速く、比較的使いやすいことから、陰イオン、陽イオン、アミノ酸、炭水化物、短鎖カルボン酸(SCCA)の定量(特に品質管理目的)の分析方法として、GC-MSと高圧液体クロマトグラフィーの両方にますます取って代わるクロマトグラフィー分離法です8,9,10.SCCAを含む低分子のCZEベースの分離は、2つの主要な原理に基づいています:キャピラリーを満たすバッファー全体に確立された電場での荷電イオンの電気泳動運動。そして、毛細血管の一方の端からもう一方の端へ、一般的には負極に向かって、バッファーシステム全体の電気浸透圧運動。このシステムでは、小分子はさまざまな速度で負極に向かって移動し、各分子の速度は分子の正味電荷と分子質量の比によって決定されます。このシステム内の個々の分子の動きは、分子の電荷状態と電気浸透流の全体的な速度(それ自体がキャピラリーを満たすために使用されるバッファーのイオン含有量に基づく)に依存するため、バッファーのpHとイオン組成は、CZEを使用して分子を効率的に分離できる程度に大きく影響します。このため、SCCAは電荷対質量比が比較的高いため、CZEベースの分離の理想的なターゲットです。CZEを用いて分離された代謝物は、UV吸光度、スペクトル吸光度(通常はフォトダイオードアレイ[PDA]を使用して実施)、および/または質量分析法(CE-MSまたはCE-MS/MS)8を含むさまざまな方法を使用して検出できます。CZEが提供する分離および検出方法の多様性により、CZEは非常に柔軟で適応性の高い手法となっています。このため、CZEは、食品の安全性と品質11,12、医薬品研究13、および環境モニタリング13,14の分野で、標準的な分析方法としてますます適用されています。

キャピラリー電気泳動は、ほぼ20年間、短鎖カルボン酸の検出と定量に使用されてきました13。CZE分析の分解能(特に荷電した低分子)、短い実行時間、およびサンプルあたりの低コストにより、CZEはSCCAの分離および定量に理想的な手法です13。この方法は、CZEを利用して植物組織からの有機酸の濃度を測定するためのプロトコルを提供します。このプロトコルを成功裏に実施することで、二次発酵処理後のコーヒー種子中の有機酸レベルの変化を測定するためのサンプルデータが生成されました。このプロトコルでは、CZEベースのSCCA分離の重要なステップと一般的なエラーを詳しく説明し、このプロトコルを成功裏に適用して追加の植物組織中のSCCAを定量する方法について説明しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1.試料の調製

  1. 短鎖カルボン酸（SCCA）抽出のためのサンプルを組み立てます。十分なサンプルが処理後に残ることを保証するために、一度にコーヒー種子の1.0グラムを準備します。
    1. 試料を粉砕工程に先立って凍結させた場合には、凍結/解凍の損傷およびサンプルの酸化を防止するために、処理全体凍結組織を維持します。研削に必要なだけのように冷凍庫またはサブゼロストレージからサンプルを削除します。
    2. Flashは研削サンプリングする直前に液体窒素中で新鮮なサンプルを凍結します。液体窒素で予め充填されたモルタルでそれらを置くことによって、サンプル処理、フラッシュ凍結サンプルを最小化します。
    3. すぐに生成、またはフラッシュ-20ºCで液体窒素とストア内の凍結や分析まで-80ºC以下の液体試料を分析します。分析の前に、ストレージから凍結試料を除去し、解凍することができます。液体試料の場合の処理​​のために（3.5）に進みます。
  2. アプロを着用液体窒素を使用する前に（安全眼鏡、手袋、白衣を含む）個人用保護具をpriate。
  3. セラミック乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で均一に微粉末（ すなわち、均一な粒子サイズの）にトリプルグラインド組織サンプル。
    注：均一な粒子サイズを達成するSCCA抽出効率を最大化するために不可欠です。
    1. モルタルを予め冷やし、試料を添加する前に、液体窒素で乳棒。サンプルが追加される液体窒素の小容量で満たされたモルタルを保管してください。
    2. 取鍋を使用して、サンプルを完全に水没するモルタルに十分な液体窒素を追加します。
    3. 液体窒素に、そのような葉や焙煎したコーヒーなどの簡単グラウンドサンプルを、追加して、円形の研削運動を使用してつぶします。液体窒素レベルは、それがかろうじてサンプルをカバーポイントまで減少したときに、サンプルを粉砕し始めます。
    4. このような、サンプルを粉砕するのは難しい追加sの生のコーヒー種子、液体窒素に、研削前に（液体窒素激しく沸騰を停止するまで、または）それらは10から30秒間フリーズすることができます。垂直破砕の動きを使用して、より小さな断片に組織を破壊し、その後、円形研削運動を使用して粉砕し、完全な組織。
    5. サンプルは3回の合計を接地されるように、手順を繰り返し、2倍1.3.2-1.3.4。一般的に、研削の3連続ラウンドは小麦粉様のコンシステンシーを有する粉末にサンプルを削減します。
    6. 粉状の稠度が達成されない場合、手順を繰り返し1.3.2-1.3.4試料が均一小さい粒径の粉末に還元されるまで（抽出効率は、粒子サイズに反比例します）。
  4. ガラスバイアルまたは1.5ml微量遠心管に粉末を転送します。すぐに粉砕後、下流の処理を開始します（推奨）、またはサンプルまで-80ºCで保存サンプルは、抽出のための準備ができています。
    1. サンプルは、前に保存されなければならない場合分析は、500mgのアリコート（または液体試料のための500μlのアリコート）とストレージのための複数の管の中の分割にサンプルを分割します。これらは、試料組成を変化させ、負の将来のサンプル測定値に影響を与える可能性があるとして、繰り返し凍結/解凍サイクルにサンプルをかけることは避けてください。

2.有機酸標準品

  1. 関心のSCCAsのための本格的な基準を組み立てます。これらは、SCCA濃度を決定する際に使用するための外部および内部標準溶液を作成するために使用されます。コーヒー試料を内部標準として関心とアジピン酸の酸としてクエン酸、リンゴ酸、酢酸、および乳酸が含まれるため。
    1. 選択された内部標準は、試料中の天然に見出され、サンプルプロファイルにおける他のピークとの標準がないことを共溶出されていないことを確認してください確認してください。
    2. （instのを実行するためのセクション4を参照してください興味のある各SCCAのための標準曲線を実行し、各SCCAのための線形応答範囲を決定ructions）。試料中で測定される各SCCAのための標準曲線を実行することを確認します。
      注：標準曲線は、緩衝液またはサンプルの背景がアッセイされるいずれかで実行することができます。第二の場合（「標準添加」）において、それぞれの標準曲線の点のピーク面積の値は、サンプルのバックグラウンドを取り除く減算することによって決定されます。
    3. 事前ラベルSCCA酸名、濃度、およびアッセイの日に必要なすべてのチューブやガラス製品。
  2. 標準の準備中に精度を確保するために、メスフラスコを用いて、既知濃度（10 mg / mlで）で各標準のためのストック溶液を準備します。
    1. ストック溶液のための所望の濃度を達成するために、超純水（18.2MΩ）で固体SCCA標準（クエン酸及びリンゴ酸）を溶解させます。
      1. 10 mlの容量フラスコに標準100mgを添加することによっての10mg / mlのストック溶液を作成します。 Dに超純水で10mlラインにメスフラスコを埋めます酸をissolve。
      2. 酸標準のより低い濃度を作成するか、または静かに溶液中に、アジピン酸のような、難溶解SCCA標準を駆動するためにフラスコを加熱します。
    2. 所望の濃度を達成するために、超純水の液相酸標準（酢酸および乳酸）を希釈します。
      1. 超純水5mlでメスフラスコを事前に記入してください。フラスコに（ベンダーが提供酸濃度を用いて計算）を10mg / mlの溶液を調製するのに十分な酸を添加し、次いで10 mlの溶液の最終容量をもたらすために十分な水を加えます。
  3. キャップ裏地ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）と、清浄な15mLのガラス管に各原液を転送し、プラスチックパラフィンフィルムで密封します。ストック溶液は、1週間4ºCで密閉管中で保存することができます。
    1. 原液がprepar後に冷蔵された場合SCCA基準は使用前に溶液から沈殿していないことを確認してくださいエーション。ドライブは、穏やかな加熱により溶液中に戻って沈殿します。
  4. SCCA抽出液を準備します。試料中の検出のために十分な濃度（0.05 mg / mlで）の内部標準が含まれます。すべてのサンプルを取り出すための十分な解決策を準備します。
    1. 超純水中の0.05 mg / mlでの内部標準ストック溶液を希釈することによってSCCA抽出溶液50mlを調製します。水49.75ミリリットルに内部標準ストック溶液（10mg / ml）250μlのを追加します。
    2. 抽出液を希釈する必要がある場合は、最終濃度が定量限界内に入るように、（検出可能なを与えるではなく、過飽和、ピーク、下記5.2.2を参照）、抽出液中の内部標準濃度を調整します希釈後のCEシステム（0.05 mg / mlで）。
    3. （ すなわち、各実験シリーズのために）抽出の各シリーズの新鮮な抽出溶液を準備します。
  5. 標準曲線のサンプルを準備します少なくとも5点の最小値を使用して、関心のSCCAsのための（適切な希釈系列）、。用いる標準曲線濃度が所定のSCCAための線形応答範囲にあることが必要であり、試料中の予想されるSCCA濃度にまたがります。
    1. サンプル中の内部標準の定量化を可能にするために、標準曲線のソリューションの選択された内部標準が含まれます。内部標準ピークの同定を補助し、抽出効率（項6）を計算するために使用されます。
    2. 上記の測定された濃度に各SCCAを希釈（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg / mlで;、上記の2.4.2を参照）を超純水を使用して、新しいマイクロ遠心チューブに（各濃度/標準曲線ポイントに1つ）。各標準曲線濃度ポイントの溶液1mlを準備します。各濃度点はすべての4つの酸標準と正しい濃度の内部標準が含まれていることを確認してください。
    3. 各セットのための新しい標準カーブポイントを準備します試料のキャピラリー電気泳動システム上で実行されます。標的組織（セクション3）からSCCAsの抽出を次のように発生するであろう、分析まで4ºCで標準曲線SCCAサンプルを保持します。

3.有機酸抽出

  1. 各サンプルについて少なくとも1つのチューブを調製する前標識試料管は、抽出されます。
  2. ストレージから抽出するサンプルを削除し、抽出のための材料を計量しながら氷の上に置きます。
  3. SCCA抽出のために試料100mgを秤量。
    1. 各サンプルを計量した後、清浄な1.5ミリリットルのマイクロチューブに組織を移します。変動性を低減することができるように、ターゲット質量に近いサンプルの量を測定します。
    2. 検出されたSCCAsの量は、試料質量（以下、6.5.2を参照）を用いて正規化されるように、測定した各サンプルの質量を追跡します。
  4. すべてのサンプルを計量した後、抽出溶液の1ミリリットル（ウォートを追加R +試料管のそれぞれにステップ2.4から内部標準混合物）。 （100±5 mgの組織のための1ミリリットル、この場合には）すべての抽出で同じ組織塊に抽出溶液の比率を保持します。 10秒間ボルテックスでよく混ぜます。
  5. サンプルは、1時間室温で静置します。この時間の間に、ステップ3.4のように各チューブを15分毎に混ぜます。
  6. 抽出の1時間後、サンプルを最後に1回混ぜると微量にサンプルチューブを移します。 4℃で遠心分離標本は、10分間10,000×gでは、固体材料（細胞壁、粒子状物質など ）を沈殿させました。
    1. 液体試料を処理する場合、簡単に遠心操作を混ぜ、内部標準の適切な濃度を追加します。遠心分離の後、固体試料からの抽出物と同一の液体試料を扱います。
    2. 彼らが実行して検出キット（ステップ4.6）でバッファまたはEMPある緩衝系のpH範囲と互換性があることを確認するためにサンプルのpHをチェックloyed。試料の体積は、通常、非常に小さいように、pHをpH試験紙を使用してモニターすることができます。
  7. 注射器に取り付けられたディスクフィルター（3.8）を使用して、サンプルをフィルタリングするために準備します。
    注：各フィルタが正しく上清を転送する前に、注射器に接続されていることを保証することによって、サンプルの損失を防ぎます。 （標準曲線のサンプルを含む）、分析される各サンプルのディスクフィルターを装備した1注射器を準備します。
  8. サンプルを遠心分離し、シリンジフィルターを製造した後、0.2μmシリンジフィルターを備えた3 mlシリンジに各試料からの上清を移します。各サンプルの新しいフィルタと注射器を使用してください。 CEシステム上で実行する前に、標準曲線サンプルおよびバッファコントロールを含むすべてのサンプルを、フィルター。
  9. きれいなマイクロチューブに直接サンプルをフィルタリングします。ろ過後、ろ液を含むチューブを閉じ、シリンジ/フィルタ装置を廃棄します。
  10. すぐにフィルタリングのサンプルを配置SCCA検出のためのCEシステムへ。 4℃で一晩またはストアサンプル。サンプルを一晩保存する場合、ガス交換およびサンプル蒸発を防ぐためにプラスチックパラフィンフィルムで管を密封します。
    1. サンプルは、フィルタリング後の日よりも長く保存されなければならない場合、-20ºCで液体窒素や凍結でフラッシュ凍結を抽出します。解凍後、しかし、（ステップ3.6のように）必要に応じて、各サンプルは、沈殿物の形成及びフィルタのために検討されていることを確認してください。

4. SCCA検出ファイル名を指定して実行を設定

  1. programming-と制御ソフトウェア固有の詳細については、CEのユーザマニュアルを参照してください。
  2. SCCAの検出のためにキャピラリー電気泳動（CE）サンプルバイアルを準備します。清潔、および欠陥のない、バイアルを適切に標識されていることを確認します。
  3. 使用前にCEバイアルのキャップを洗浄し、乾燥させます。
    1. 超純水に浸漬し、それらを一晩浸漬させることにより、キャップを洗ってください。キャップを浸漬した後、ソーク捨てます解をると、超純水で2回以上のキャップをすすぎます。
    2. 転送は、リントフリーティッシュを敷いたきれいな乾燥表面にキャップをすすぎ、空気乾燥にそれらを可能にします。キャップは圧力の失敗を回避するために、使用前に完全に乾燥していることを確認します。
  4. 誤ってバイアルの首に試料をはねないように注意しながら、各CEバイアルにサンプルの1ミリリットルを転送します。転送後、各バイアルにCEキャップを置きます。
    1. 超純水を使用して、CEバイアルに直接：100希釈が必要な場合は、コーヒー種子サンプル1:10 1に希釈します。 1より大きい希釈液の場合：100、ピペッティングエラーを回避するために、中間希釈を作成します。
  5. CEバイアルにステップ2.5から標準曲線液（1.0ミリリットル）を転送することにより、各標準曲線のポイントの1つのバイアルを準備します。転送後、各チューブをキャップ。
  6. ペレットT 90 mlの超純水を含有するビーカーにNaOHを0.04gのを添加して可能にすることにより、水酸化ナトリウム（NaOH）の0.1 M溶液を調製しますO溶かします。 100ミリリットルのメスフラスコに0.1 M NaOH溶液を移し、100mlに全量を。
  7. クリーンCEバイアルとキャップに0.1 M NaOH溶液の1ミリリットルを追加します。
  8. CEシステム上で実行するためのサンプルのバッチごとのCEバッファバイアルを準備します。分離キットが入手可能であるか、またはカスタム・バッファは13を使用することができます。
    1. 緩衝溶液とキャップを開始する1ミリリットルで1バイアルを準備します。
    2. 1ミリリットルの緩衝液とキャップを実行しているのそれぞれに3バイアルを準備します。サンプルおよび標準曲線の点の各バッチの前に、またはいずれか早い方35サンプル、後にランニングバッファーを交換してください。
    3. 超純水1mlで3つの追加のバイアルを記入し、各バイアルをキャップ。
    4. キャップ付き1空の「廃棄物」バイアルを準備します。
  9. ステップ4.8で説明したバイアルを準備した後、キャピラリー電気泳動sysのバッファトレイにバッファや水、並びに（ステップ4.8.2-5から）廃棄物のバイアルを含むバイアルをロードテム、製造業者の使用説明書15あたりとして。慎重にオートサンプラーのプログラミングのための各バイアルの位置に注意してください。
  10. 標準曲線の点と、製造業者の説明書に記載されるように、入口サンプルトレイにアッセイされるサンプルを含むバイアルを含むバイアルをロードします。 （手順以下の4.11.1を参照のこと）オートサンプラープログラミングに各バイアルの位置に注意してください。
  11. コンディショニングと試料の分離方法を準備し（これらのためのプログラムは、それぞれ、 表1および2に提供されている）、および命令を操作する楽器ごとにサンプルシーケンスファイルを作成します。 表2に詳述分離方法を使用します。0.2分間イニシエータ（20 PSI）でカラムをすすぎます。 （0.09分間カラムにサンプル（0.5 PSI）を注入し、12分間、20キロボルトで別々の試料は、0.5分間のNaOH（20 PSI）でリンスし、0.5分間加速器（20 PSI）でリンスし、そして最後に水で洗い流し20 psi）で0.5分間。
    1. USICE制御ソフトウェアをngの（ すなわち、ワークリストを、サンプルが分析される順序を詳細リストファイル、及び方法は、各サンプルを分離するために使用される）は、サンプル実行シーケンスを記述する「配列」スプレッドシート・インタフェースを使用して。スプレッドシート上の各行は、サンプルの実行に対応し、1つのデータファイルを生成します。
      1. シーケンスファイルを書き込むときに、サンプルがサンプリングトレイに正しい位置を使用して同定されていることを確認してください。各データファイルは、以前のファイルを上書きするからソフトウェアを防止するために、固有の名前を持っていることを確認してください。試料分離方法を含む配列の実行前に独立したシーケンスとしてプログラムCEキャピラリーコンディショニングが実行されます。
    2. SCCAサンプルが続く標準曲線のソリューションを使用して実行サンプルシーケンスを、開始し、標準曲線のソリューションのセカンドランで終了。これは、サンプルの分析中に生じる任意の信号損失の程度の計算を可能にします。

    figure-protocol-1
    表 1： キャピラリー電気泳動Aを介して短鎖カルボン酸を分離するための毛細管を調製するために使用されるコンディショニング方法プログラム。

    figure-protocol-2
    表 2：キャピラリー電気泳動Aを介して短鎖カルボン酸を分析するために使用される分離方法のプログラム。

    5. SCCA検出を実行し実行とデータ収集

    1. キャピラリーコンディショニングの実行を開始します。カラムはサンプル分離のための準備が整う前に、キャピラリーを2回または3回を調整するように期待しています。カラムコンディショニングは、 表1に記載したように、簡潔に述べる。行う1分間、0.1MのNaOH（20 PSI）でカラムを洗い流し、水（20 PSI）でリンスされるべきであるために1分、10分、30キロボルトで0.5分、別々のアクセラレータのアクセラレータ（20 PSI）ですすい0.5分間イニシエータ（20 PSI）ですすぎ0.5分間、0.1MのNaOH（20 PSI）でカラムを洗浄し、最後に0.5分間水（20 PSI）でカラムをすすぎます。
      1. 各サンプルのシーケンスの実行に先立ってキャピラリーを調整。分離電圧は、実行を通して一定で保持し、フォトダイオードアレイトレース上の平らなベースラインを観察することによって、適切な空調を実現。
    2. コンディショニングの後、（ すなわち、クリック）ソフトウェアに「コントロール」メニューを開いて選択することにより、試料分離を開始し、「実行順序を。」適切な分離を確保するために、フォトダイオードアレイ（PDA）のトレースを監視します。
      1. 最初のトレースを観察し、それがフラットなベースラインときれいに解決さ（ベースラインの解像度）、個々の酸のピークを持っていることを確認してください。オーバーロードされたサンプルは、長いピーク尾、またはピークテーリングが表示され、（ 図1）に希釈する必要があります。

    figure-protocol-3
    図1：PDAの比較は、過負荷サンプルを強調トレース分析物濃度が増加するにつれて、個々のピークの形状が非対称になることを開始することができます。 （A）は0.05mg / mlで、酢酸は、明確に定義された、左右対称のピークを示します。 （b）は、0.07 mg / mlで、および（C）0.10 mg / mlで、ピークテール形（矢印）への酢酸の濃度が増加します。このピークテーリングは、試料が過負荷になっていることをよく示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    1. シーケンスの実行の終了時に、CE分析ソフトウェアの時にデータファイル1を開いて、ピークを統合します。
      1. サンプルピークを統合します。
        1. 最初のファイルを開きます。ランの最初の3分を排除する自動積分ステップを設定する（ 表1に記載した通りであり、電圧、したがって、カラム流量の方向は、反転されます）。同じメニューでは、トレース内のバックグラウンドノイズから酸ピークを分離し、選択性の適度に高いレベルを提供するために、50台の最小ピーク幅と100単位（またはメーカーのデフォルト設定）のピーク面積をピーク選択基準を設定します。
      2. 手動で適切なピーク積分を確保するために、各PDAトレースのピークの境界とベースラインを確認してください。不適切に統合されたピーク（ すなわち、自動化されたソフトウェアによって二つの別々のピークとして統合されている若干の非対称SSCAピーク）は手動で再統合する必要があります。
    2. 統合後は、面積率のレポートを表示し、ハイライト表示して、面積パーセントレポートをコピーし、別のスプレッドシートに貼り付けます。フルランピークreporを構築するために、各サンプルについて繰り返し単一のピークを表す各行とトン（分離がうまく機能している場合、すなわち 、それぞれのピークが単一の化合物が含まれている必要があります）。

    6.データ解析

    1. （5.4）で構築したスプレッドシートを使用して、分析用のデータを準備します。内部標準を含む、標準曲線の点のそれぞれに対して酸標準を標識することにより、分析を開始します。
    2. そのサンプル中の内部標準の保持時間によって、試料中の各ピークの保持時間を分割して各ピークの保持指標を計算します。各試料中の目的のピークを同定するために、得られた保持指標によって設定されたデータをソートします。
    3. 関心のある各酸のピークを識別した後、外部標準曲線ポイントを使用して、各酸のための標準曲線を構築します。
      1. SCCA基準の各濃度についてピーク面積を決定することによって、各SCCA規格の規格（濃度）曲線を作成し、XAの濃度をプロットy軸上のピーク面積対XIS。各SCCA標準曲線のための線形回帰をプロットし、スロープ式（Y = MX + B）を定義します。
      2. 定量化が最も正確に標準曲線の直線範囲内で行われているような線形回帰のR 2値は0.90以上であることを確認してください。
    4. ピーク面積（上記6.3.2で計算される）標準曲線の線形回帰ラインの傾きの方程式を用いて、試料中の所定のSCCAための酸濃度を計算します。簡単に言えば、その酸の標準曲線の回帰直線の傾きによって与えられた酸のための観測されたピーク面積を分割します。
      1. 内部標準（ステップ6.5）を使用して、処理中のサンプル損失のためのステップ6.4で算出された生の濃度値を修正してください。
    5. 内部標準を使用して、各サンプルの補正係数を算出します。
      1. 内部標準（ すなわち、KNOの実際の濃度を割りWN量は、試料中の内部標準（ すなわち、量は、内部標準の標準曲線の傾きの式を用いて計算した）の観測値によって）、実験の開始時に添加しました。この補正係数によって、試料中の各SCCAの生の濃度値を乗算します。
      2. 内部標準は、サンプルの質量の変動を補正するために、抽出に用いた試料の質量SCCA濃度補正分けます。この計算は、次に、所定の試験（ミリグラム/ mgで、MG / G、G / G 等の適切な単位に変換することができ、試料の質量あたりの分析物の量（この例では、MGグラウンドコーヒー当たりミリグラムSCCA）を得）。
    6. （[液体試料用] [固体や液体試料用]質量または体積のいずれかに正規化）SCCA濃度を算出した後、実験デザインや興味の質問の要求に従って統計分析のために、これらの値を使用します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

このプロトコルは、正常緑色コーヒー種子のSCCA量の種子処理の影響を測定するために利用されています。この実験では、6の処置であった： ロイコノストック飽和微生物懸濁液は、歪みの増殖培地中GCP674（1）水にGCP674微生物の水性懸濁液（2）、酢酸および乳酸の水溶液（0.15と0.4 pseudomesenteroides MG /）は、それぞれML（3）使用済みのM1増殖培地処理（4）をdH 2 O水（5）、および未処理対照（種子に添加していない物質）（6）。処置を適用し、24時間発酵させました。 4つの独立した反復は、各治療のために評価しました。分析は、内部標準としてアジピン酸を用いてクエン（C）、リンゴ酸（M）、酢酸（A）および乳酸（L）酸レベルを行いました。

各SCCAと内部標準の場合、標準曲線はトンに及びます彼は、濃度の範囲は、生成されたコーヒーサンプル（5、10、20、40、60、...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

任意の分析技術と同様に、大幅に生成されたデータの品質と信頼性に影響を与えることができるいくつかの重要な要因があります。まず、凍結/融解サイクルの最小値と、効率的にサンプルを処理することが重要です。凍結融解の繰り返しは、処理や分析の前に、試料の化学組成を妥協することができます。第二に、一貫して均等にすべてのサンプルにこのプロトコルのステップを適用することが重要です。一貫性のない試料調製および取り扱いに起因する技術的エラーが大幅に生成されたデータの品質に影響を与え、そしてSCCA測定における増加 "ノイズ"をもたらすことができます。例えば、サンプル後粉砕の粒子サイズは、SCCA抽出の速度と効率に影響を与えます。サンプルを横切って抽出効率を維持し、サンプル間のばらつきを減らすのを助けるように試料は、均一な粒子サイズに粉砕されることを保証することが重要です。シムilarly、標準溶液、試料質量の正確な測定、及び抽出時間を注意深く監視（および正規化）の調製の間を正確に測定し、ピペットは、より均一なデータの生成をもたらします。慎重に、対策を正規化し、これらの各パラメータを記録するために時間を取ることは、データの信頼性を確保し、発...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、このプロジェクトがJ.M. Smucker社から財政的に支援を受けたことに感謝したいと思います。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
セラミックモアターと乳棒クアーズテック60310
ベックマン・コールター P/ACE MDQ CEシステムベックマン・コールター各種
ガラスサンプルバイアルフィッシャー社033917D
1.5 ml 微量遠心チューブ フィッシャー株式会社02-681-5
LC/MSグレードの水フィッシャー社W6-1ミリQ水 (18.2 M&オメガ;·cm)も許容されます
15 mlガラス管/テフロン裏地付きキャップ フィッシャー株式会社14-93331A
パラフィルム エム・フィッシャー13-374-12
CElixirOA検出キット pH 5.4 MicroSolv06100-5.4
BD Safety-Lokシリンジフィッシャー株式会社14-829-32
17 mm ターゲット シリンジ フィルター、PTFEFisher Inc.
32 Karat, V. 8.0 制御ソフトウェアベックマン・コールター285512
キャピラリー電気泳動 (CE) サンプルバイアル ベックマン・コールター144980CE
バイアル用キャップ ベックマン・コールター144648
液体窒素N/AN/A液体窒素は、ほとんどの施設サービスから入手可能です
3377154

参考文献

  1. Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
  2. Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
  3. Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
  4. Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
  5. López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
  6. Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
  7. Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
  8. Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
  9. Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
  10. Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
  11. Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
  12. Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
  13. Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384(2008).
  14. Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
  15. ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
  16. Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
  17. Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

SCCA
植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。